L'immunisation avec le immunodominant Helicobacter suis uréase sous-unité B induit une protection partielle contre l'infection par H. suis dans une souris model

immunisation avec le immunodominant Helicobacter suis
uréase sous-unité B induit une protection partielle contre H. suis
infection dans un modèle de souris
Résumé
Helicobacter
(H.
) suis
est un porc et pathogène gastrique humaine. Des études antérieures chez les souris ont montré qu'une infection par H. suis
ne provoque pas une immunité protectrice, alors que l'immunisation avec H. suis
lysat de cellules entières (lysat) protège contre une infection expérimentale suivante. Par conséquent, l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de H. Suis
protéines a été réalisée, suivie par immunotransfert avec un pool de sérums provenant de H. Suis
- infecté des souris ou des souris immunisées avec lysat. réactivité Faible contre H. Suis
protéines a été observée dans le sérum post-infection. Les sérums de souris immunisées lysat, cependant, a montré une immunoréactivité contre un total de 19 spots protéiques qui ont été identifiés par LC-MS /MS. La H. suis sous-unité
uréase B (UreB) ont montré une réactivité plus marquée contre des sérums de souris lysat immunisées et n'a pas été détecté avec des sérums de souris infectées. Aucun des sérums mis en commun détecté H. suis
protéine A d'activation des neutrophiles (NapA). L'efficacité protectrice de la vaccination intranasale de souris BALB /c avec H. suis
UreB et NapA, à la fois exprimée de manière recombinante dans Escherichia coli
(rUreB et rNapA, respectivement) a été comparée à celle de H. suis
lysat. Tous les vaccins contenaient choleratoxine comme adjuvant. Immunisation de souris avec rUreB et le lysat a induit une réduction significative de H. suis
colonisation par rapport à H. suis non vaccinés contrôles infectés par
, alors que rNapA n'a eu aucun effet protecteur significatif. Présentation
(H. de
) de Helicobacter le suis de doute, une combinaison de réponses locales Th1 et Th17, complétées par des réponses d'anticorps jouent un rôle dans l'immunité protectrice contre H. Suis
infections.
est un agent pathogène de la propagation dans le monde entier, colonisant principalement les porcs. Une infection par cette bactérie Gram négatif a été associée à des ulcères de la muqueuse non glandulaire gastrique [1, 2] et provoque une gastrite et une diminution du gain de poids quotidien [3] chez les porcs. H. suis
est aussi l'espèce la plus répandue non-Helicobacter pylori Helicobacter
chez les humains souffrant de troubles gastriques [2] et les porcs peuvent servir de source de H. suis
infections pour les humains [2, 4 ]. Contrôle de H.
suis infections par un traitement à base d'antibiotiques est déconseillée en partie en raison d'un risque accru de développer une résistance acquise aux antimicrobiens chez H. Suis
souches et dans les bactéries appartenant à la microflore porcine normale [5]. L'immunisation contre H. suis
peut donc représenter une alternative intéressante. Jusqu'à présent, cependant, peu d'études ont porté sur la vaccination contre cette porcine et pathogène zoonotique.
Études antérieures dans un modèle de souris ont montré qu'une H. suis
infection ne se traduit pas par une immunité protectrice, alors que la vaccination sur la base homologue (H. suis
) ou hétérologue (H.
bizzozeronii ou H. cynogastricus
) lysat de cellules entières induit une réduction ou même la disparition complète de la colonisation gastrique avec H.
suis [6]. Cependant, l'utilisation de ce type de vaccins présente des inconvénients, notamment la laborieuse culture in vitro de H. suis
, ce qui entraîne des difficultés pour produire l'antigène suffisante. En outre, les lysats de cellules entières peuvent contenir des antigènes et des antigènes protecteurs supprimant la protection [7]. Un vaccin sous-unitaire efficace pourrait être une alternative utile pour le contrôle de H. Suis
infections. Immunoproteomics est une approche appropriée pour l'identification rapide des protéines candidates pour la vaccination et a été appliquée pour étudier et développer des vaccins sous-unitaires pour un large éventail d'agents pathogènes [8].
Il a été le but de la présente étude pour sélectionner H. suis
protéines qui pourraient induire une immunité protectrice contre H. suis
infection. Par conséquent, H. Suis
protéines reconnues par les sérums de souris immunisées avec H. suis ce membre lysat de cellules entières et protégées contre l'infection ont été identifiés en utilisant une électrophorèse bidimensionnelle (2D) sur gel suivie d'un immunotransfert et LC-MS /MME. Sérums de
Suis H. - souris infectées ont également été inclus, étant donné qu'une infection ne donne pas lieu à la protection. Sur la base de cette analyse, l'immunoréactif H. suis
sous-unité B de l'uréase (UreB) a été choisi pour des tests in vivo. En tant que témoin, nous avons inclus le H.
suis protéine d'activation des neutrophiles A (NapA), qui a été décrit précédemment comme un facteur possible de virulence [9], mais n'a pas été reconnu par les sérums de souris immunisées avec lysat de cellules entières. Par la suite, l'efficacité protectrice contre une infection par H. suis
des deux vaccins sous-unitaires a été évaluée et comparée à celle de H. suis
lysat dans un modèle de souris standard.
Matériaux et procédés Souche bactérienne

Dans toutes les expériences, H. suis
souche 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) a été utilisé. Cette souche a été isolée de la muqueuse gastrique de porc selon le procédé décrit par Baele et al. [10] Une semaine avant le début des expériences, cinq semaines d'âge spécifique des agents pathogènes. Les animaux de
souris BALB /c -free féminins ont été obtenus à partir d'un éleveur agréé (HARLAN, Horst, Pays-Bas). Les animaux ont été logés sur des copeaux de bois stérilisées en haut du filtre cages. Ils ont été nourris avec un régime commercial autoclavé (Teklad 2018S, HARLAN) et ont reçu de l'eau ad libitum
autoclavés. Toutes les expériences sur les animaux de laboratoire ont été approuvés par le soin et Comité d'éthique animale de la Faculté de médecine vétérinaire, Université de Gand
. Immunoproteomics de H. suis
bidimensionnelle électrophorèse sur gel (2D-PAGE)
HS5 a été cultivée comme décrit précédemment [11]. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation (5000 g
, 4 ° C pendant 10 min) et lavées quatre fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Total des protéines (protéines solubles et insolubles) ont été extraites en deux étapes en utilisant le Kit ReadyPrep ™ Extraction séquentielle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) selon les instructions du fabricant. Afin d'obtenir de bons résultats 2D-PAGE, les homogénats ont été traités avec des additifs appropriés (inhibiteur de protéase 5 mg de cocktail, 1 pl DNAse I, 1 ul RNAse A, 10 inhibiteurs de phosphatase ul PP2 et PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) ). Enfin, la concentration en protéine a été déterminée à l'aide de la protéine du RC DC Assay (Bio-Rad) et les protéines ont été stockées à -70 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Un total de 100 pg de protéines HS5 ont été réhydraté dans 200 pi de tampon de réhydratation (7M ureum, 2M thioureum, 2% de CHAPS, 0,2% de support ampholyte pH3-4, 100 mM de dithiothréitol (DTT) et le bleu de bromophénol). Des échantillons ont été absorbés passivement en un ReadyStrip (11 cm, pH 3 à pH 10, Bio-Rad) et la focalisation isoélectrique a été réalisée dans un Protean IEF chambre (Bio-Rad) tel que décrit précédemment [12]. Après focalisation isoélectrique, les bandes ont été équilibrées pendant 15 minutes dans 1,5% de DTT dans un tampon d'équilibration (50 mM Tris-HCl, pH 8,8 6M d'urée, 20% de glycerol, 2% de SDS) suivie d'une équilibration à 4% iodoacétamide dans un tampon d'équilibration. L'électrophorèse sur gel a été effectuée sur une TrisHCl SDS-PAGE 10% à l'aide 150V pendant 30 min, puis 200V pendant 1 h. Deux gels ont été exécutés en parallèle: l'un a été coloré avec Sypro® Ruby Protein Gel coloration (Bio-Rad) tandis que l'autre a été utilisé pour immunoblotting (voir Western blot décrit ci-dessous). Avant la coloration, les gels ont été fixés dans 10% de methanol, d'acide acétique à 7%. Après coloration, H. Suis
protéines ont été visualisées en utilisant le système d'imagerie VersaDoc (Bio-Rad) Trois piscines
sérum piscines de sérums de souris ont été utilisés dans cette étude:.

Les sérums de souris immunisées avec H. lysat suis
cellule entière (ci-après dénommé "souris lysat immunisées") (n
= 10). Ces animaux ont été inoculés par voie intranasale deux fois avec un intervalle de trois semaines avec 100 ug HS5 lysat + 5 ug de toxine cholérique (CT) (Liste biologique Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysat a été préparé comme décrit précédemment, mais sans filtration finale du surnageant [6]. Trois semaines après la dernière immunisation, du sang a été recueilli et les sérums ont été mis en commun. Ce protocole d'immunisation a été montré pour être (partiellement) de protection contre H. suis
défi [6] et l'effet protecteur a été confirmé ici dans un essai préliminaire (données non présentées).

Sera de H. suis
souris infecté par (ci-après dénommé «souris infectées») (n
= 10). Ces animaux ont été inoculés par voie intragastrique avec 200 bouillon ul Brucella à pH 5, contenant 10 ^{8 fraîchement préparés H.
suis bactéries [11]. Quatre semaines après l'infection, du sang a été recueilli et les sérums ont été mis en commun.}

Les sérums provenant des souris témoins négatifs (n = 10
). Ces animaux ont reçu HBSS intranasale deux fois avec un intervalle de trois semaines, suivie par inoculation intragastrique avec 200 bouillon ul Brucella à pH5 (4 semaines après la dernière vaccination factice). Après quatre semaines, le sang a été recueilli et les sérums ont été réunies.
Tous les sérums ont été conservés à -70 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
Western blot
Les protéines ont été électrotransfert à partir de gels sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad) tel que décrit précédemment [12]. Les membranes ont été bloquées dans 5% de lait écrémé dans du tampon phosphate salin (PBS) (tampon de blocage), mises en incubation pendant une nuit (ON) avec des sérums de souris dilués (1/100 dans un tampon de blocage) à la température ambiante (TA), on les rince dans du PBS avec 0,3% Tween-20 (tampon de lavage) et incubées pendant 1 h à température ambiante avec la chèvre stabilisée immunoglobuline anti-souris G (IgG) peroxydase de raifort (HRP) conjugué à (1/1000 dans le tampon de blocage, Pierce, Rockford, IL, USA). Après une étape de lavage dans un tampon de lavage, immunodétection des protéines a été réalisée par la détection de chimioluminescence amplifiée en utilisant Durée Supersignal Ouest Dura Extended Support (Pierce). modèles de protéines ont été scannés et numérisés à l'aide du système d'imagerie VersaDoc. Toutes les expériences sont réalisées en triple.
La digestion et l'identification des protéines dans le gel par spectrométrie de masse dans le gel
la digestion des protéines a été réalisée comme décrit par Cheung et al. [13]. Avant la spectrométrie de masse des peptides isolés ont été séparés sur une chromatographie en phase liquide U3000 nano-haute performance (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) comme décrit précédemment [14] Identification des peptides de. A été réalisée en utilisant un électrospray ionisation quadripolaire spectrométrie de masse à temps de vol (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) comme décrit précédemment [14]. L'analyse des données a été réalisée contre l'Helicobacter de la base de données de protéines à partir de NCBI (146 612 entrées) en utilisant le moteur de recherche interne Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, Londres, Royaume-Uni). Une recherche à tolérance d'erreur a été effectuée avec carbamidomethyl (C) comme une modification fixe. Carbamidomethyl (N-terminal) et l'oxydation (M) ont été définies comme des modifications variables. Peptide masse la tolérance de la tolérance et de la masse de fragment a été fixé à 0,35 et 0,45 Da Da, respectivement. Maximum deux miscleavages ont été autorisés. Les protéines ont été seulement considérés comme correctement annotée lorsque la signification était inférieure à 0,05 (p
< 0,05) et au moins un peptide passé les critères rouges gras requis de Mascot Daemon, ce qui indique qu'au moins un peptide avait rang 1 et une signification inférieure à 0,05.
unidimensionnelle électrophorèse sur gel (1D-PAGE) et transfert de Western de 1D-PAGE de 10 ug rUreB recombinant sous-unité H. suis
urease B (rUreB) a été réalisée comme décrit par Van Steendam et al. [12]. analyses Sera de préparation et de Western blot ont été réalisées comme décrit ci-dessus.
efficacité protectrice du recombinant H.
Suis protéines dans un modèle de souris
Préparation de UreB recombinant
Un fragment codant pour le H.
suis séquence UreB (GenBank locus tag HSUHS5_0285) a été amplifié par PCR en utilisant une polymérase Pwo avec l'activité de relecture (Roche, Mannheim, Allemagne) à partir de l'ADN de HS5 (amorce sens: 5'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 '; amorce antisens: 5'CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3') et clone dans le vecteur d'expression de la protéine pET-24d. Le rUreB a été exprimé dans E. coli de la souche BL21 (DE3). Les cellules ont été lysées par sonication (5 fois pendant 30 secondes) dans un tampon contenant 50 mM Na.PO 4 pH 7, NaCl 0,5 M, 1 M de DTT, 1% de Triton X-100 et 1 mM de PMSF. Après centrifugation (4 ° C, 20 000 g pendant 30 min
) rUreB a été purifié à partir de la fraction soluble en utilisant une Chromatographie d'affinité Ni dans un tampon constitué de NaCl 1 M, 50 mM de PBS, 1% de Triton X-100, 250 mM imidazole et 10% de glycérol (Son GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suède), suivie par filtration sur gel sur un Superdex ™ 200 HR 16/60 colonne (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Après purification, rUreB a été analysé par SDS-PAGE et analyse Western blot utilisant des anticorps anti-hexahistidine-tag anticorps monoclonal de souris (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonie). Le détergent Triton X-100 a été retiré du rUreB purifié à l'aide de détergents Pierce colonnes Spin Removal (Pierce) selon les instructions du fabricant. La concentration en protéine a été déterminée avec la protéine du RC DC Assay (Bio-Rad) de. Préparation recombinante NapA The protéine a été exprimée dans le système d'expression de E. coli avec la technologie Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) comme suit. Un fragment codant pour la séquence H. suis
d'activation des neutrophiles de la protéine A (NapA) (GenBank locus marqueur HSUHS5_0014) a été amplifié par PCR en utilisant une polymerase Pwo avec l'activité de correction d'épreuves (Roche) à partir de l'ADN de HS5 (amorce sens: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; amorce inverse: 5'TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') et clone dans le ™ /TEV /D-TOPO vecteur pENTR et transféré dans le vecteur de destination pDEST17 ™. Le plasmide pDEST17-NAPA sélectionné a été transformé en cellules BL21-AI ™ de E. coli
et ensuite cultivées à 37 ° C jusqu'à une DO 600 de 0,6 à 1,0 dans du bouillon de Luria supplémenté avec 50 pg /ml de carbénicilline. Recombinant H.
suis NapA (rNapA) expression a été induite en ajoutant 0,2% arabinose L-. Après 4 heures d'incubation à 37 ° C, les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du tampon de lyse: 50 mM Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,2 mg /ml de lysozyme, 20 pg /ml d'ADNase, un inhibiteur de la protéase 1 mM (Sigma) et 1 mM MgCl 2. Les cellules ont été lysées par sonication (5 fois pendant 30 s). les corps de débris cellulaires et d'inclusion ont été isolés par centrifugation à 4 ° C (20 000 g pendant 30 min
). Les corps d'inclusion ont été ensuite lavées deux fois selon le protocole suivant: le culot a été remis en suspension dans du tampon de lyse froid, traité par ultrasons 5 fois pendant 30 secondes, suivie d'une centrifugation (4 ° C, 20 000 g pendant 30 min
). Les corps d'inclusion lavés ont été solubilisées dans un tampon de liaison, pH 8 (6 M de guanidinium HCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M de NaCl, 5 mM d'imidazole, 1 mM de β-mercaptométhanol) par une rotation douce pendant 1 h à température ambiante. La matière insoluble a été éliminée par centrifugation à grande vitesse à 4 ° C (100 000 g pendant 30 min
). rNapA a été purifié à partir du surnageant clarifié sur une colonne de Ni-Sepharose (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) selon les instructions du fabricant. rNapA a été élue avec un tampon d'élution à pH 8 (urée 8 M, Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, 0,5 M d'imidazole, et 1 mM de β-mercaptoéthanol) et sur dialysée contre du PBS à 4 ° C. Les expériences d'immunisation et l'infection de la suite, rNapA a été analysé par SDS-PAGE et la concentration en protéines a été déterminée en utilisant la protéine de RC DC Assay (Bio-Rad).
La conception expérimentale est résumée dans la figure 1. Cinq groupes de 10 souris ont été inoculées par voie intranasale deux fois avec 3 semaines d'intervalle, chaque fois avec 17,5 ul d'inoculum. Dans les groupes 1, 2 et 3, l'inoculum est composée de HBSS avec 5 ug CT, contenant 30 ug rUreB, 30 pg et 100 pg rNapA HS5 lysat, respectivement. Groupes 4 (groupe témoin immunisé) et 5 (groupe témoin négatif) ont été inoculés avec HBSS. Trois semaines après la seconde immunisation intranasale, le sang a été recueilli par la queue des saignements de cinq animaux par groupe et une semaine plus tard, tous les animaux, à l'exception du groupe témoin négatif, ont été inoculées par voie intragastrique avec 200 bouillon ul Brucella à pH 5 contenant 10 8 viables H. Suis
bactéries [11]. Le groupe témoin négatif a été inoculé par voie intragastrique avec 200 bouillon ul Brucella à pH5. Quatre semaines après l'inoculation intragastrique, les souris ont été euthanasiés par dislocation cervicale après une anesthésie isoflurane (IsoFlo; Abbott, IL, USA). A partir de ces animaux ont été euthanasiés, le sang a été recueilli par ponction cardiaque stérile, centrifugés (1000 g
, 4 ° C, 10 min) et le sérum a été congelé à -70 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Les estomacs ont été excisés et disséqué le long de la grande courbure. Une moitié de l'estomac, y compris antre et fundus a été immédiatement placé dans 1 ml d'ARN plus tard (Ambion, Austin, TE, États-Unis) et stocké à -70 ° C pendant plus d'ARN et d'ADN d'extraction. Une bande longitudinale du tissu gastrique a été coupé de l'œsophage dans le duodénum le long de la grande courbure pour un examen histopathologique. Figure 1 Modèle expérimental de l'étude de la vaccination. Par groupe de 10 souris ont été immunisés par voie intranasale deux fois avec 3 semaines d'intervalle, chaque fois avec 30 ug rUreB + toxine cholérique 5 ug (CT); 30 ug rNapA + 5 ug de CT et 100 pg de lysat HS5 + 5 pg CT (groupes 1, 2 et 3, respectivement). Groupes 4 (groupe témoin immunisé) et 5 (groupe témoin négatif) ont été inoculés avec intranasale HBSS. Trois semaines après la seconde immunisation, du sang a été recueilli à partir de 5 souris par groupe et une semaine plus tard, les souris des groupes 1, 2, 3 et 4 ont été inoculés par voie intragastrique avec 108 H. suis
viable des bactéries. Le groupe 5 a été inoculé par voie intragastrique avec du HBSS. Quatre semaines après la provocation intragastrique, les souris ont été euthanasiées.
Quantification de H. suis
dans l'estomac
Après décongélation, les tissus de l'estomac ont été homogénéisés (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Allemagne) dans 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Pays-Bas) et l'ADN a été extrait de la phase inter et organique selon les instructions du fabricant Tri Reagent® RT. La charge bactérienne dans l'estomac a été déterminée en utilisant le décrit précédemment H. suis
quantitative en temps réel spécifique PCR (qPCR) [5] de. L'analyse de la réponse des cytokines de l'estomac
Les taux d'IFN-γ expression, IL-4, IL-10, IL-17 et TNF-α ont été évalués par PCR quantitative en utilisant un ADNc synthétisé à partir du tissu de l'estomac comme décrit précédemment [15]. Le cycle de seuil (Ct) les valeurs ont été normalisées à la moyenne géométrique des valeurs Ct des gènes de référence après laquelle une normalisation du taux d'ARNm ont été calculées en utilisant la 2 -ΔΔCt méthode [16].
Mesure des réponses d'anticorps sériques par dosage immuno-enzymatique (ELISA) The Protein Detector ELISA Kit ™ (KPL, Gaithersburg, MD, USA) a été utilisé pour évaluer rUreB-, rNapA- et HS5 lysat IgG spécifiques dans le sérum. En bref, des plaques à 96 puits à fond plat (Nunc MaxiSorp, Nunc Nalge Int., Rochester, NY, USA) ont été revêtues avec 2 pg /puits de rNapA purifié, 1 pg /puits de rUreB purifié, ou 1 pg /puits de H. les protéines de cellules entières de Suis dilués dans du tampon de revêtement 100 uL (24 heures, 4 ° C). Après blocage avec 1% d'albumine de sérum bovin dans du PBS, 100 pi de sérum dilué au 1/400 a été ajouté à chaque puits. Après un nouveau lavage, 100 ul de HRP-anticorps anti-IgG de souris (H + L) dans une concentration finale de 50 ng par puits ont été ajoutés. Cinq minutes après l'ajout de 2,2'-azino-bis (6-3-éthylbenzothiazoline-sulfonique) (ABTS) solution de substrat de peroxydase, l'absorbance a été lue à 405nm (DO 405nm).
Histopathologique Examen
les bandes de tissus gastriques longitudinales ont été fixées dans 4% de formol tamponné au phosphate, traitée par des procédés classiques et noyés dans de la paraffine. Pour l'évaluation de la gastrite, hématoxyline - éosine (HE) sections colorées de 5 um ont été aveuglément évaluées sur la base du degré d'infiltration des lymphocytes, des cellules plasmatiques et des neutrophiles, en utilisant une échelle visuelle analogique semblable au système de Sydney Mise à jour (sur une échelle de 0- 3) [17] avec les spécifications suivantes pour chaque score de gastrite: 0 = aucune infiltration de mononucléaires et /ou de cellules polynucléaires; 1 = légère infiltration de mononucléaires diffus et /ou polynucléaires; 2 = modéré infiltration diffuse de mononucléaires et /ou polynucléaires et /ou la présence d'un ou de deux agrégats inflammatoires; 3 = marquée infiltration mononucléaire diffuse et /ou polynucléaires et /ou la présence d'au moins trois agrégats inflammatoires. Le plus Normalité et l'homogénéité de la variance L'analyse statistique des données a été analysée à l'aide D'Agostino-Pearson et Shapiro test de normalité Wilk. Des différences significatives dans H.
suis colonisation et expression de l'ARNm de cytokines entre les groupes ont été évalués en effectuant une analyse unidirectionnelle ANOVA. test de comparaison multiple de Bonferroni a été utilisé comme post-hoc lorsque des variances égales ont été évalués. Le test post-hoc T3 de Dunnett a été utilisé en l'absence de l'égalité des variances ont été évalués. OD niveaux de ELISA et les scores d'inflammation histologiques 405nm ont été comparés par une analyse Kruskall-Wallis, suivie par un test de Mann-Whitney U. Pour les corrélations entre les différentes variables, le coefficient de rho de Spearman (ρ
) a été calculé. GraphPad Prism5 logiciels (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) a été utilisé pour toutes les analyses. Des différences statistiquement significatives entre les groupes ont été considérés à la p
< Résultats de 0,05.
Immunoproteomics de H. suis
H. Suis
protéines ont été séparées sur 2D-PAGE (Figure 2a). Après 2D-immunoblot avec un pool de sérums de lysat immunisées (Figure 2b) ou H. suis
animaux infectés par le (Figure 2c), un total de 19 spots de protéines immunoréactives ont été sélectionnés. Ces spots ont été appariés avec les taches de protéines qui pourraient être vus dans le parallèle 2D-PAGE (Figure 2a). Petite réactivité contre H. Suis
protéines a été observée dans le sérum post-infection par rapport à la forte réactivité des sérums de souris lysat immunisées. Lorsque le transfert a été sondé avec un pool de sérums provenant de souris témoins négatifs, sans taches spécifiques de protéines immunoréactives ont été détectées (fichier_1 additionnel). Spots d'intérêt (n = 19
) ont été découpées du gel, digérés et identifiés par analyse LC-MS /MS. Les résultats détaillés de ces protéines sont résumées dans le tableau 1. Spots avec la plus grande réactivité (spot 1 à 5) ont été identifiés comme UreB. H.
chaperonine GroEL suis, illustré sous forme de taches 9 et 10 sur la figure 2a, a également montré une forte hybridation avec des sérums provenant d'animaux de lysat immunisées. En outre, les sérums provenant de souris immunisées lysat a montré une forte réactivité contre la protéine accessoire uréase (de UreH) et la sous-unité d'uréase A (urée) (points 15 à 19 ans), qui était moins prononcée dans le groupe infecté. réactivité Faible contre le principal FlaA flagelline (spots 11 à 13) était présent dans les deux blots. Figure 2 H. suis profil 2D-protéome (A) et Western blots d'un gel 2D en double ont réagi avec des sérums groupés de souris lysat immunisées (B) ou de H. souris suis infecté par (C). 100 ug d'extrait protéique total de H. suis
a été séparé par électrophorèse en 2D en utilisant un pH de 3 à 10 gradient linéaire dans la première dimension et 10% TrisHCl SDS-PAGE dans la seconde dimension. Les protéines séparées ont été détectées par coloration de la protéine SYPRO®Ruby. Les zones encadrées indiquent où des antigènes immunoréactifs ont été excisées du gel et soumis à une LC-MS /MS. protéines identifiées sont indiquées par les numéros de place indiqués dans le tableau 1. Les boîtes et les chiffres en rouge ont été identifiés comme UreB. La position du poids moléculaire (MW) est donnée sur la droite, et le pH est donnée au bas.
Tableau 1 immunoréactive protéines de H. Suís identifiés par LC-MS /MS
spot no.1

nom de protéine
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. peptides appariés
Mascot SCORE4
Cov. (%) 5
1
uréase sous-unité B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
117
1589
72
2
uréase sous-unité B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
80
1042
58
thréonyle-ARNt synthétase
EFX41598
THRS
6,34
69,315
7
186
60 3
uréase sous-unité B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
80
903
46 4
sous-unité d'uréase B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
5
uréase sous-unité B
EFX42254
ureB
5,97
62,967 4
103
6
6
30S protéine ribosomique S1
EFX42427
RPSA
8,29
64,051
23
625
28
quinone réactif Ni /Fe hydrogénase, grande sous-unité
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
uréase de H. heilmannii
AAA65722
8,86
25,844 8
258
26
7
Methyl acceptant la protéine chimiotaxie
EFX43528
7.1
48,907
35
905
50 8
facteur de Allongement G
EFX41637
Fusa
5.15
77,242
57
1066
55
9
Chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
Chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
uréase sous-unité B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
flagelline A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
29
756
47
12
flagelline A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
57
1294
62
13
flagelline A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
46
1085
63
facteur de déclenchement
EFX42378
tig

5.13
49,587
12
343
24
14
hydrogénase expression /protéine de formation
EFX41790
HYPB
5,59
27,617
15
314
35
nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25 déshydrogénase
7-alpha-hydroxystéroïde
EFX41880
6,62
28,246
6
186
24
protéine sécrétée hypothétique Conservé
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
protéines hypothétique HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
uréase protéine accessoire
EFX42255
ureH
6,79
30,447 4
106
13
16
uréase sous-unité A
EFX42255 de la ureA
7,79
27,389
24
270
55
17
uréase sous-unité A
EFX42255 de la ureA
7,79
27,389
28
112
45
18
uréase sous-unité A
EFX42255 de la ureA
7,79
27,389
57
418
69
19
uréase sous-unité A
EFX42255 de la ureA
7,79
27,389
75
568
73
1 spot de protéine correspondant à la position sur gel et blot ( voir la figure 2)
2NCBI
:.. national Center for Biotechnology information
3 théorique point isoélectrique (pI) et le poids moléculaire (MW)
4 pour Helicobacter données, Mascotte scores supérieurs. que 40 sont significatifs (p
≤ 0,05).
5% de la séquence protéique couverte par les peptides identifiés. es Confirmation de la réactivité du sérum contre rUreB
de l'analyse 2D, UreB ont montré une réactivité distincte avec des sérums provenant de souris immunisées lysat, qui n'a pas été observé dans les sérums de souris non immunisées mais infectées. Afin de confirmer ces données, un 1D-PAGE chargé avec rUreB a été réalisée, suivie par immunodétection avec des sérums de souris infectées par le
Suis lysat immunisées et H.. 0,01. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• Caractérisation de l'expression génique des profils pour les différents types de mastocytes mis en commun des sous-régions de l'estomac de la souris par un procédé d'amplification d'ARN
• caractéristiques clinicopathologiques et l'analyse pronostique de la classification Lauren dans adénocarcinome gastrique en Chine