Immunisering med den immundominante Helicobacter suis urease subunit B inducerer delvis beskyttelse mod H. suis i en mus model

immunisering med den immundominante Helicobacter suis
urease subunit B inducerer delvis beskyttelse mod H. suis
infektion i en musemodel
Abstrakt
Helicobacter
(H.
) suis
er et svin og human gastrisk patogen. Tidligere undersøgelser af mus viste, at en H. suis
infektion ikke resulterer i beskyttende immunitet, hvorimod immunisering med H. suis
hel-cellelysat (lysat) beskytter mod en efterfølgende eksperimentel infektion. Derfor blev todimensional gelelektroforese af H. suis Salg proteiner udført efterfulgt af immunoblotting med samlede sera fra H. suis Salg - inficerede mus eller mus immuniseret med lysat. Svag reaktivitet mod H. suis Salg proteiner blev observeret i post-infektion sera. Sera fra lysat-immuniserede mus udviste imidlertid immunoreaktivitet mod i alt 19 protein pletter, som blev identificeret ved hjælp af LC-MS /MS. H. suis
urease subunit B (UreB) viste mest udtalte reaktivitet mod sera fra lysat-immuniserede mus og blev ikke påvist med sera fra inficerede mus. Ingen af ​​de poolede sera opdaget H. suis
neutrofil-aktiverende protein A (Napa). Den beskyttende effekt af intranasal vaccination af BALB /c-mus med H. suis
UreB og Napa, både rekombinant udtrykt i Escherichia coli
(rUreB og rNapA henholdsvis), blev sammenlignet med virkningen af ​​H. suis
lysat. Alle vacciner indeholdt choleratoxin som adjuvans. Immunisering af mus med rUreB og lysat inducerede en betydelig reduktion af H. suis
kolonisering sammenlignet med ikke-vaccinerede H. suis
inficerede kontroller, mens rNapA havde ingen signifikant beskyttende virkning. Sandsynligvis, en kombination af lokale Th1 og Th17 responser, suppleret med antistofresponser spille en rolle i den beskyttende immunitet mod H. suis
infektioner.
Indledning
Helicobacter
(H.
) suis
er en verdensomspændende spredning patogen, primært kolonisere svin. En infektion med denne Gram-negativ bakterie er blevet forbundet med sår i gastrisk ikke-glandulære slimhinde [1, 2] og forårsager gastritis og nedsat daglig tilvækst [3] i grise. H. suis
er også den mest udbredte ikke-Helicobacter pylori Helicobacter
arter hos mennesker, der lider af gastrisk lidelser [2] og grise kan tjene som en kilde til H. suis
infektioner for mennesker [2, 4 ]. Kontrol af H. suis
infektioner med antibiotika-terapi anbefales ikke til dels på grund af en øget risiko for udvikling erhvervet antibiotikaresistens hos H. suis
stammer og i bakterier, der tilhører den normale svin mikrobiota [5]. Vaccination mod H. suis
kan derfor udgøre et værdifuldt alternativ. Indtil nu, men få studier har beskæftiget sig med vaccination mod denne svine- og zoonotiske patogen.
Tidligere undersøgelser i en musemodel viste, at en H. suis
infektion ikke resulterer i beskyttende immunitet, mens vaccination baseret på homolog (H. suis
) eller heterolog (H. bizzozeronii
eller H. cynogastricus
) hel-cellelysat inducerede en reduktion eller endog fuldstændig clearance af gastrisk kolonisering med H. suis
[6]. Imidlertid er anvendelsen af ​​denne type vacciner har ulemper, herunder den møjsommelige in vitro dyrkning af H. suis
, hvilket resulterer i vanskeligheder med at producere tilstrækkelig antigen. Desuden kan helcellelysater indeholde både beskyttende antigener og antigener undertrykker beskyttelse [7]. En effektiv subunit vaccine kan være et nyttigt alternativ til styring af H. suis
infektioner. Immunoproteomics er en passende metode til hurtig identifikation af kandidat proteiner til vaccination og er blevet anvendt til at studere og udvikle underenhedsvacciner til en bred vifte af patogener [8].
Det var formålet med den foreliggende undersøgelse at vælge H. suis
proteiner, som kan inducere beskyttende immunitet mod H. suis
infektion. Derfor H. suis Salg proteiner genkendes af sera fra mus immuniseret med H. suis
hel-cellelysat og beskyttet mod infektion, blev identificeret ved hjælp af todimensionel (2D) gelelektroforese efterfulgt af immunoblotting og LC-MS /FRK. Sera af H. suis
- inficerede mus blev også inkluderet, da en infektion ikke resulterer i beskyttelse. Baseret på denne analyse, det immunoreaktive H. suis
urease underenhed B (UreB) blev udvalgt til yderligere in vivo-forsøg. Som en kontrol vi medtaget H. suis
neutrofil-aktiverende protein A (Napa), som tidligere er blevet beskrevet som en mulig virulensfaktor [9], men blev ikke genkendt af sera fra mus immuniseret med hel-cellelysat. Efterfølgende den beskyttende effekt mod et H. suis
infektion af både underenhedsvacciner blev evalueret og sammenlignet med den af ​​H. suis
lysat i et standardiseret musemodel.
Materialer og metoder
Bakteriel stamme
I alle eksperimenter, H. suis
stamme 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) blev anvendt. Denne stamme blev isoleret fra maveslimhinden af ​​en gris ifølge fremgangsmåden beskrevet af Baele et al. [10].
Dyr Salg En uge forud for indledningen af ​​forsøgene, fem uger gamle specifikke patogen- -fri BALB /c-mus blev opnået fra en autoriseret opdrætter (Harlan, Horst, Holland). Dyrene blev opstaldet på steriliserede spåner i filteret top bure. De blev fodret med en autoklaveret kommerciel diæt (Teklad 2018S, HARLAN) og modtaget autoklaveret vand ad libitum
. Alle dyreforsøg laboratorieforsøg blev godkendt af Animal Care og etiske komité for Det Naturvidenskabelige Veterinary Medicine, Ghent Universitet.
Immunoproteomics af H. suis
To-dimensional gelelektroforese (2D-PAGE)
HS5 blev dyrket som tidligere [11] beskrevet. Bakterier blev høstet ved centrifugering (5000 g
, 4 ° C i 10 min) og vasket fire gange med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS). Totale proteiner (både opløselige og uopløselige proteiner) blev ekstraheret i to trin med ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. For at opnå gode 2D-PAGE-resultater blev homogenaterne behandlet med ordentlig additiver (5 mg proteaseinhibitorcocktail, 1 pi DNAse I, 1 pi RNAse A, 10 pi phosphataseinhibitorer PP2 og PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) ). Endelig blev proteinkoncentrationen bestemt under anvendelse af RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) og proteiner blev opbevaret ved -70 ° C indtil yderligere anvendelse. I alt 100 ug HS5 proteiner blev rehydreret i 200 pi rehydrering buffer (7 M urea, 2 M thiourinstof, 2% CHAPS, 0,2% carrier ampholyt pH3-4, 100 mM dithiothreitol (DTT) og bromphenolblåt). Prøver blev passivt absorberet i en ReadyStrip (11 cm, pH 3 til pH 10, Bio-Rad) og isoelektrisk fokusering blev udført i en Protean IEF afdeling (Bio-Rad) som tidligere beskrevet [12]. Efter isoelektrisk fokusering blev strimlerne ækvilibreret i 15 minutter i 1,5% DTT i ækvilibreringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8 6M urinstof, 20% glycerol, 2% SDS) efterfulgt af en anden ækvilibrering i 4% iodacetamid i ækvilibreringsbuffer. Gelelektroforese blev udført på en 10% Tris-HCI SDS-PAGE under anvendelse af 150 V i 30 minutter, efterfulgt af 200V i 1 time. To geler blev kørt parallelt: en blev farvet med Sypro® Ruby Protein Gel-farvning (Bio-Rad), mens den anden blev anvendt til immunoblotting (se Western blotting beskrevet nedenfor). Før farvning blev gelerne fikseret i 10% MeOH, 7% eddikesyre. Efter farvning blev H. suis Salg proteiner visualiseres ved hjælp af VersaDoc Imaging System (Bio-Rad) Salg serumpuljer Salg Tre puljer af musesera blev anvendt i denne undersøgelse:.

Sera fra mus immuniseret med H. suis
hel-cellelysat (i det følgende benævnt "lysat-immuniserede mus") (n
= 10). Disse dyr blev inokuleret intranasalt to gange med tre ugers interval med 100 ug HS5 lysat + 5 ug choleratoksin (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysat blev fremstillet som beskrevet tidligere, men uden endelig filtrering af supernatanten [6]. Tre uger efter den sidste immunisering blev blod opsamlet, og sera blev samlet. Denne immunisering protokol har vist sig at være (delvist) beskyttende mod H. suis
udfordring [6] og den beskyttende virkning blev bekræftet her i et indledende forsøg (data ikke vist).

Sera fra H. suis
inficerede mus (i det følgende benævnt "inficerede mus") (n
= 10). Disse dyr blev inokuleret intragastrisk med 200 pi Brucella-bouillon ved pH 5, indeholdende 10 ^{8 frisklavet H. suis Salg bakterier [11]. Fire uger efter infektion blev blod opsamlet, og sera blev samlet.}

Sera fra negative kontrolmus (n
= 10). Disse dyr fik HBSS intranasalt to gange med en tre ugers interval efterfulgt af intragastrisk inokulering med 200 pi Brucella-bouillon ved pH 5 (4 uger efter sidste fingeret immunisering). Efter fire uger blev blod opsamlet, og sera blev samlet.
Alle sera blev opbevaret ved -70 ° C indtil yderligere anvendelse.
Western blotting
Proteiner blev elektrooverført fra geler på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad) som beskrevet andetsteds [12]. Membraner blev blokeret i 5% skummetmælk i phosphatpufret saltvand (PBS) (blokerende buffer), inkuberet natten over (ON) med fortyndet musesera (1/100 i blokeringsbuffer) ved stuetemperatur (RT), skyllet i PBS med 0,3% Tween-20 (vaskebuffer) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med stabiliseret gede-anti-muse-immunglobulin G (IgG) peberrodsperoxidasekonjugeret (HRP) -konjugeret (1/1000 i blokerende buffer, Pierce, Rockford, IL, USA). Efter et vasketrin i vaskebuffer blev immunodetektion af proteiner udføres ved forøget kemiluminescens påvisning ved Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce). Proteinmønstre blev scannet og digitaliseret under anvendelse af VersaDoc Imaging System. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Salg In-gel protein fordøjelse og identifikation ved massespektrometri Salg In-gel fordøjelse af proteiner blev udført som beskrevet af Cheung et al. [13]. Forud for massespektrometri de isolerede peptider blev separeret på en U3000 nano-højtydende væskekromatografi (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) som tidligere beskrevet [14].
Identifikation af peptiderne blev udført ved anvendelse af en elektrospray ionisering quadrupol time-of-flight massespektrometri (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) som tidligere beskrevet [14]. Dataanalyse blev udført mod Helicobacter
protein database fra NCBI (146 612 poster) ved hjælp af in-house søgemaskine Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, London, UK). En fejl tolerant søgning blev udført med carbamidomethyl (C) som fast modifikation. Carbamidomethyl (N-terminal) og oxidation (M) blev fastsat som variable modifikationer. Peptidmasse tolerance og fragmentet mass tolerance blev fastsat til 0,35 Da og 0,45 Da. Maksimalt to miscleavages var tilladt. Proteiner blev kun anset for at være kommenteret korrekt, når betydningen var under 0,05 (p
< 0,05) og mindst ét ​​peptid bestået de krævede fede røde kriterier fra Mascot Daemon, hvilket indikerer, at mindst et peptid havde rang 1 og en betydning under 0,05. Salg One-dimensional gelelektroforese (1D-PAGE) og Western blotting af rUreB
1D-PAGE af 10 ug rekombinant H. suis
urease subunit B (rUreB) blev udført som beskrevet af Van Steendam et al. [12]. Sera forberedelse og Western blot-analyser blev udført som beskrevet ovenfor.
Beskyttende effekt af rekombinant H. suis
proteiner i en musemodel
Fremstilling af rekombinant UreB
Et fragment, der koder for H. suis
UreB sekvens (GenBank locus tag HSUHS5_0285) blev amplificeret ved PCR under anvendelse af en Pwo polymerase med korrekturlæsningsaktivitet (Roche, Mannheim, Tyskland) fra DNA'et af HS5 (forward primer: 5'- ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 «revers primer: 5'CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3) og klonet ind i protein ekspressionsvektoren pET-24d. Den rUreB blev udtrykt i E. coli
stammen BL21 (DE3). Cellerne blev lyseret ved lydbehandling (5 gange i 30 sekunder) i buffer indeholdende 50 mM Na.PO 4 pH 7, 0,5M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 og 1 mM PMSF. Efter centrifugering (4 ° C, 20 000 g
i 30 minutter), blev rUreB oprenset fra den opløselige fraktion under anvendelse af Ni-affinitetschromatografi i buffer bestående af 1M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidazol og 10% glycerol (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige) efterfulgt af gelfiltrering på en Superdex ™ 200 HR 16/60 søjle (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Efter oprensning blev rUreB analyseret under anvendelse af SDS-PAGE og Western blot-analyse under anvendelse af anti-hexahistidin-tag monoklonalt museantistof (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estland). Detergenten Triton X-100 blev fjernet fra det oprensede rUreB ved hjælp Pierce Detergent Removal Spin kolonner (Pierce) efter producentens anvisninger. Proteinkoncentration blev bestemt med RC DC
proteinassay (Bio-Rad).
Fremstilling af rekombinant Napa
Proteinet blev udtrykt i E. coli
Expression System med Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som følger. Et fragment, der koder for H. suis
neutrofil-aktiverende protein A (Napa) sekvens (GenBank locus tag HSUHS5_0014) blev amplificeret ved PCR under anvendelse af en Pwo polymerase med korrekturlæsningsaktivitet (Roche) fra DNA'et af HS5 (forward primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC 3 '; revers primer: 5'- TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC 3') og klonet ind i pENTR ™ /TEV /D-TOPO®-vektoren og overføres til pDEST17 ™ destination vektor. Den valgte pDEST17-Napa plasmid blev transformeret til BL21-AI ™ E. coli
og efterfølgende dyrket ved 37 ° C til en OD 600 af 0,6-1,0 i Luria Broth suppleret med 50 ug /ml carbenicillin. Rekombinant H. suis
Napa (rNapA) blev induceret ved tilsætning af 0,2% L- arabinose. Efter 4 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne høstet og resuspenderet i lysisbuffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lysozym, 20 ug /ml DNAse, 1 mM protease inhibitor (Sigma) og 1 mM MgCl 2. Cellerne blev lyseret ved lydbehandling (5 gange i 30 s). Cellerester og inklusionslegemer blev isoleret ved centrifugering ved 4 ° C (20 000 g
i 30 minutter). Inklusionslegemerne blev efterfølgende vasket to gange baseret på den følgende protokol: pelleten blev resuspenderet i kold lysepuffer, sonikeret 5 gange i 30 s efterfulgt af centrifugering (4 ° C, 20 000 g
i 30 minutter). De vaskede inklusionslegemer blev solubiliseret i bindingspuffer, pH 8 (6 M guanidium HCI, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM β-mercaptomethanol) ved forsigtig rotation i 1 time ved stuetemperatur. Uopløseligt materiale blev fjernet ved høj hastighed centrifugering ved 4 ° C (100 000 g
i 30 minutter). rNapA blev oprenset fra klarede supernatant på en Ni-sepharosesøjle (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) ifølge producentens instruktioner. rNapA blev elueret med elueringsbuffer, pH 8 (8M urinstof, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazol, og 1 mM β-mercaptoethanol) og ON dialyseret mod PBS ved 4 ° C. Bagefter blev rNapA analyseret under anvendelse af SDS-PAGE og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Immunisering og infektion eksperimenter
Det eksperimentelle design er opsummeret i figur 1. Fem grupper af 10 mus blev intranasalt inokuleret to gange med 3 ugers interval, hver gang med 17,5 pi inokulum. I gruppe 1, 2 og 3 podestoffet bestod af HBSS med 5 ug CT, indeholdende 30 ug rUreB, 30 ug rNapA og 100 ug HS5 lysat hhv. Grupper 4 (skin-immuniserede gruppe) og 5 (negativ kontrolgruppe) blev inokuleret med HBSS. Tre uger efter den anden intranasale immunisering blev blod opsamlet ved halen blødning fra fem dyr pr gruppe og en uge senere, alle dyr, undtagen den negative kontrolgruppe blev inokuleret intragastrisk med 200 pi Brucella-bouillon ved pH 5 indeholdende 10 8 levedygtige H. suis
bakterier [11]. Den negative kontrolgruppe blev inokuleret intragastrisk med 200 pi Brucella-bouillon ved pH 5. Fire uger efter den intragastrisk inokulering blev mus aflivet ved cervikal dislokation efter isofluran anæstesi (IsoFlo; Abbott, IL, USA). Fra de aflivede dyr blev blod opsamlet ved sterile hjertepunktur, centrifugeret (1000 g
, 4 ° C, 10 min), og serum blev frosset ved -70 ° C indtil yderligere anvendelse. Maverne blev udskåret og dissekeret langs den største krumning. Halvdelen af ​​de maver, herunder antrum og fundus, blev øjeblikkeligt anbragt i 1 ml RNA Senere (Ambion, Austin, TE, USA) og opbevaret ved -70 ° C til yderligere RNA- og DNA-ekstraktion. En langsgående strimmel af det gastriske væv blev skåret fra spiserøret til tolvfingertarmen langs den største krumning til histopatologisk undersøgelse. Figur 1 Eksperimentel design af vaccination undersøgelse. Per gruppe 10 mus blev intranasalt immuniseret to gange med 3 ugers interval, hver gang med 30 ug rUreB + 5 ug kolera toksin (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT, og 100 ug HS5 lysat + 5 ug CT (grupper 1, 2 og 3, henholdsvis). Grupper 4 (skin-immuniserede gruppe) og 5 (negativ kontrol gruppe) blev intranasalt inokuleret med HBSS. Tre uger efter den anden immunisering blev blod opsamlet fra 5 mus pr gruppe og en uge senere mus af gruppe 1, 2, 3 og 4 blev intragastrisk inokuleret med 108 levedygtige H. suis
bakterier. Gruppe 5 blev intragastrisk inokuleret med HBSS. Fire uger efter intragastrisk udfordring blev musene aflivet.
Kvantificering af H. suis
i maven
Efter optøning blev mave væv homogeniseres (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Tyskland) i 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Holland), og DNA blev ekstraheret fra den inter- og organiske fase ifølge Tri Reagent® RT producentens anvisninger. Den bakterielle belastning i maven blev bestemt ved anvendelse af den tidligere beskrevne H. suis
specifik kvantitativ real-time PCR (qPCR) [5].
Analyse af maven cytokin respons
Ekspressionsniveauerne for IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 og TNF-α blev vurderet ved qPCR anvendelse af cDNA syntetiseret fra mavevæv som tidligere [15] beskrevne. Tærsklen cyklus (Ct) værdier blev normaliseret til det geometriske gennemsnit af Ct-værdier fra reference- gener hvorefter normaliseret mRNA niveauer blev beregnet ved anvendelse af 2 -ΔΔCt metode [16].
Måling af serum antistof-reaktioner ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA)
Protein Detector ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) blev anvendt til at evaluere rUreB-, rNapA-, og HS5 lysat specifik IgG i serum. Kort fortalt blev 96-brønds fladbundede plader (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) belagt med 2 ug /brønd af oprenset rNapA, 1 ug /brønd af oprenset rUreB, eller 1 ug /brønd af H. suis
helcelleproteiner fortyndet i 100 coating pi puffer (24 timer, 4 ° C). Efter blokering med 1% bovint serumalbumin i PBS, blev 100 pi 1/400 fortyndet serum til hver brønd. Efter yderligere vaskning, 100 pi HRP-mærket anti-muse-IgG (H + L) i en endelig koncentration på 50 ng per brønd blev tilsat. Fem minutter efter tilsætning 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) peroxidasesubstrat opløsning, absorbans blev aflæst ved 405 nm (OD 405nm).
Histopatologisk undersøgelse
de langsgående gastriske væv strimler blev fikseret i 4% phosphatbufret formaldehyd, behandlet ved standardprocedurer og indlejret i paraffin. Ved evaluering af gastritis, hæmatoxylin - eosin (HE) farvede snit af 5 um blev blindt scoret baseret på graden af ​​lymfocytter, plasmaceller og neutrofiler, ved anvendelse af en visuel analog skala ligner den Opdateret Sydney System (på en skala fra 0- 3) [17] med følgende specifikationer for hvert gastritis score: 0 = ingen infiltration af mononukleære og /eller polymorfonukleære celler; 1 = mild diffus infiltration af mononukleære og /eller polymorfonukleære celler; 2 = moderat diffus infiltration af mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelse af et eller to inflammatoriske aggregater; 3 = markant diffus infiltration af mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelsen af ​​mindst tre inflammatoriske aggregater.
Statistisk analyse
normalitet og varianshomogenitet af data blev analyseret ved anvendelse af D'Agostino-Pearson og Shapiro- Wilk normalitet test. Væsentlige forskelle i H. suis
kolonisering og mRNA cytokin udtryk blandt grupper blev vurderet ved at udføre envejs ANOVA-analyse. Bonferroni multiple sammenligningstest anvendtes som post-hoc, når ens varianser blev vurderet. Dunnetts T3 post-hoc test blev anvendt, når der ikke ens varianser blev vurderet. OD 405nm niveauer fra ELISA og histologiske inflammation scores blev sammenlignet ved Kruskall-Wallis-analyse efterfulgt af en Mann-Whitney U
test. For sammenhænge mellem forskellige variabler, blev Spearmans rho koefficient (ρ
) beregnet. GraphPad Prism5 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) blev anvendt til alle analyser. Statistisk signifikante forskelle mellem grupper blev behandlet på p
< 0.05.
Resultater
Immunoproteomics af H. suis
H. suis
proteiner blev separeret på 2D-PAGE (figur 2a). Efter 2D-immunoblotting med samlede sera fra lysat-immuniseret (figur 2b) eller H. suis
-inficerede dyr (figur 2C), blev i alt 19 immunreaktive proteinpletter valgt. Disse pletter blev matchet med proteinet pletter, der kunne ses i den parallelle 2D-PAGE (figur 2a). Lille reaktivitet mod H. suis Salg proteiner blev observeret i post-infektion sera sammenlignet med den høje reaktivitet mod sera fra lysat-immuniserede mus. Når blottet blev probet med en pulje af sera opnået fra negative kontrolmus blev ingen specifikke immunreaktive proteinpletter påvist (Supplerende file1). Pletter af interesse (n
= 19) blev skåret ud af gelen, spaltet og identificeres ved hjælp af LC-MS /MS-analyse. De detaljerede resultater af disse proteiner er opsummeret i tabel 1. Steder med den højeste reaktivitet (spot 1 til 5) blev identificeret som UreB. H. suis
chaperoninet GroEL, illustreret som pletter 9 og 10 på figur 2a, viste også stærk hybridisering med sera fra lysat-immuniserede dyr. Derudover sera fra lysat-immuniserede mus udviste stærk reaktivitet mod urease accessorisk protein (UreH) og urease subunit A (urea) (blev 15 til 19), som var mindre udtalt i den inficerede gruppe. Svag reaktivitet mod den store flagellin Flå (blev 11 til 13) var til stede i begge blots. Figur 2 H. suis 2D-proteomanalyse profil (A) og Western blots af en dublet 2D-gel omsættes med pooled sera lysat-immuniserede mus (B) eller af H. suis -inficerede mus (C). 100 ug totalt proteinekstrakt af H. suis
blev separeret ved 2D-elektroforese under anvendelse af lineær pH ​​3 til 10 gradient i den første dimension og 10% TrisHCI SDS-PAGE i den anden dimension. De separerede proteiner blev detekteret ved SYPRO®Ruby Protein farvning. De indrammede områder angiver, hvor immunreaktive antigener blev udskåret fra gelen og underkastet LC-MS /MS. Identificerede proteiner er angivet med stedet tal i tabel 1. Kasser og tal i rød blev identificeret som UreB. Positionen af ​​molekylvægt (MW) er givet til højre, og pH-værdien er givet i bunden.
Tabel 1 Immunoreaktivt proteiner af H. suis identificeret ved LC-MS /MS
Spot no.1

Protein navn
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. matchede peptider
Mascot score4
Cov. (%) 5
1
Urease underenhed B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
117
1589
72
2
Urease underenhed B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
80
1042
58
threonyl-tRNA syntetase
EFX41598
thrS
6,34
69,315
7
186
60
3
Urease underenhed B
EFX42254
ureB

5.97
62,967
80
903
46
4
Urease underenhed B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
4
103
6
5
Urease underenhed B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
4
103
6
6
30S ribosomale protein S1
EFX42427
rpsA
8,29
64,051
23
625
28
Quinon-reaktivt Ni /Fe hydrogenase, stor underenhed
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
Urease af H. heilmannii
AAA65722
8.86
25,844
8
258
26
7
Methyl-accepterende kemotaksi protein
EFX43528
7,1
48,907
35
905
50
8
Forlængelse faktor G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
chaperoninet GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
Urease underenhed B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
flagellin A
EFX41982
Flå
7,77
54,232
29
756
47
12
flagellin A
EFX41982
Flå
7,77
54,232
57
1294
62
13
flagellin A
EFX41982
Flå
7,77
54,232
46
1085
63
Trigger faktor
EFX42378
tig

5,13
49,587
12
343
24
14
hydrogenase udtryk /dannelse protein
EFX41790
hypB
5.59
27,617
15
314
35
Nicotinate-nukleotid pyrophosphorylase
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25
7-alpha-hydroxysteroiddehydrogenase
EFX41880
6,62
28,246
6
186
24
Bevarelse hypotetiske udskilt protein
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
Hypotetisk protein HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5.84
25,811
7
107
19
15
Urease tilbehør protein
EFX42255
ureH

6,79
30,447
4
106
13
16
Urease subunit A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
24
270
55
17
Urease subunit A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
28
112
45
18
Urease subunit A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
57
418
69
19
Urease subunit A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
75
568
73
1 Protein spot svarende til stilling på gel og blots ( se figur 2)
2NCBI
:.. National center for Biotechnology Information
3 Teoretisk isoelektriske punkt (pI) og molekylvægt (MW)
4 for Helicobacter
data, Mascot scoringer større. end 40 er signifikant (p
≤ 0,05).
5% af proteinsekvensen omfattet af peptiderne identificeret.
Bekræftelse af serum reaktivitet mod rUreB
fra 2D-analyse viste UreB distinkt reaktivitet med sera fra lysat-immuniserede mus, som ikke blev observeret i sera fra ikke-immuniserede, men inficerede mus. For at bekræfte disse data blev en 1D-PAGE fyldt med rUreB udført, efterfulgt af immunodetektion med sera fra lysat-immuniserede og H. suis
-inficerede mus. 0,01. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Karakterisering af genekspression profiler til forskellige typer af mastceller poolet fra muse maven underregioner af en RNA-amplifikationsmetode
• Klinisk-patologisk karakteristika og prognostisk analyse af Lauren klassifikationen i gastrisk adenocarcinom i Kina