Die Immunisierung mit dem immuno-Helicobacter suis Urease-Untereinheit B induziert einen partiellen Schutz gegen H. suis-Infektion in einem Maus-Modell

Die Immunisierung mit dem immuno-Helicobacter suis
Urease-Untereinheit B induziert einen teilweisen Schutz gegen H. suis
Infektion in einem Mausmodell
Zusammenfassung Helicobacter
(H.
) suis
ist ein Schwein und Mensch Magen-Erreger. Frühere Studien an Mäusen zeigten, dass eine H. suis
Infektion nicht in eine schützende Immunität führt, während die Immunisierung mit H. suis
Ganzzell-Lysat (Lysat) schützt gegen eine nachfolgende experimentelle Infektion. Daher wurde zweidimensionale Gelelektrophorese von H. suis
Proteine ​​geführt, gefolgt von mit gepoolten Seren von H. suis
Immunoblotting - infizierten Mäuse oder Mäuse mit Lysat immunisiert. Schwache Reaktivität gegen H. suis
Proteine ​​wurde in post-Infektionsseren beobachtet. Seren von Lysat immunisierten Mäuse zeigten jedoch Immunreaktivität gegen insgesamt 19 Proteinspots, die LC-MS /MS identifiziert wurden. Die H. suis
Urease-Untereinheit B (UreB) zeigte am deutlichsten Reaktivität gegen Seren von Lysat-immunisierten Mäusen und wurde nicht mit Seren von infizierten Mäusen nachgewiesen. Keine der gesammelten Seren nachgewiesen H. suis
Neutrophilen-aktivierendes Protein A (NAPA). Die Schutzwirkung von intranasalen Impfung von BALB /c-Mäuse mit H. suis
UreB und NAPA, sowohl rekombinant in Escherichia coli exprimiert
(rUreB und rNapA bezeichnet), wurde mit der von H. suis
verglichen Lysat. Alle Impfstoffe als Adjuvans enthalten Choleratoxin. Immunisierung von Mäusen mit rUreB und Lysat eine signifikante Reduktion der induzierten H. suis
Kolonisierung im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollen H. suis
-infizierten, während rNapA keine signifikante schützende Wirkung hatte. Wahrscheinlich wird eine Kombination aus lokalen Th1 und Th17-Antworten, ergänzt durch Antikörper-Reaktionen spielen eine Rolle bei der schützenden Immunität gegen H. suis
Infektionen.
Einführung Helicobacter
(H.
) suis
ist eine weltweite Verbreitung Erreger, vor allem kolonisieren Schweine. Eine Infektion mit diesem Gram-negative Bakterium hat mit Geschwüren des Magen nicht Drüsenschleimhaut [1, 2] und verursacht Gastritis und verringerte tägliche Gewichtszunahme [3] bei Schweinen in Verbindung gebracht worden. H. suis
ist auch die häufigste nicht-Helicobacter pylori Helicobacter
Spezies bei Menschen von Magenerkrankungen leiden, [2] und Schweine dienen als eine Quelle von H.
Infektionen beim Menschen suis [2, 4 ]. Kontrolle von H. suis
Infektionen durch Antibiotika-Therapie nicht zum Teil auf einer erhöhten Gefahr von Antibiotikaresistenzen in H. suis
Stämme gewonnen empfohlen Entwicklung und in Bakterien, die zur normalen porcine microbiota gehör [5]. Die Immunisierung gegen H. suis
kann somit eine wertvolle Alternative darstellen. Bis jetzt jedoch nur wenige Studien mit der Impfung behandelt haben gegen diese Schweine und Zoonoseerreger.
Frühere Studien in einem Mausmodell zeigte, dass eine H. suis
Infektion nicht in eine schützende Immunität führt, während die Impfung basiert auf homologe (H. suis
) oder heterologe (H. bizzozeronii oder in H. cynogastricus
) Ganzzell-Lysat eine Verringerung oder sogar eine komplette Abheilung von Magen Besiedelung mit H. suis
induziert [6]. Jedoch hat die Verwendung dieser Art von Impfstoffen Nachteile, einschließlich der mühsamen in vitro-Kultur von H. suis
, was zu Schwierigkeiten führt ausreichend Antigen zu produzieren. Auch Ganzzell-Lysaten sowohl schützende Antigene und Antigene enthalten kann Unterdrückung Schutz [7]. Eine wirksame Subunit-Impfstoff könnte eine nützliche Alternative für die Kontrolle von H. suis
Infektionen sein. Immunoproteomics ist ein geeigneter Ansatz zur raschen Identifizierung von Kandidatenproteine ​​für die Impfung und angewendet wurde Subunit-Impfstoffe für ein breites Spektrum von Krankheitserregern [8].
Es war das Ziel der vorliegenden Studie zu wählen H. suis zu studieren und zu entwickeln
Proteine, die eine schützende Immunität gegen H. suis
Infektion auslösen könnten. Daher erkannten Proteine ​​H. suis Videos Seren von Mäusen, die mit H. suis immunisiert
Ganzzell-Lysat und geschützt gegen eine Infektion durch die Verwendung von zwei-dimensionalen (2D) Gelelektrophorese, gefolgt von Immunoblotting und LC-MS identifiziert /FRAU. Seren von H. suis
- infizierten Mäuse wurden ebenfalls enthalten, da eine Infektion nicht in Schutz zur Folge hat. Basierend auf dieser Analyse,
die immunoreaktive H. suis Urease-Untereinheit B (UreB) wurde für weitere in-vivo-Tests ausgewählt. Als Kontrolle enthalten wir den H. suis
Neutrophilen-aktivierendes Protein A (NAPA), die als mögliche Virulenzfaktor zuvor beschrieben wurde [9], aber wurde nicht durch Seren von Mäusen, die mit Ganzzell-Lysat immunisierten erkannt. Anschließend wurde die Schutzwirkung gegen eine H. suis
Infektion beider Untereinheit-Impfstoffe bewertet und verglichen mit der von H. suis
Lysat in einem standardisierten Mausmodell.
Materialien und Methoden Bakterienstamm

Bei allen Versuchen, H. suis
Stamm 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) verwendet. Dieser Stamm aus der Magenschleimhaut des Schweins nach dem Verfahren von Baele et al beschrieben, isoliert wurde. [10].
Tiere
Eine Woche vor dem Beginn der Versuche, fünf Wochen alten specific-pathogen -freie weibliche BALB /c-Mäuse wurden von einem autorisierten Züchter (Harlan, Horst, Niederlande) erhalten. Die Tiere wurden auf sterilisierte Holzspäne in Filterober Käfigen untergebracht. Sie wurden mit einer autoklaviert kommerziellen Diät (Teklad 2018S, Harlan) gefüttert und Wasser ad libitum
autoklaviert empfangen. Alle Labortierversuche wurden von der Animal Care und Ethikkommission der Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Gent genehmigt.
Immunoproteomics von H. suis
Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-PAGE)
HS5 wurde wie zuvor beschrieben gezüchtet [11]. Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 g
, 4 ° C für 10 min) geerntet und viermal mit Hanks balancierter Salzlösung (HBSS). Gesamtproteine ​​(sowohl lösliche als auch unlösliche Proteine) wurden in zwei Stufen unter Verwendung des ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Um eine gute 2D-PAGE Ergebnisse zu erhalten, wurden die Homogenate mit der richtigen Additiven behandelt (5 mg Protease-Inhibitor-Cocktail, 1 &mgr; l DNAse I, 1 &mgr; l RNAse A, 10 &mgr; l Phosphatase-Inhibitoren PP2 und PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) ). Schließlich wurde die Proteinkonzentration mit dem RC-DC
Protein Assay (Bio-Rad) bestimmt, und die Proteine ​​wurden bei -70 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Insgesamt 100 ug HS5 Proteine ​​wurden in 200 &mgr; l Rehydrationspuffer (7M Ureum, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% Ampholyt Träger pH3-4, 100 mM Dithiothreitol (DTT) und Bromphenolblau) rehydratisiert. Proben wurden passiv in einem ReadyStrip (11 cm, pH3 bis pH10, Bio-Rad) und isoelektrische Fokussierung absorbiert wurde in einer Protean IEF Kammer (Bio-Rad) durchgeführt, wie zuvor beschrieben [12]. Nach isoelektrischen Fokussierung wurden die Streifen (Harnstoff 50 mM Tris-HCl, pH 8,8 6 M, 20% Glycerin, 2% SDS) für 15 min in 1,5% DTT in Äquilibrierungspuffer äquilibriert durch einen anderen Äquilibrierung in 4% Jodacetamid in Äquilibrierungspuffer gefolgt. Gelelektrophorese wurde auf einem 10% durchgeführt TrisHCl SDS-PAGE unter Verwendung von 150 V für 30 min, gefolgt von 200 V für 1 h. Zwei Gele wurden parallel durchgeführt: einer wurde gefärbt mit Sypro® Rubin Protein Gel-Färbung (Bio-Rad), während die andere für das Immunoblotting verwendet (siehe Western-Blotting unten beschrieben). Vor der Färbung wurden die Gele in 10% MeOH, 7% Essigsäure fixiert. . Nach der Färbung wurden H. suis
Proteine ​​unter Verwendung des VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
Serum pools visualisiert
Drei in dieser Studie verwendeten Pools von Mausseren wurden:

Seren von Mäusen, die mit H. suis
Ganzzell-Lysat (im Folgenden als "Lysat immunisierten Mäuse" bezeichnet) (n
= 10). Diese Tiere wurden intranasal zweimal mit 3 Wochen Intervall mit 100 ug HS5 Lysat + 5 &mgr; g Cholera-Toxin (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA) inokuliert. HS5 Lysat wurde hergestellt, wie zuvor, aber ohne Endfiltration des Überstands [6]. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde Blut gesammelt und die Seren wurden gesammelt. Das Immunisierungsprotokoll hat sich gezeigt, zu sein (teilweise) Schutz gegen H. suis
Herausforderung [6] und die Schutzwirkung wurde hier in einem Vorversuch bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Sera von H. suis
infizierten Mäusen (n
= 10) (im Folgenden als "infizierte Mäuse" bezeichnet). Diese Tiere wurden intragastral mit 200 ul Brucella-Brühe bei pH 5, enthaltend 10 ^{8 frisch zubereitetes H. suis
Bakterien [11] inokuliert. Vier Wochen nach der Infektion wurde Blut entnommen und die Seren wurden gesammelt.}

Seren von negativen Kontrollmäusen (n
= 10). Diese Tiere erhielten HBSS intranasal zweimal mit einem Intervall 3 Wochen, gefolgt von intragastric Inokulation mit 200 ul Brucella-Brühe bei pH 5 (4 Wochen nach der letzten Immunisierung Schein). Nach vier Wochen wurde Blut entnommen und die Seren wurden gesammelt.
Alle Seren bei -70 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert wurden. Western-Blot
Proteine ​​aus Gelen auf Nitrocellulosemembranen elektrotransferiert wurden (Bio-Rad), wie an anderer Stelle beschrieben [12]. Die Membranen wurden blockiert mit 5% Milch in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Blockierungspuffer) über Nacht inkubiert Mager (ON) mit verdünntem Maus-Seren (1/100 in Blockierungspuffer) bei Raumtemperatur (RT) gespült, in PBS mit 0,3% Tween-20 (Waschpuffer) versetzt und 1 h bei RT inkubiert, mit stabilisiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem (1/1000 in Blockierungspuffer, Pierce, Rockford, IL, USA). Nach einem Waschschritt in Waschpuffer, immunologischen Nachweis von Proteinen wurde durch verstärkte Chemilumineszenz-Detektion Supersignal West-Dura Erweiterte Dauer Substrat (Pierce) durchgeführt. Proteinmuster wurden gescannt und digitalisiert das VersaDoc Imaging System verwenden. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.
In-Gel-Proteinverdauung und massenspektrometrische Identifizierung
In-Gel-Verdauung von Proteinen durchgeführt wurde, wie von Cheung et al. [13]. Vor der Massenspektrometrie die isolierten Peptide wurden auf einem U3000 Nano-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) getrennt, wie zuvor beschrieben [14].
Identifizierung der Peptide durchgeführt wurde, ein Elektro mit Ionisierung Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA), wie zuvor beschrieben [14]. Die Datenanalyse wurde gegen das Protein-Datenbank Helicobacter durchgeführt von NCBI (146 612 Einträge) mit Hilfe der In-House-Suchmaschine Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, London, UK). Eine fehlertolerante Suche mit carbamidomethyl (C) als feste Modifikation durchgeführt. Carbamidomethyl (N-terminal) und Oxidation (M) als variable Modifikationen eingestellt. Peptidmassentoleranz und Fragmentmassentoleranz wurde bei 0,35 Da und 0,45 Da jeweils eingestellt. Maximal zwei miscleavages durften. Die Proteine ​​wurden als nur richtig kommentierten werden, wenn die Bedeutung lag unter 0,05 (p
< 0,05) und mindestens ein Peptid bestanden die erforderlichen fetten roten Kriterien von Mascot Daemon, was darauf hinweist, dass mindestens ein Peptid hatte Rang 1 und eine Bedeutung unter 0,05.
Eindimensionale Gelelektrophorese (1D-PAGE) und Western-Blot von rUreB
1D-PAGE von 10 ug rekombinanten H. suis
Urease-Untereinheit B (rUreB) wurde von Van Steendam wie beschrieben durchgeführt et al. [12]. Sera Vorbereitung und Western-Blot-Analysen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Die protektive Wirksamkeit von rekombinantem H. suis
Proteine ​​in einem Mausmodell
Herstellung von rekombinanten UreB
Ein Fragment, das für die H. suis
Verwendung einer Pwo-Polymerase mit Korrekturleseaktivität (Roche, Mannheim, Deutschland) aus der DNA von HS5 (Vorwärtsprimer UreB Sequenz (GenBank Locus tag HSUHS5_0285) wurde durch PCR amplifiziert: 5 'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 '; Reverse-Primer: 5' CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC-3 ') und in das Protein-Expressionsvektor pET-24d kloniert. Die rUreB wurde in E. coli-Stamm
BL21 (DE3) exprimiert. Die Zellen wurden durch Beschallung (5 mal für 30 s) in Puffer, enthaltend 50 mM Na.PO 4 pH7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 und 1 mM PMSF lysiert. Nach Zentrifugation (4 ° C, 20 000 g
für 30 min), rUreB wurde aus der löslichen Fraktion unter Verwendung von Ni-Affinitätschromatographie gereinigt in Puffer, bestehend aus 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM Imidazol und 10% Glycerin (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Schweden), gefolgt von Gelfiltration auf einer Superdex ™ 200 HR 16/60 Säule (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Nach der Reinigung wurde rUreB analysiert SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-Hexahistidin-Tag monoklonalen Maus-Antikörper (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estland) mit. Das Detergens Triton X-100 wurde aus dem gereinigten rUreB entfernt durch Verwendung von Pierce Detergensentfernung Spin-Säulen (Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Proteinkonzentration wurde mit dem RC-DC
Protein-Assay (Bio-Rad).
Herstellung von rekombinanten NAPA bestimmt
Das Protein in das Expressionssystem mit Gateway® Technologie (Invitrogen
E. coli exprimiert wurde, Carlsbad, CA, USA) wie folgt. Ein Fragment, das den H. suis kodiert,
Neutrophilen-Aktivierung eines Pwo-Polymerase mit Korrekturleseaktivität (Roche) von der DNA von HS5 (Vorwärtsprimer-Protein A (NAPA) Sequenz (GenBank Locus tag HSUHS5_0014) durch PCR amplifiziert: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; Reverse-Primer: 5' TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3 ') und kloniert in die pENTR ™ /TEV /D-TOPO-Vektor und in das pDEST17 ™ Zielvektor. Die ausgewählte pDEST17-NAPA Plasmid wurde in den BL21-AI ™ E. coli
transformiert und anschließend bei 37 ° C bis zu einer OD 600 von 0,6-1,0 in Luria Broth, supplementiert mit 50 ug /ml Carbenicillin gezüchtet. Rekombinante H. suis
NAPA (rNapA) Expression wurde durch Zugabe von 0,2% L- Arabinose induziert. Nach 4 h Inkubation bei 37 ° C wurden die Zellen geerntet und in Lysepuffer: 50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml Lysozym, 20 ug /ml DNAse, 1 mM Protease-Inhibitor (Sigma) und 1 mM MgCl 2. Die Zellen wurden durch Beschallung (5 mal für 30 s) lysiert. Zelltrümmer und Einschlußkörper wurden durch Zentrifugation bei 4 ° C (20 000 g
für 30 min) isoliert. Die Einschlusskörper wurden zweimal gewaschen, anschließend basierend auf dem folgenden Protokoll: Das Pellet wurde in kaltem Lysepuffer resuspendiert, beschallt 5 mal für 30 s, gefolgt von Zentrifugation (4 ° C, 20 000 g
für 30 min). Die gewaschenen Einschlusskörper wurden in Bindungspuffer solubilisiert, pH 8 (6M Guanidinium-HCl, 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 5 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptomethanol) durch sanfte Rotation für 1 h bei RT. Unlösliches Material wurde bei 4 ° C (30 min 100 000 g
) durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation entfernt. rNapA wurde aus dem geklärten Überstand auf eine Ni-Sepharose-Säule gereinigt (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) gemäß den Anweisungen des Herstellers. rNapA wurde mit Elutionspuffer, pH 8 (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M Imidazol und 1 mM β-Mercaptoethanol) eluiert und gegen PBS dialysiert ON bei 4 ° C. Danach wurde rNapA SDS-PAGE und Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) verwendet wird.
Immunization und Infektionsexperimente
Der Versuchsaufbau in Fig zusammengefasst 1. Fünf Gruppen von 10 Mäuse wurden intranasal zweimal mit 3 Wochen Abstand mit jeweils 17,5 &mgr; l Inokulum inokuliert. In den Gruppen 1, 2 und 3 bestand das Inokulum von HBSS mit 5 &mgr; g CT, enthaltend 30 &mgr; g rUreB, 30 ug und 100 ug rNapA HS5 Lysat, respectively. Gruppen 4 (Sham-immunisierten Gruppe) und 5 (negative Kontrollgruppe) wurden mit HBSS impft. Drei Wochen nach der zweiten intranasale Immunisierung wurde Blut durch Schwanz gesammelt von fünf Tieren pro Gruppe Blutungen und eine Woche später, alle Tiere, mit Ausnahme der negativen Kontrollgruppe wurden intragastrically mit 200 ul Brucella-Brühe bei pH geimpft 5, die 10 8 lebensfähigen H. suis
Bakterien [11]. Die negative Kontrollgruppe wurde intragastrisch mit 200 ul Brucella-Brühe bei pH5 inokuliert. Vier Wochen nach der intragastrischen Inokulation wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation folgenden Isofluran-Narkose eingeschläfert (ISOFLO; Abbott, IL, USA). Aus den euthanasiert Tieren wurde Blut durch Herzpunktur sterile, zentrifugiert (1000 g
, 4 ° C, 10 min) und das Serum wurde gefroren bei -70 ° C bis zur weiteren Verwendung gesammelt. Mägen wurden entlang der großen Kurvatur ausgeschnitten und präpariert. Eine Hälfte der Mägen, einschließlich Antrum und Fundus, wurde sofort platziert in 1 ml RNA Later (Ambion, Austin, TE, USA) und bei -70 ° C für weitere RNA- und DNA-Extraktion. Ein Längsstreifen des Magengewebe wurde von der Speiseröhre zum Duodenum entlang der größeren Krümmung für eine histopathologische Untersuchung schneiden. Abbildung 1 Experimentelles Design der Impfung Studie. Pro Gruppe 10 Mäuse wurden intranasal zweimal mit 3 Wochen Abstand, jedes Mal mit 30 ug rUreB + 5 &mgr; g Cholera-Toxin (CT) immunisiert; 30 ug rNapA + 5 &mgr; g CT und 100 &mgr; g Lysat HS5 + 5 &mgr; g CT (Gruppen 1, 2 bzw. 3). Gruppen 4 (Sham-immunisierten Gruppe) und 5 (negative Kontrollgruppe) wurden intranasal mit HBSS impft. Drei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde Blut aus 5 Mäusen pro Gruppe gesammelt und eine Woche später Mäuse der Gruppen 1, 2, 3 und 4 wurden intragastral mit 108 lebensfähigen H. suis
Bakterien inokuliert. Gruppe 5 wurde intragastrically mit HBSS impft. Vier Wochen nach der intragastrischen Herausforderung wurden die Mäuse euthanasiert.
Quantifizierung von H. suis
im Magen
Nach dem Auftauen Magengewebe wurden homogenisiert (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Deutschland) in 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Niederlande) und DNA wurde aus der internationalen und der organischen Phase extrahiert nach Tri Reagent® RT Anweisungen des Herstellers. Die bakterielle Belastung im Magen wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen H.
spezifische quantitative real-time PCR (qPCR) suis [5].
Analyse von Magen Zytokinantwort
Die Expression von IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 und TNF-α wurden mittels qPCR beurteilt cDNA aus Magengewebe synthetisiert unter Verwendung von wie zuvor beschrieben [15]. Die Schwellenzyklus (Ct) -Werte wurden normalisiert auf das geometrische Mittel der Ct-Werte von den Referenzgenen nach der mRNA-Spiegel normalisiert wurden die 2 berechnet -ΔΔCt-Methode [16].
Messung des Serum-Antikörper-Antworten durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
das Protein Detector ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) wurde verwendet rUreB-, rNapA- und HS5 Lysat spezifischen IgG im Serum zu untersuchen. Kurz gesagt, 96-Well-Platten mit flachem Boden (Nunc MaxiSorp, Nunc Nalge Int., Rochester, NY, USA) wurden mit 2 &mgr; g /Vertiefung von gereinigtem rNapA, 1 ug /Vertiefung von gereinigtem rUreB oder 1 ug /Vertiefung von H. suis
gesamten Zellproteine ​​in 100 &mgr; l Beschichtungspuffer verdünnt (24 h, 4 ° C). Nach dem Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin in PBS, 100 &mgr; l von 1/400 verdünnten Serums zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach weiterem Waschen wurden 100 &mgr; l HRP-markiertes anti-Maus-IgG (H + L) in einer Endkonzentration von 50 ng pro Vertiefung zugegeben. Fünf Minuten nach der Zugabe von 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) Peroxidase-Substratlösung, die Extinktion wurde bei 405 nm gelesen (OD 405 nm).
Histopathologische Untersuchung
die Längsmagengewebestreifen wurden in 4% Formaldehyd fixiert phosphatgepufferter, durch Standardverfahren verarbeitet und in Paraffin eingebettet. Zur Beurteilung der Gastritis, Hämatoxylin - Eosin (HE) gefärbten Schnitten von 5 &mgr; m wurden blind auf den Grad Erzielte basiert Lymphozyten, Plasmazellen und Neutrophile, mit einer visuellen Analogskala ähnlich dem Aktualisiert Sydney-System (auf einer Skala von 0- infiltrieren 3) [17] mit den folgenden Spezifikationen für jede Gastritis Punktzahl: 0 = keine Infiltration von mononukleären und /oder polymorphkernige Zellen; 1 = schwach diffuse Infiltration von mononukleären und /oder polymorphkernige Zellen; 2 = moderate diffuse Infiltration von einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen und /oder das Vorhandensein von einem oder zwei Entzündungs ​​Aggregate; 3 = ausgeprägt diffuse Infiltration von einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen und /oder das Vorhandensein von mindestens drei Entzündungs ​​Aggregate. Statistical analysis
Normality und Varianzhomogenität Daten
analysiert wurde unter Verwendung D'Agostino-Pearson und Shapiro- Wilk Normalitätstest. Signifikante Unterschiede in H. suis
Kolonisierung und mRNA Cytokin-Expression zwischen den Gruppen wurden durch Ausführen einer Analyse one-way ANOVA bewertet. Bonferroni-Mehrfachvergleichstest wurde als post-hoc verwendet, wenn gleiche Varianzen beurteilt. Dunnetts T3 post-hoc-Test wurde verwendet, wenn keine gleichen Varianzen bewertet wurden. OD 405nm Ebenen von ELISA und histologische Entzündung Werte wurden im Vergleich von Kruskall-Wallis-Analyse, gefolgt von einem Mann-Whitney U
Test. Für Korrelationen zwischen den verschiedenen Variablen, Spearman-rho Koeffizient (ρ
) berechnet. GraphPad Prism5 Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) wurde für alle Analysen verwendet. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p <
betrachtet; 0.05.
Ergebnisse

• Charakterisierung von Genexpressionsprofilen für unterschiedliche Arten von Mastzellen aus gepoolten Maus Magen Subregionen durch eine RNA-Amplifikation method
• Clinicopathological Merkmale und prognostische Analyse von Lauren Einstufung in Adenokarzinom des Magens in China