Immunisering med immunodominant Helicobacter suis urease subenhet B induserer delvis beskyttelse mot H. suis infeksjon i en mus model

immunisering med immunodominant Helicobacter suis
urease subenhet B induserer delvis beskyttelse mot H. suis
infeksjon i en musemodell
Abstract
Helicobacter product: (H.
) suis
er et svin og menneskelig gastric patogen. Tidligere studier i mus viste at en H. suis
infeksjon ikke fører til beskyttende immunitet, mens immunisering med H. suis
hel-celle-lysat (lysat) beskytter mot en etterfølgende eksperimentell infeksjon. Derfor er to-dimensjonal gelelektroforese av H. suis
proteiner ble utført, etterfulgt av immunblotting med oppsamlet serum fra H. suis Z - infiserte mus eller mus immunisert med lysat. Svak reaktivitet mot H. suis
proteiner ble observert i post-infeksjon sera. Sera fra lysat-immuniserte mus viste imidlertid immunoreaktivitets mot totalt 19 protein spots som ble identifisert ved hjelp av LC-MS /MS. Den H. suis
urease subenhet B (UreB) viste størst reaktivitet mot sera fra lysat-immuniserte mus og ble ikke oppdaget med serum fra infiserte mus. Ingen av de samlede sera oppdaget H. suis
neutrofilaktiverende protein A (NAPA). Den beskyttende effekten av intranasal vaksinering av BALB /c mus med H. suis
UreB og Napa, både rekombinant uttrykt i Escherichia coli plakater (rUreB og rNapA, henholdsvis), ble sammenlignet med den til H. suis
lysat. Alle vaksiner inneholdt choleratoxin som adjuvans. Immunisering av mus med rUreB og lysat induserte en signifikant reduksjon av H. suis
koloniseringen sammenlignet med ikke-vaksinert H. suis
-infected kontroller, mens rNapA hadde ingen signifikant beskyttende effekt. Sannsynligvis en kombinasjon av lokale Th1 og Th17 respons, supplert med antistoffrespons spille en rolle i den beskyttende immunitet mot H. suis
infeksjoner.
Innledning
Helicobacter product: (H.
) suis
er en verdensomspennende spredning patogen, hovedsakelig kolon griser. En infeksjon med gramnegative bakterien har vært forbundet med sår i mage ikke-kjertel mucosa [1, 2] og forårsaker gastritt og redusert daglig vektøkning [3] i griser. H. suis
er også de mest utbredte ikke-Helicobacter pylori Helicobacter
arter hos mennesker som lider av mage lidelser [2] og griser kan tjene som en kilde til H. suis
infeksjoner for mennesker [2, 4 ]. Kontroll av H. suis
infeksjoner med antibiotika-basert terapi er ikke anbefalt delvis på grunn av økt risiko for å utvikle ervervet antibiotikaresistens hos H. suis
stammer og i bakterier som tilhører den normale svin microbiota [5]. Immunisering mot H. suis
kan derfor representere et verdifullt alternativ. Opp til nå, men få studier har jobbet med vaksinasjon mot denne svin og zoonotiske patogen.
Tidligere studier i en musemodell viste at en H. suis
infeksjon ikke fører til beskyttende immunitet, mens vaksinasjon basert på homolog (H. suis
) eller heterologe (H. bizzozeronii
eller H. cynogastricus
) hel-celle lysate induserte en reduksjon eller fullstendig klarering av mage kolonisering med H. suis product: [6]. Imidlertid har bruken av denne type av vaksiner ulemper, blant annet den arbeidskrevende in vitro dyrking av H. suis
, noe som resulterer i vanskeligheter med å frembringe tilstrekkelig antigen. Dessuten kan hel-cellelysater inneholde både beskyttende antigener og antigener undertrykke beskyttelse [7]. En effektiv subenhet vaksine kan være et nyttig alternativ for kontroll av H. suis
infeksjoner. Immunoproteomics er en passende tilnærming for rask identifisering av kandidat proteiner for vaksinasjon, og har blitt anvendt for å studere og utvikle subenhetvaksiner for et bredt spekter av patogener [8].
Det var målet for foreliggende studie for å velge H. suis
proteiner som kan indusere beskyttende immunitet mot H. suis
infeksjon. Derfor, H. suis
proteiner som blir gjenkjent av sera fra mus immunisert med H. suis
hel-celle-lysat og beskyttet mot infeksjon, ble identifisert ved hjelp av to-dimensjonale (2D) gelelektroforese etterfulgt av immunblotting og LC-MS /MS. Sera fra H. suis Z - infiserte mus ble også inkludert, siden en infeksjon ikke resulterer i beskyttelse. Basert på denne analysen, immunoreactive H. suis
urease subenhet B (UreB) ble valgt for videre in vivo testing. Som en kontroll vi tatt fra H. suis
nøytrofil-aktiverende protein A (NAPA), som tidligere er blitt beskrevet som en mulig virulens faktor [9], men ble ikke gjenkjent av sera fra mus immunisert med hel-celle-lysat. Deretter beskyttelseseffekten mot en H. suis
infeksjon i begge subunitvaksiner ble evaluert og sammenlignet med den til H. suis
lysat i en standardisert musemodell Materials.
Og metoder
bakteriestamme
I alle forsøkene, H. suis
stamme 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) ble anvendt. Denne stamme ble isolert fra gastrisk mucosa av en pigg i henhold til metoden beskrevet av Baele et al. [10]. For Dyr
En uke før initiering av forsøkene, fem uker gamle spesifikt patogen -Gratis kvinnelige BALB /c-mus ble hentet fra en autorisert oppdretter (Harlan, Horst, Nederland). Dyrene ble plassert på steriliserte trespon i filter topp bur. De ble matet med en autoklaveres kommersiell diett (TEKLAD 2018S, HARLAN) og mottatt autoklaveres vann ad libitum
. Alle laboratorie dyreforsøk ble godkjent av Animal Care og etikkomiteen ved Fakultet for veterinærmedisin, Ghent Universitet
. Immunoproteomics av ​​H. suis
To-dimensjonal elektroforese (2D-PAGE)
HS5 ble dyrket som tidligere beskrevet [11]. Bakterier ble høstet ved sentrifugering (5000 g
, 4 ° C i 10 minutter) og vasket fire ganger med Hanks balanserte saltløsning (HBSS). Totalt proteiner (både løselig og uløselig proteiner) ble hentet i to trinn ved hjelp av ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For å oppnå gode 2D-PAGE-resultatene, ble homogenatene behandlet med egnede tilsetningsstoffer (5 mg protease inhibitor cocktail, 1 pl DNAse I, 1 ul RNase A, 10 ul fosfatase-inhibitorer PP2 og PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) ). Til slutt ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved å bruke RC DC
proteinanalyse (Bio-Rad) og proteiner ble lagret ved -70 ° C inntil videre bruk. En samlet mengde av 100 ug av HS5 proteiner ble rehydrert i 200 ul rehydratisering buffer (7 M ureum, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% bærer amfolytt pH3-4, 100 mM ditiotreitol (DTT) og bromfenolblått). Prøvene ble passivt absorbert inn i et ReadyStrip (11 cm, pH 3 til pH 10, Bio-Rad) og isoelektrisk fokusering ble utført i en Protean IEF kammer (Bio-Rad) som tidligere beskrevet [12]. Etter isoelektrisk fokusering ble strimlene ekvilibrert i 15 minutter i 1,5% DTT i ekvilibreringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8 6 M urea, 20% glycerol, 2% SDS), fulgt av en annen ekvilibrering i 4% jodacetamid i ekvilibreringsbuffer. Gelelektroforese ble utført på en 10% Tris-HCl SDS-PAGE ved anvendelse av 150V i 30 minutter, etterfulgt av 200 V i 1 time. To geler ble kjørt i parallell: en var farget med Sypro® Ruby Protein Gel farging (Bio-Rad), mens den andre ble anvendt for immunblotting (se Western blotting beskrevet nedenfor). Før farging, ble gelene fiksert i 10% MeOH, 7% eddiksyre. Etter farging ble H. suis
proteiner visualisert ved hjelp av VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
Serum bassenger
Tre bassenger av musesera ble brukt i denne studien.

Sera fra mus immunisert med H. suis
hel-celle-lysat (heretter referert til som "lysat-immuniserte mus") (n
= 10). Disse dyrene ble inokulert intranasalt to ganger med tre ukers intervall med 100 ug HS5 lysat + 5 ug koleratoksin (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysat ble fremstilt som beskrevet tidligere, men uten endelig filtrering av supernatanten [6]. Tre uker etter den siste immunisering ble blod samlet og sera ble slått sammen. Dette immunisering protokollen har vist seg å være (delvis) beskyttende mot H. suis
utfordring [6] og den beskyttende effekten ble bekreftet her i et innledende forsøk (data ikke vist).

Sera fra H. suis
-infected mus (heretter referert til som "infiserte mus") (n
= 10). Disse dyrene ble inokulert intragastrisk med 200 ul Brucella medium ved pH 5, inneholdende 10 ^{8 nylagede H. suis
bakterier [11]. Fire uker etter infeksjon, ble blod samlet og sera ble slått sammen.}

Sera fra negative kontrollmus (n =
10). Disse dyrene fikk HBSS intranasalt to ganger med en tre ukers intervall etterfulgt av intragastrisk inokulering med 200 mL Brucella buljong ved pH 5 (4 uker etter siste humbug immunisering). Etter fire uker ble blod samlet og sera ble slått sammen.
Alle sera ble lagret ved -70 ° C inntil videre anvendelse.
Western blotting
Proteinene ble elektrooverført fra gelene til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad) som beskrevet andre steder [12]. Membranene ble blokkert i 5% skummet melk i fosfatbufret saltvann (PBS) (blokkeringsbuffer), inkubert over natten (ON) med fortynnet musesera (1/100 i blokkeringsbuffer) ved romtemperatur (RT), skylt i PBS med 0,3% Tween-20 (vaskebuffer) og inkubert i 1 time ved RT med stabilisert geit-anti-mus-immunoglobulin G (IgG) pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert (1/1000 i blokkeringsbuffer, Pierce, Rockford, IL, USA). Etter et vasketrinn i vaskebuffer, ble immundeteksjon av proteiner utføres av forbedret kjemiluminescens deteksjon ved hjelp Supersignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Pierce). Protein mønstre ble skannet og digitalisert ved hjelp av VersaDoc Imaging System. Alle forsøk ble utført in triplo.
In-gel protein fordøyelse og identifikasjon ved massespektrometri
In-gel fordøyelse av proteiner ble utført som beskrevet av Cheung et al. [13]. Før massespektrometri de isolerte peptider ble separert på en U3000 nano-væskekromatografi (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) som tidligere beskrevet [14].
Identifikasjon av peptidene ble utført ved bruk av en elektro ionisering kvadrupol time-of-flight massespektrometri (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) som beskrevet tidligere [14]. Dataanalyse ble utført mot Helicobacter
protein database fra NCBI (146 612 oppføringer) ved hjelp av in-house søkemotor Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, London, UK). En feil tolerant søk ble utført med carbamidomethyl (C) som fast modifikasjon. Carbamidomethyl (N-terminal) og oksidasjon (M) ble satt som variable modifikasjoner. Peptide masse toleranse og fragment massen toleranse ble innstilt på 0,35 og 0,45 Da Da, respektivt. Maksimalt to miscleavages ble tillatt. Proteiner ble bare anses å være korrekt anmerkes når betydningen var under 0,05 (p
< 0,05) og minst ett peptid bestått de nødvendige kraftige røde kriterier fra Mascot demon, hvilket indikerer at i det minste ett peptid hadde rang 1 og et betydning under 0,05.
En-dimensjonal gelelektroforese (1D-PAGE) og Western blotting av rUreB
1D-PAGE på 10 ug rekombinant H. suis
urease subenhet B (rUreB) ble utført som beskrevet av Van Steendam et al. [12]. Sera forberedelse og Western blot analyser ble utført som beskrevet ovenfor.
Den beskyttende effekten av rekombinant H. suis
proteiner i en musemodell
Utarbeidelse av rekombinant UreB
Et fragment som koder H. suis
UreB sekvens (GenBank locus tag HSUHS5_0285) ble amplifisert ved PCR ved hjelp av en Pwo polymerase med korrekturlesing aktivitet (Roche, Mannheim, Tyskland) fra DNA av HS5 (forover primer: 5'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 '; reverse primer: 5'CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3') og klonet inn i protein uttrykk vektor Dyre 24d. Den rUreB ble uttrykt i E. coli
stammen BL21 (DE3). Cellene ble lysert ved sonikering (5 ganger i 30 sek) i buffer inneholdende 50 mM Na.PO 4 pH 7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 og 1 mM PMSF. Etter sentrifugering (4 ° C, 20 000 g
i 30 min), ble rUreB renset fra den løselige fraksjon ved hjelp av Ni-affinitetskromatografi i buffer bestående av 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidazol og 10% glyserol (Hans GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige) etterfulgt av gelfiltrering på en Superdex ™ 200 HR 16/60 kolonne (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Etter rensing ble rUreB analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blot analyse ved hjelp av anti-hexahistidine-tag monoklonalt antistoff (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estland). Vaskemiddelet Triton X-100 ble fjernet fra den rensede rUreB ved hjelp Pierce Vaskemiddel Fjerning Spin kolonner (Pierce) etter produsentens anvisninger. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med RC DC
protein analyse (Bio-Rad).
Utarbeidelse av rekombinant Napa
protein ble uttrykt i E. coli
Expression System med Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som følger. Et fragment som koder for H. suis
nøytrofil-aktiverende protein A (NAPA) sekvensen (GenBank locus tag HSUHS5_0014) ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av Pwo polymerase et med korrekturlesing aktivitet (Roche) fra DNA fra HS5 (forover primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; revers primer: 5'-TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') og klonet inn i pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vektor og overført til pDEST17 ™ destinasjonsvektor. Den valgte pDEST17-NAPA plasmid ble transformert til den BL21-AI ™ E. coli
og deretter dyrket ved 37 ° C til en OD 600 av 0,6-1,0 i Luria-medium supplert med 50 ug /ml karbenicillin. Rekombinant H. suis
Napa (rNapA) uttrykk ble indusert ved å tilsette 0,2% L- arabinose. Etter 4 timer inkubasjon ved 37 ° C ble cellene høstet og resuspendert i lyseringsbuffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lysozym, 20 mikrogram /ml DNAse, 1 mM protease inhibitor (Sigma) og 1 mM MgCl 2. Cellene ble lysert ved sonikering (5 ganger i 30 s). Cellerester og inklusjonslegemer ble isolert ved sentrifugering ved 4 ° C (20 000 g
i 30 min). Inklusjonslegemene ble deretter vasket to ganger på grunnlag av den følgende protokoll: pelleten ble resuspendert i kald lyseringsbuffer, ultralydbehandlet 5 ganger i 30 sekunder, etterfulgt av sentrifugering (4 ° C, 20 000 g
i 30 min). De vaskede inklusjonslegemer ble solubilisert i bindingsbuffer, pH 8 (6M guanidium HCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM β-merkaptometanol) ved forsiktig rotering i 1 time ved RT. Uoppløselig materiale ble fjernet ved høyhastighetssentrifugering ved 4 ° C (100 000 g
i 30 min). rNapA ble renset fra avklart supernatanten på en Ni-sepharose kolonne (Hans GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) i henhold til produsentens instruksjoner. rNapA ble eluert med elueringsbuffer, pH 8 (8M urea, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazol, og 1 mM β-merkaptoetanol) og PÅ dialysert mot PBS ved 4 ° C. Etterpå rNapA ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av RC DC
proteinanalyse (Bio-Rad).
Immunisering og smitteforsøk
Det eksperimentelle oppsettet er oppsummert i figur 1. Fem grupper av 10 mus ble inokulert intranasalt to ganger med 3 ukers intervaller, hver gang med 17,5 ul inokulum. I gruppene 1, 2 og 3 inokulum besto av HBSS med 5 ug CT, inneholdende 30 ug rUreB, 30 ug rNapA og 100 ug HS5 lysat, respektivt. Grupper 4 (sham-immuniserte gruppen) og 5 (negativ kontrollgruppe) ble inokulert med HBSS. Tre uker etter den andre intranasal immunisering ble blod oppsamlet fra hale blødning fra fem dyr pr gruppe og en uke senere, alle dyrene, bortsett fra den negative kontrollgruppe ble inokulert intragastrisk med 200 ul Brucella medium ved pH 5 inneholdende 10 8 levedyktige H. suis
bakterier [11]. Den negative kontrollgruppe ble inokulert intragastrisk med 200 mL Brucella buljong på pH5. Fire uker etter intragastrisk inokulasjon, ble musene avlivet ved halshugging følgende isoflurananestesi (IsoFlo; Abbott, IL, USA). Fra avlives dyrene, ble blod oppsamlet ved steril hjertepunktur, sentrifugert (1000 g
, 4 ° C, 10 min) og serum ble frosset ved -70 ° C inntil videre anvendelse. Magene ble skåret ut og dissekert langs den store kurvatur. Halvparten av magesekkene, herunder antrum og fundus, ble umiddelbart plassert i 1 ml RNA Senere (Ambion, Austin, TE, USA) og lagret ved -70 ° C i ytterligere RNA- og DNA-ekstraksjon. En langsgående strimmel av gastrisk vev ble kuttet fra spiserøret til tolvfingertarmen langs den store kurvatur for histopatologisk undersøkelse. Figur 1 Eksperimentell design av vaksinasjon studien. Pr gruppe 10 mus intranasalt immunisert to ganger med 3 ukers intervaller, hver gang med 30 ug rUreB + 5 ug koleratoksin (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT, og 100 ug HS5 lysat + 5 ug CT (grupper 1, 2 og 3, henholdsvis). Grupper 4 (sham-immuniserte gruppen) og 5 (negativ kontrollgruppe) ble intranasalt inokulert med HBSS. Tre uker etter den andre immunisering ble blod oppsamlet fra 5 mus pr gruppe og en uke senere mus i grupper 1, 2, 3 og 4 ble intragastrisk inokulert med 108 levedyktige H. suis
bakterier. Gruppe 5 ble intragastrisk inokulert med HBSS. Fire uker etter intragastrisk utfordringen ble musene avlivet.
Kvantifisering av H. suis
i magen
Etter tining ble mage vevene homogenisert (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Tyskland) i 1 ml tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Nederland) og DNA ble ekstrahert fra det internasjonale og organisk fase i henhold til Tri Reagent® RT produsentens instruksjoner. Den bakteriemengde i magen ble bestemt ved anvendelse av den tidligere beskrevne H. suis
bestemt kvantitativ real-time PCR (qPCR) [5].
Analyse av mage cytokinrespons
Uttrykket nivåene av IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 og TNF-α ble vurdert ved hjelp av qPCR cDNA syntetisert fra mage vev som tidligere beskrevet [15]. Terskelen syklus (CT) verdier ble normalisert til det geometriske gjennomsnittet av CT-verdier fra referanse gener etter som normalisert mRNA nivåer ble beregnet ved hjelp av to -ΔΔCt metoden [16].
Måling av serumantistoffresponser ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA)
Protein detektor ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) ble anvendt for å vurdere rUreB-, rNapA-, og HS5 lysat spesifikk IgG i serum. I korte trekk, ble 96 brønners flatbunnede plater (Nunc Maxisorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) belagt med 2 ug /brønn av renset rNapA, 1 mikrogram /brønn av renset rUreB, eller 1 mikrogram /brønn H. suis
fullcelle-proteiner fortynnet i 100 pl belegningsbuffer (24 timer, 4 ° C). Etter blokkering med 1% bovint serumalbumin i PBS, ble 100 ul av 1/400 fortynnet serum tilsatt til hver brønn. Etter ytterligere vasking, 100 ul av HRP-merket anti-mus IgG (H + L) i en endelig konsentrasjon på 50 ng pr brønn ble tilsatt. Fem minutter etter tilsetning av 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) peroksydasesubstrat oppløsning, absorbansen ble avlest ved 405 nm (OD 405 nm).
Histopatologisk undersøkelse
de langsgående strimler gastrisk vev ble fiksert i 4% fosfatbufret formaldehyd, behandles ved hjelp av standard prosedyrer og innstøpt i parafin. For evaluering av gastritt, haematoxylin - eosin (HE) fargede delene av 5 um ble blindt scoret basert på graden av infiltrerende lymfocytter, plasmaceller og neutrofiler, ved hjelp av en visuell analog skala lik den Oppdatert Sydney System (på en skala fra 0- 3) [17] med de følgende spesifikasjoner for hver gastritt Resultat: 0 = ingen infiltrering av mononukleære og /eller polymorfonukleære celler; 1 = mild diffus infiltrering av mononukleære og /eller polymorfonukleære celler; 2 = moderat diffus infiltrering av mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelsen av en eller to inflammatoriske aggregater; 3 = markert diffus infiltrering av mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller nærværet av minst tre inflammatoriske aggregater.
Statistisk analyse
Normalitet og variansen homogenitet av data ble analysert ved hjelp av D'Agostino-Pearson og Shapiro- Wilk normalitet test. Signifikante forskjeller i H. suis
kolonisering og mRNA cytokin uttrykk blant grupper ble vurdert ved å utføre enveis ANOVA analyse. Bonferroni multiple sammenligningstest ble anvendt som post-hoc da like store avvik ble bestemt. Dunnetts T3 post-hoc test ble brukt når ingen like avvik ble vurdert. OD 405nm nivåer fra ELISA og histologiske betennelse score ble sammenlignet med Kruskall-Wallis analyse, etterfulgt av en Mann-Whitney U
test. For sammenhenger mellom ulike variabler, ble Spearmans rho koeffisient (ρ
) beregnet. GraphPad Prism5 programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ble brukt for alle analyser. Statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene ble vurdert på p
< 0.05.
Resultater
Immunoproteomics av ​​H. suis
H. suis
proteiner ble separert på 2D-PAGE (figur 2a). Etter 2D-immunblotting med sammenslåtte sera fra lysat-vaksinert (figur 2b) eller H. suis
-infected dyr (figur 2c), ble totalt 19 immunreaktive protein flekker valgt. Disse stedene ble matchet med protein flekker som kan sees i parallell 2D-PAGE (figur 2a). Liten reaktivitet mot H. suis
proteiner ble observert i sera etter infeksjon sammenlignet med den høye reaktivitet mot sera fra lysat-immuniserte mus. Når blot ble undersøkt med en pool av sera hentet fra negative kontroll mus, ble ingen spesifikke immunreaktive protein flekker oppdaget (Tilleggs fil1). Steder av interesse (n
= 19) ble kuttet ut av gelen, fordøyd og identifisert ved hjelp av LC-MS /MS-analyse. De detaljerte resultatene av disse proteiner er oppsummert i tabell 1. flekker med den høyeste reaktivitet (base 1 til 5) ble identifisert som UreB. H. suis
chaperonin GroEL, illustrert som flekker 9 og 10 på figur 2a, viste også sterk hybridisering med sera fra lysat-immunisert dyr. I tillegg sera fra lysat-immuniserte mus viste sterk reaktivitet mot urease tilbehøret protein (UreH) og urease subenhet A (urinstoff) (oppfattet 15. til 19.), som var mindre uttalt i den infiserte gruppen. Svak reaktivitet mot de store flagellin Flå (minutt: 11 til 13) var til stede i begge blot. Figur 2 H. suis 2D-proteom- profil (A) og Western-blots av et duplikat 2D-gel omsatt med samle sera av lysat-immuniserte mus (B) eller av H. suis -infected mus (C). 100 mikrogram av totalt protein ekstrakt av H. suis
ble separert ved 2D-elektroforese ved hjelp av lineær pH ​​3 to10 gradient i første dimensjon og 10% TrisHCl SDS-PAGE i andre dimensjon. De separerte proteiner ble påvist ved SYPRO®Ruby Protein farging. Eske områder angir hvor immunreaktive antigener ble skåret ut fra gelen og utsatt for LC-MS /MS. Identifiserte proteiner er angitt med spot tallene gitt i tabell 1. Bokser og tall i rødt ble identifisert som UreB. Plasseringen av molekylvekten (MW) er gitt på høyre side, og pH er gitt nederst.
Tabell 1 immunreaktive proteiner av H. suis identifisert ved LC-MS /MS
Spot no.1

Protein navn
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. matchet peptider Book Mascot score4
Cov. (%) 5
en
Urease subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
117
1589
72
2
Urease subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
80
1042
58
treonyl-tRNA syntetase
EFX41598
Thrs
6,34
69,315
7
186
60
3
Urease subenhet B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
80
903
46
4
Urease subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
5
Urease subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
6
30S ribosomalt protein S1
EFX42427
RPSA
8.29
64,051
23
625
28
Quinone-reaktivt Ni /Fe hydrogenase, stor subenhet
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
Urease av H. heilmannii
AAA65722
8.86
25,844
8
258
26
7
metyl-akseptere chemotaxis protein
EFX43528
7,1
48,907
35
905
50
8
Forlengelse faktor G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
Chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5.58
58,498
150
3085
78
10
Chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5.58
58,498
135
2647
73
Urease subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
29
756
47
12
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
57
1294
62
13
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
46
1085
63
Trigger faktor
EFX42378
tig

5.13
49,587
12
343
24
14
hydrogenase uttrykk /formasjon protein
EFX41790
hypB
5,59
27,617
15
314
35
nikotinat-nucleotide pyrophosphorylase
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25
7-alpha-hydroksysteroiddehydrogenase
EFX41880
6.62
28,246
6
186
24
konservert hypotetisk utskilt protein
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
Hypotetisk protein HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
Urease tilbehør protein
EFX42255
ureH <.no> 6,79
30,447
4
106
13
16
Urease subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
24
270
55
17
Urease subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
28
112
45
18
Urease subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
57
418
69
19
Urease subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
75
568
73
en Protein sted tilsvarende posisjon på gel og blotter ( se figur 2)
2NCBI product::.. National Center for Biotechnology Information
3 Teoretisk isoelektrisk punkt (pI) og molekylvekt (MW)
4 Helicobacter
data, Mascot score større. enn 40 er signifikant (p
≤ 0,05).
5% av proteinsekvensen som omfattes av peptidene identifisert.
bekreftelse av serum reaktivitet mot rUreB
fra 2D-analyse, UreB viste tydelig reaktivitet med sera fra lysat-immuniserte mus, som ikke ble observert i sera fra ikke-immuniserte, men infiserte mus. For å bekrefte disse data ble en 1D-PAGE lastet med rUreB utført, etterfulgt av immundeteksjon med sera fra lysat-immuniserte og H. suis
-infected mus. 0,01. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Karakterisering av genuttrykk profiler for ulike typer av mastceller sammenslåtte fra mus mageregioner av en RNA amplifiseringsmetode
• Clinicopathological egenskaper og prognostisk analyse av Lauren klassifisering i gastrisk adenokarsinom i Kina