Uttrycksprofilen för muciner (Muc2, MUC5AC och MUC6) i Helicobacter pylori infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel

Uttrycksprofilen för muciner (Muc2, MUC5AC och MUC6) i Helicobacter pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel Bild Sammanfattning
Bakgrund
Helicobacter pylori
(H. pylori
) orsakar gastrit och intestinal metaplasi (IM) som kan utvecklas till magcancer. Syftet med denna studie var att jämföra profilen muciner i progressiva stadier av H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel. Vi använde en panel av monoklonala antikroppar med väl definierade särdrag Muc2, MUC5AC och MUC6 att karakterisera uttrycksmönstret av muciner genom immunhistokemi.
Metoder
RUT och ELISA var ner för H. pylori
bekräftelse. Humana gastriska biopsi sektioner färgades med användning av immunhistokemi med Muc2, MUC5AC och MUC6 antikroppar.
Resultat
MUC5AC uttrycktes i den ytliga epitel och den övre delen av de gastriska gropar. MUC6 uttryck detekterades i den nedre delen av de gastriska körtlar. Muc2 uttrycktes i intestinal metaplasi, mestadels i bägarceller. Mucin uttrycksprofilen i de progressiva stadier av H. pylori
infekterade mänskliga gastric epitel möjliggör identifiering av intestinal metaplasi, som kännetecknas av en minskad expression av mag muciner (MUC5AC och MUC6) och de novo
uttryck av Muc2.
slutsats
Sammanfattningsvis våra resultat tyder på att det är förändrad expression av MUC5AC och MUC6 tillsammans med onormalt uttryck av Muc2 i intestinal metaplasi, under processen av gastric carcinogenesis. Den aktuella studien visar att Muc2 uttrycksmönster är en tillförlitlig markör för intestinal metaplasi, som förekommer i samband med H. pylori
infekterade individer.
Bakgrund
Helicobacter pylori
koloniserar människans magslemhinnan och orsakar gastrit och intestinal metaplasi (IM), som kan utvecklas mot magcancer [1-3]. H. pylori
infektion etablerades som en typ I cancerframkallande för människor i IARC [4]; Det visades nyligen att bakterierna är också kapabla att inducera gastrit, IM, och magcancer i mongoliska ökenråttor [5-8]. Hos människor, H. pylori
koloniserar också den duodenala slemhinnan när det finns gastric metaplasi [9]. H. pylori
infektion i människa är därför beroende av magsäckens mikro, som bestäms i stor utsträckning av mucin och kolhydratsammansättning av mag mucinskiktet.
Muciner är starkt glykosylerade glykoproteiner som är huvudkomponenterna i slemhinnor viskös gel som täcker ytan epitelvävnader [10]. Hittills nio distinkta epiteliala mucin gener (MUC1, 2, 3, 4, 5 ° C, 5B, 6, 7, och 8) har identifierats [11-21]. In situ
hybridisering och immunhistokemiska studier har visat att dessa muciner är differentiellt uttryckta i epitel med celltyp specificitet [21-24]. Den normala magslemhinna visar celltyper specifikt uttryck av MUC1, MUC5AC, och MUC6, med två första muciner som finns i den ytliga epitel och MUC6 i de djupa körtlar [22, 25, 26]. MUC6 uttrycks huvudsakligen i magslemhinnan. Den normala magslemhinna inte uttrycker Muc2 [25, 27].
Förändringar i expressionsnivåer och glykosyleringsmönster av muciner har associerats med flera sjukdomar, inklusive karcinom [27-31]. I magcancer, har förändringar i mucin polypeptid rapporterats: förlust av uttryck av MUC5AC [23, 26, 32], ökade mucin heterogenesity [23]. Dessa observationer antyder att mucin förändringar kan betraktas som "molekylära" markörer av malign transformation av magslemhinnan. Vidare, en nyligen publicerad undersökning föreslog starkt MUC5AC som en förmodad H. pylari
receptorn [33, 34].
I denna studie har vi karaktäriserat mönster av muciner uttryck i progressiva stadier av H. pylori
infected human gastrisk karcinom. Vi har använt en omfattande panel av monoklonala antikroppar, med väl karakteriserade specificiteter riktade mot Muc2, MUC5AC och MUC6 muciner.
Resultat
Expression mönster av Muc2, MUC5AC och MUC6 muciner i normalt magslemhinna
MUC5AC var starkt uttryckt i foveolar epitel och slem- hals celler av antrum (>. 75%, Fig 1b, fig. 3b; Tabell 2). Uttryck av MUC6 detekterades i körtlar i antrum (> 75%, fig 1c, fig. 3c,. Tabell 3) och Muc2 detekterades inte i normal magslemhinna (Fig 1a;. Fig. 3a; Tabell 2). Figur 1 Immunhistokemisk färgning av Muc2, MUC5AC och MUC6 muciner i H. pylori-infektion. en. Muc2 färgning av normal magslemhinna (Ursprunglig förstoring x 100). b. MUC5AC färgning av normal magslemhinna (Ursprunglig förstoring X 100). c. MUC6 färgning av normal magslemhinna (Ursprunglig förstoring x 100). d. Muc2 färgning av atrofisk gastrit (Ursprunglig förstoring x 100). e. MUC5AC färgning av atrofisk gastrit (Ursprunglig förstoring x 100). f. MUC6 färgning av atrofisk gastrit (Ursprunglig förstoring x 100). g. Muc2 färgning av Intestinal metaplasi (Original förstoring x 100). h. MUC5AC färgning av Intestinal metaplasi (Original förstoring x 100).
Figur 2 Immunhistokemisk färgning av Muc2, MUC5AC och MUC6 muciner i H. pylori infekterade patienter. en. MUC6 färgning av Intestinal metaplasi (Original förstoring x 100). b. Muc2 färgning av dysplasi (Ursprunglig förstoring x 100). c. MUC5AC färgning av dysplasi (Ursprunglig förstoring X 100). d. MUC6 färgning av dysplasi (Ursprunglig förstoring x 100). e. Muc2 färgning av karcinom (Ursprunglig förstoring x 100). f. MUC5AC färgning av karcinom (Ursprunglig förstoring X 100). g. MUC6 färgning av cancer (Original förstoring x 100).
Figur 3 Expression mönster av muciner (Muc2, MUC5AC och MUC6) i H. pylori infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel. en. Muc2 uttryck i H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel. b. MUC5AC uttryck i H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel. c. MUC6 uttryck i H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel.
Tabell 1 särdrag, ursprung och utspädningar av de monoklonala antikropparna.
monoklonala antikropp
specificitet
Referens
Utspädning
PMH1
Muc2
Reis et al
[11]
outspädd
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2 Review Tabell 2 Redovisning av muciner (Muc2, MUCSAC och MUC6) i H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel
Stages

H. pylori
Muc2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P -
+
++
+++
++++ -
+
++
+++
++++ -
+
+ +
+++
++++
Normal (n = 7) katalog 7 -
n = 7 (100%) -
-
- -
- Omdömen - -
n = 2 (28,6%) Review n = 5 (71,4%) Review - -
-
en (14,3%) Review 6 (85,7%) Review atrofisk gastrit (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%) Review n = 4 (15,4%) -
- -
- -
en (38%) Review 13 (50%) Review 12 (46,2%)
- -
en (3,8%) Review 15 (57,7%) Review 10 (38,5%) Review Intestinal metaplasi (n = 21) -
21
- -
n = 9 (42,9%) Review n = 12 (57,1%) ** -
-
en (4,8%) Review 16 ( 76,2%) **
4 (19%) Review - -
5 (23,8%) Review 14 (66,7%) **
2 (9,5%) Review -
dysplasi (n = 17) -
17 -
n = 5 (29,4%) Review n = 11 (64,7%) Review n = 1 (5.9 %) katalog - -
3 (17,6%) Review 10 (58,8%) Review 4 (23,5%) Review - -
3 (17,6%)
11 (64,7%) Review 3 (17,3%) -
cancer (n = 36) -
36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%) -
- -
28 (77,8%) Review 8 (22,2%) Review - -
12 (33,3% ) Review 17 (47,2%) Review 7 (19,4%) Review - -
N - negativ - (> 5%) negativa
P - positiv + (5-25%) några positiva celler
n - Antal fall ++ (25-50%) väldefinierade område
+++ (50- 75%) omfattande område färgas
++++ (75-100%) de flesta av cellerna färgade
** p < 0,00, * p < 0,05 (Signifikant skillnad i uttryck) Review Immunodetektion av muciner i atrofisk gastrit
Det fanns uttryck av MUC5AC i alla fall av kolonn celler (Fig 1e,. Fig. 3b, Tabell 2). Den procentuella andelen färgade celler varierade från fall till fall, i de flesta fall var det en trend för högre antal celler som uttrycker MUC5AC (> 75%) i den ytliga delen av metaplastiska körtlar än i djupa delen. MUC6 detekterades i kolonn celler (> 50%, 1F Fig Fig. 3c,. Tabell 2) och Muc2 påvisades inte i atrofisk gastrit (Fig 1d.) Review Immunodetektion av muciner i intestinal metaplasi Review där. minskades nivån uttryck av MUC5AC och MUC6 i alla de fall (> 50%), båda i bägare och i kolumnära celler (Fig 1h, Fig 2a;.... fig 3b, fig 3c; Tabell 2). Den procentuella andelen färgade celler varierade från fall till fall, var de novo
uttryck av intestinal mucin Muc2 observerats (> 75%), och dess uttryck visade en diffus cytoplasmisk mönster i bägarceller (Fig 1G;. Fig. 3a; . tabell 2) Review Immundetektion av muciner i dysplasi
Det minskade nivå uttryck av MUC5AC och MUC6, än intestinal metaplasi (> 50%). MUC5AC och MUC6 visas ett diffust cytoplasmatiskt uttrycksmönster i kolumnära celler (Fig 2c, fig. 2d, fig. 3d;. Fig. 3; Tabell 2). Muc2 uttryck visade en diffus cytoplasmisk mönster i bägare celler (> 50%, figur 2b, fig. 3a, tabell 2) Immunodetektion av muciner i cancer
MUC5AC och MUC6 uttryck
observerades ofta i början av cancer (>.; 50%) än avancerade karcinom (> 25%). I avancerade karcinom, observerade vi en trend för minskad immunoreaktivitet i djupa områden än i de ytliga områden. MUC5AC och MUC6 uttryck minskade i avancerade karcinom (> 25%, Fig 3a, Fig. 3b,. Fig. 3c, fig. 2e, Fig 2f, Fig 2g,.. Tabell 2).
Diskussion
i den nu aktuella studien har vi visat att mönstret av muciner uttryck i progressiva stadier av H. pylori
infekterade mänskliga gastric epitel. Muciner uttrycks med en cell- och vävnadsspecifikt mönster i normal vävnad. Förändringar i expressionsmönstret för muciner har beskrivits i karcinom såväl som i deras prekursor-lesioner; I det senare ändrade mucin kolhydrater och peptiddelar kan utgöra molekylära markörer för ökad risk för malign transformation [27, 35, 36, 38-40].
I överensstämmelse med tidigare studier rapporterar fördelningen av muciner i normal mage, vi fann MUC5AC uttrycks starkt i foveolar celler av antrum, som rapporterats [26, 27, 32, 37-39]. Vi fann också att MUC6 uttrycks i mukösa celler hos halszonen i pyloric körtlar i antrum med liknande mönster till det som beskrivits tidigare [22, 23, 47]. Expressionen av Muc2 var oftast detekterades inte i normal magslemhinna som beskrivits i de tidigare rapporter [25, 27, 40].
Intestinal metaplasi är en av de skador som fram i kaskaden av händelse som föregår utvecklingen av gastriskt karcinom [ ,,,0],41]. Intestinal metaplasi innefattar byte av magslemhinnan av ett epitel som liknar histologiskt tarmslemhinnan. Förändrade mucin uttrycksmönster har observerats i H. pylori
infekterade intestinal metaplasi, bland annat under uttryck av MUC5AC och MUC6 och de novo
uttryck av Muc2 mestadels i bägarceller [30, 48]. Dessa resultat stöder antagandet att intestinal metaplasi medför en differentiering av slemhinnan mot en tarm fenotyp [42, 43].
Minskat uttryck av MUC5AC och MUC6 mucin i gastriska karcinom bekräftades i den aktuella studien. Uttrycket av MUC5AC i början av gastric cancer i den nuvarande serien, oavsett den histologiska typen av tumörer, i kontrast till den minskade expression av MUC5AC immunoreaktivitet i nästan hälften av de avancerade karcinom som tyder på att alla gastric karcinom behålla åtminstone några celler med en gastric fenotyp under de första stegen av neoplastisk utveckling (26). Detta antagande stöds ytterligare av den minskade immunreaktivitet i djupa områden jämfört med ytliga områden av de avancerade karcinom. Dessa resultat överensstämmer med tidigare resultat som visar att magsäckscancer progression åtföljs av förändring av uttrycket av flera mucin gener [14]. Slutligen observerade vi att det intestinala mucin Muc2 uttrycks i varje intestinal metaplasi, vilket är en lesion som visas under processen av gastric karcinogenes i samband med H. pylori
infekterade individer.
Slutsats
Även H . pylori
har klassats som en klass i cancerframkallande ämne av IARC [4] mekanismen av gastric cancer förblir dåligt förstådd. I pre-neoplastisk magslemhinna, gjorde uttrycket av alla de tre mucin-antigener verkar inte korrelera med svårighetsgraden av inflammation och H. pylori
status. Resultaten från föreliggande studie kan tyda på att H. pylori-
infektion fungerar som en initiator av denna carcinogenes kaskad genom att inducera inflammation och, i vissa fall, den efterföljande metaplastisk förändring. Intestinal metaplasi åtföljs av induktion av uttryck Muc2 och minskat uttryck av MUC5AC och MUC6. Dessa förändringar kan gynna utvecklingen av magcancer. Den aktuella studien visar att Muc2 är en markör för intestinal metaplasi och kan användas för tidig upptäckt av denna skada i H. pylori
infekterade pre-neoplastisk human gastrisk epitel.
Material och metoder
vävnadsprover
Femtio nio gastric biopsiprover och 3 ml blod erhölls från Stanley medicinska högskolan och sjukhuset, Chennai. Alla biopsivävnadsprover samlades in efter informerat samtycke. Denna studie genomfördes efter att ha erhållit godkännande från etisk styrelse sjukhuset. Alla biopsiprov fixerades i 10% buffrad formalin och rutinmässigt inbäddad i paraffin. 4 um tunna seriesektioner skars och användes för immunohistokemi. H. pylori
smittan bekräftats av RUT och ELISA [43]. Hematoxylin och eosin färgade sektioner användes för att klassificera gastrit graderade enligt reviderade Sydney klassificering [44], gastriska tumörer enligt klassificeringen av Lauren [45] och WHO-klassificering [46]. Vi studerade 7 fall av normal mänsklig gastric epitel (7 biopsier), 26 fall av atrofisk gastrit (26 biopsier), 21 fall av intestinal metaplasi (21 biopsier), 17 fall av dysplasi (17 biopsier) och 36 fall av cancer i vilken 21 fall tidigt karcinom och 15 fall avancerat karcinom (16 biopsier och 20 kirurgiska prov).
monoklonala antikroppar Review, en panel av tre monoklonala antikroppar användes för att bestämma uttrycket av muciner (Muc2, MUC5AC och MUC6). Särdragen, referenser och utspädningar av antikropparna anges i tabell 1.
Immunohistokemi
Sektioner från normala, preneoplastiska och neoplastiska mag vävnader immun färgas enligt Reis et al
[47] med smärre ändringar . Sektioner tillverkade för neuraminidasbehandling tvättades två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 och inkuberas med neuraminidas från Clostridium perfringens typ VI
(Sigma; St. Louis, MO) utspätt i 0,1 M Na-acetat-buffert, pH 5,5 till en slutlig koncentration av 0,1 U /ml. Inkubationen genomfördes under 2 h vid 37 ° C och följdes av tre tvättningar i iskall PBS. Sektioner behandlades med 0,5% H 2O 2 i metanol under 30 min, följt av 20 minuters inkubering med kanin icke-immunserum. Sektioner sköljdes och inkuberades med primär antikropp (tabell 1), över natten vid 4 ° C. Sektionerna sköljdes och inkuberades med HRP conjucated kanin-anti-mus sekundär antikropp (1: 100 spädning) under 1 h följt av sköljning med PBS och framkallning med 0,05% 3,3'-diaminobensidin-tetrahydroklorid (DAB) (SRL, Bombay, Indien ) nygjord i PBS innehållande 0,1% H 2O 2. Sektioner motfärgades med hematoxylin, dehydratiserades och monterades. Alla serier inklusive positiva och negativa kontroller utfördes genom substitution av de primära mAb med immunoglobuliner av samma klass och vid samma koncentration.
Scoring av muciner uttryck i H. pylori
infekterade preneoplastiska och neoplastiska humana gastriska vävnader Review, en semi kvantitativ metod användes för att poängsätta immunfärgning av mänskliga gastric vävnader. Objektglasen undersöktes under ljusmikroskop, var varje 100-celler görs i fem olika områden och resultaten uttrycktes som medelvärde i procent. (-) Negativ; +, några positiva celler (< 25%); ++ Väldefinierade områden med positiva celler (25-50%); +++, stora områden med positiva celler (50-75%); ++++, de flesta celler färgade (> 75%). statistik
Dataanalys utfördes med hjälp av statistiskt programpaket SPSS 10,0 för Windows. Chi-Square test eller Fishers exakta test användes för att analysera skillnader i frekvenser. Spearmans korrelationstest användes för att analysera korrelationen mellan parametrarna. P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant
Förkortningar
DAB - 3:.
3'-diaminobensidin tetraklorid
ELISA:
Enzyme-linked immunosorbent analys
HRP:
pepparrotsperoxidas
IARC:
International Agency for Research on Cancer

IM:
Intestinal metaplasi
mAbs:
Monoklonala antikroppar
PBS:
Fosfatbuffrad saltlösning
WHO:
Världshälsoorganisationen
RUT.
Rapid Urea Test

förklaringar
Tack
författarna tackar Lady Tata Memorial Trust, Bombay, Indien för ekonomiskt stöd till en av författarna S. Durai Babu. Vi tackar Dr. Narasimhan, professor och chef, Department of Pathology, Sri Ramachandra medicinska högskolan och sjukhuset, Indien, för att granska de histologiska och immunohistokemiska resultat och Dr. R. Ravanan, Reader, Statistiska institutionen, Presidemcy College, Indien för att hjälpa i statistisk analys. Vi vill tacka Dr Celso A. Reis för tillhandahållande av den anti-Muc2, anti-MUC5AC och anti-MUC6 monoklonala antikroppar.
Författarnas ursprungliga inlämnade filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas original lämnat filer för bilder. 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 5

• Skillnader i magcancer genuttryck signaturer som härrör från laser capture microdissection versushistologic macrodissection
• Airway cellularitet, lipid lastat makrofager och mikrobiologi magsaft och luftvägar hos barn med refluxesofagit