Expressie profiel van mucinen (MUC2, MUC5AC en MUC6) in Helicobacter pylori geïnfecteerde pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel

Expressie profiel van mucinen (MUC2, MUC5AC en MUC6) in Helicobacter pylori
besmet pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel
Abstracte achtergrond
Helicobacter pylori
(H. pylori
) veroorzaakt gastritis en intestinale metaplasie (IM) die kunnen evolueren tot maagkanker. Het doel van deze studie was het profiel van mucinen in de opeenvolgende stadia van H. pylori geïnfecteerde vergelijken
pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel. We gebruikten een panel van monoklonale antilichamen met goed gedefinieerde specifieke kenmerken van MUC2, MUC5AC en MUC6 om de expressie patroon van mucinen karakteriseren door immunohistochemie.
Methoden
RUT en ELISA beneden voor H. pylori
bevestiging waren. Menselijke maag biopsie werden gekleurd met behulp van immunohistochemie MUC2, MUC5AC en MUC6 antilichamen.
Resultaten
MUC5AC werd uitgedrukt in de oppervlakkige epitheel en het bovenste deel van de maag pits. MUC6 expressie werd gedetecteerd in het onderste deel van de maag klieren. MUC2 werd uitgedrukt in intestinale metaplasie, meestal in slijmbekercellen. Het mucine expressieprofiel in de opeenvolgende stadia van H. pylori
geïnfecteerde menselijke maag epitheel maakt de identificatie van intestinale metaplasie, die wordt gekenmerkt door een verminderde expressie van de maag mucinen (MUC5AC en MUC6) en de novo expressie van
MUC2.
conclusie
Samenvattend, onze resultaten suggereren dat er samen wordt veranderde expressie van MUC5AC en MUC6 met de afwijkende expressie van MUC2 in intestinale metaplasie, tijdens het proces van de maag carcinogenese. Deze studie geeft aan dat de MUC2 mucine expressiepatroon is een betrouwbare marker van intestinale metaplasie, die in verband met H. pylori geïnfecteerde individuen
weergegeven. Achtergrond
Helicobacter pylori
koloniseert menselijke maagslijmvlies en veroorzaakt gastritis en intestinale metaplasie (IM), die kan evolueren naar maagcarcinoom [1-3]. H. pylori
infectie werd opgericht als een type I menselijk carcinogeen in IARC [4]; Het werd onlangs aangetoond dat de bacteriën zijn ook in staat tot het induceren gastritis, IM en maagcarcinoom in Mongoolse woestijnratten [5-8]. Bij mensen H. pylori
koloniseert eveneens de duodenale mucosa wanneer er gastrische metaplasie [9]. H. pylori
infectie bij mens is dus afhankelijk van de gastrische micro-omgeving die wordt bepaald grotendeels door de mucine en koolhydraat samenstelling van de gastrische mucine laag.
Mucinen zijn sterk geglycosyleerde glycoproteïnen die de belangrijkste bestanddelen van het slijmvlies viskeuze gel die het oppervlak epitheliale weefsels [10]. Tot op heden negen verschillende epitheliale mucine-genen (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7 en 8) zijn geïdentificeerd [11-21]. In situ hybridisatie en immunohistochemische
studies hebben aangetoond dat deze mucinen differentiële expressie in epitheel met celtype-specificiteit [21-24]. De normale maagslijmvlies toont celtypen expressie van MUC1, MUC5AC en MUC6, eerst twee mucinen in de oppervlakkige epitheel en MUC6 in de diepe klieren [22, 25, 26]. MUC6 voornamelijk in maagslijmvlies. De normale maagslijmvlies drukt niet MUC2 [25, 27].
Veranderingen in de expressieniveaus en glycosylatiepatronen van mucinen zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen, waaronder carcinomen [27-31]. Bij maagkanker, hebben veranderingen in mucine polypeptide gemeld: verlies van expressie van MUC5AC [23, 26, 32], verhoogde mucine heterogenesity [23]. Deze waarnemingen suggereren dat mucine wijzigingen als "moleculaire" merkers van kwaadaardige transformatie van maagslijmvlies kan worden beschouwd. Verder, een onlangs gepubliceerd onderzoek sterk gesuggereerd MUC5AC als een vermeende H. pylari
receptor [33, 34].
In deze studie hebben we het patroon van mucinen expressie gekenmerkt door de progressieve stadia van H. pylori
geïnfecteerde menselijke maag-carcinoom. We hebben gebruik gemaakt van een uitgebreid panel van monoklonale antilichamen, met goed gekarakteriseerde specificiteiten gericht aan MUC2, MUC5AC en MUC6 mucinen.
Resultaten
Expressie patroon van MUC2, MUC5AC en MUC6 mucinen in normale maagslijmvlies
MUC5AC was hoogst uitgedrukt in foveolar epitheel en muceuze cellen hals van antrum (>. 75%, figuur 1b; fig. 3b; Tabel 2). Expressie van MUC6 werd gedetecteerd in de klieren van het antrum (> 75%, figuur 1c; fig. 3c,. Tabel 3) en MUC2 werd niet gedetecteerd in de normale gastrische mucosa (figuur 1a;. Fig. 3a; Tabel 2). Figuur 1 Immunohistochemische kleuring van MUC2, MUC5AC en MUC6 mucinen in H. pylori geïnfecteerde patiënten. een. MUC2 kleuring van normale maagslijmvlies (oorspronkelijke vergroting x 100). b. MUC5AC kleuring van normale maagslijmvlies (Original vergroting × 100). c. MUC6 kleuring van normale maagslijmvlies (oorspronkelijke vergroting x 100). d. MUC2 kleuring van atrofische gastritis (oorspronkelijke vergroting x 100). e. MUC5AC kleuring van Atrofische gastritis (Original vergroting x 100). f. MUC6 kleuring van atrofische gastritis (oorspronkelijke vergroting x 100). g. MUC2 kleuring van Intestinale metaplasie (Original vergroting x 100). h. MUC5AC kleuring van Intestinale metaplasie (Original vergroting x 100).
Figuur 2 Immunohistochemische kleuring van MUC2, MUC5AC en MUC6 mucinen in H. pylori geïnfecteerde patiënten. een. MUC6 kleuring van Intestinale metaplasie (Original vergroting x 100). b. MUC2 kleuring van dysplasie (oorspronkelijke vergroting x 100). c. MUC5AC kleuring van dysplasie (Original vergroting × 100). d. MUC6 kleuring van dysplasie (oorspronkelijke vergroting x 100). e. MUC2 kleuring carcinoom (oorspronkelijke vergroting x 100). f. MUC5AC kleuring van carcinoom (Original vergroting × 100). g. MUC6 kleuring van carcinoom (Original vergroting x 100).
Figuur 3 Expressie patroon van mucinen (MUC2, MUC5AC en MUC6) in H. pylori geïnfecteerde pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel. een. MUC2 expressie in H. pylori
besmet pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel. b. MUC5AC expressie in H. pylori
geïnfecteerde pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel. c. MUC6 expressie in H. pylori
besmet pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel.
Tabel 1 Specifieke kenmerken, herkomst en verdunningen van de monoklonale antilichamen.
Monoclonal antilichaam
specificiteit
Reference
Verwatering
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
onverdunde
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tabel 2 Expressie van mucinen (MUC2, MUCSAC en MUC6) in H. pylori
geïnfecteerde pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P
- +
++
+++
++++
- +
++
+++
++++
- +
+ +
+++
++++
Normaal (n = 7)
7
- n = 7 (100%)
- -
- Frankrijk -
- -
- n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) -
-
-
1 (14,3%)
6 (85,7%)
Atrofische gastritis (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) -
-
- -
- 1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
-
- 1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
Intestinale metaplasie (n = 21)
- 21
-
- n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) **
-
- 1 (4,8%)
16 ( 76,2%) ** verhuur 4 (19%)
-
- 5 (23,8%)
14 (66,7%) ** Pagina 2 (9,5%)
-
dysplasie (n = 17) -
17
- n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5.9 %)
-
- 3 (17,6%)
10 (58,8%) verhuur 4 (23,5%)
-
- 3 (17,6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%) -
carcinoom (n = 36) -
36
- 22 (61,1%)
14 (38,9%) -
-
- 28 (77,8%)
8 (22,2%)
-
- 12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%)
-
- N - negatief - (> 5%) negatief
P - positief + (5-25%) enkele positieve cellen
n - Aantal gevallen ++ (25-50%) goed afgebakend gebied
+++ (50- 75%) uitgestrekt gebied gekleurd
++++ (75-100%) het grootste deel van de cellen gekleurd
** p < 0.00, * p < 0,05 (Significant verschil in expressie)
Immunodetectie mucinen in atrofische gastritis
Er was expressie van MUC5AC in alle gevallen cilindrische cellen (figuur 1e,. Fig. 3b; Tabel 2). Het percentage gekleurde cellen varieerde van geval tot geval, in de meeste gevallen was er een trend naar hogere aantal cellen die MUC5AC (> 75%) in de oppervlakkige gedeelte van de metaplastisch klieren dan in diepe deel. MUC6 werd gedetecteerd in zuilvormige cellen (> 50%; fig. 1f; fig. 3c; tabel 2) en MUC2 werd niet gedetecteerd in atrofische gastritis
(figuur 1d). Immunodetectie van mucinen in intestinale metaplasie
There. werd verlaagd niveau van expressie van MUC5AC en MUC6 in alle gevallen (> 50%), zowel in de beker en in zuilvormige cellen (Fig 1u, figuur 2a;.... figuur 3b, Fig 3c; tabel 2). Het percentage gekleurde cellen varieerde van geval tot geval, de novo expressie van
intestinale mucine MUC2 waargenomen (> 75%), en de uitdrukking vertoonde een diffuse cytoplasmatische patroon in slijmbekercellen (figuur 1G,. Fig. 3a; . tabel 2)
Immunodetectie van mucinen in dysplasie
Er werd verlaagd niveau expressie van MUC5AC en MUC6, dan intestinale metaplasie (> 50%). MUC5AC en MUC6 vertoonde een diffuse cytoplasmatische expressiepatroon in cilindrische cellen (figuur 2c; fig. 2d; fig. 3D,. Fig. 3, Tabel 2). MUC2 expressie toonde een diffuus cytoplasmisch patroon in bekers cellen (> 50%, figuur 2b; fig. 3a; tabel 2)
Immunodetectie van mucinen in carcinoom
MUC5AC en MUC6 expressie werden vaak waargenomen in het begin van carcinoom (>.; 50%) dan geavanceerde carcinomen (> 25%). In geavanceerde carcinomen, zagen we een trend naar verminderde immunoreactiviteit in diepe gebieden dan in de oppervlakkige gebieden. MUC5AC en MUC6 uitdrukkingen werden afgenomen in geavanceerde carcinomen (> 25%; figuur 3a, fig. 3b;. Fig. 3c; fig. 2e, 2f, figuur 2g;.. Tabel 2).
Discussie
in deze studie hebben we aangetoond dat het patroon van mucinen expressie in de opeenvolgende stadia van H. pylori
geïnfecteerde menselijke maag epitheel. Mucinen worden uitgedrukt met een cel- en weefselspecifieke patroon in normaal weefsel. Veranderingen van het expressiepatroon van mucinen zijn beschreven in carcinomen en hun precursorlaesies; in het laatste veranderde mucine koolhydraat en peptide eenheden kunnen moleculaire markers verhoogd risico van maligne transformatie [27, 35, 36, 38-40] vormen.
In overeenstemming met eerdere studies rapporteren de verdeling van mucinen in normale maag, we in totaal MUC5AC wordt sterk tot expressie gebracht in cellen van foveolar antrum, zoals gerapporteerd [26, 27, 32, 37-39]. We vonden ook dat MUC6 wordt uitgedrukt in muceuze cellen van de nek zone pylorus klieren van het antrum met soortgelijk patroon als die eerder [22, 23, 47] beschreven. De expressie van MUC2 werd gewoonlijk niet gedetecteerd in de normale gastrische mucosa zoals beschreven in de vorige rapporten [25, 27, 40].
Intestinale metaplasie is één van de in de cascade gebeurtenis laesies die de ontwikkeling van maagcarcinoom [voorafgaat ,,,0],41]. Intestinale metaplasie omvat de vervanging van het maagslijmvlies van een epithelium dat histologisch lijkt op de intestinale mucosa. Veranderde mucine expressiepatronen waargenomen bij H. pylori geïnfecteerde
intestinale metaplasie, ook onder expressie van MUC5AC en MUC6 en de novo expressie van
MUC2 meestal in slijmbekercellen [30, 48]. Deze resultaten ondersteunen de veronderstelling dat de intestinale metaplasie betekent wel een differentiatie van de mucosa naar een intestinale fenotype [42, 43]. Ondernemingen De verminderde expressie van MUC5AC en MUC6 mucine in maagcarcinomen werd bevestigd in deze studie. De expressie van MUC5AC in vroege gastrische carcinoom van de onderhavige serie, ongeacht het weefseltype van de tumoren, in contrast met het verminderde niveau expressie van MUC5AC immunoreactiviteit in bijna de helft van de geavanceerde carcinomen die suggereren dat alle maagcarcinomen nog ten minste sommige cellen met gastrische fenotype tijdens de eerste stappen van neoplastische ontwikkeling (26). Deze veronderstelling wordt verder ondersteund door de verminderde immunoreactiviteit in diepe gebieden tegen oppervlakkige gebieden van de geavanceerde carcinomen. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere resultaten blijkt dat maagkanker progressie gepaard gaat met verandering van de expressie van meerdere genen mucine [14]. Tenslotte hebben we vastgesteld dat de intestinale mucine MUC2 uitgedrukt in elke intestinale metaplasie, een laesie die tijdens het proces van maagkanker in verband met H. pylori geïnfecteerde individuen
weergegeven.
Conclusie Hoewel H
. pylori
is geclassificeerd als een klasse I carcinogeen door de IARC [4], het mechanisme van de maag carcinogenese blijft slecht begrepen. In pre-neoplastische maagslijmvlies, heeft de expressie van de drie antigenen mucine niet te correleren met de ernst van de ontsteking en H. pylori
toestand. Resultaten van dit onderzoek kan voorstellen dat H. pylori infectie
werkt als een initiator van deze cascade carcinogenese door het induceren van ontsteking en, in sommige gevallen, de volgende metaplastische wijziging. Intestinale metaplasie wordt vergezeld door de inductie van expressie MUC2 en een verminderde expressie van MUC5AC en MUC6. Deze wijzigingen kunnen de ontwikkeling van maagcarcinoom bevorderen. De onderhavige studie suggereert dat MUC2 is een marker van intestinale metaplasie en kunnen worden gebruikt voor de vroege detectie van deze laesie in H. pylori geïnfecteerde
pre-neoplastische humane gastrische epitheel.
Materialen en werkwijzen
weefselmonsters
Vijftig negen maag biopten en 3 ml bloed werden verkregen uit Stanley Medical College en Ziekenhuis, Chennai. Alle biopsie weefselmonsters werden verzameld na informed consent. Dit onderzoek is uitgevoerd na het verkrijgen van de goedkeuring van de ethische raad van bestuur van het ziekenhuis vervoerd. Alle biopsie monsters werden gefixeerd in 10% gebufferde formaline en routinematig ingebed in paraffinewas. 4 um dunne seriecoupes werden gesneden en gebruikt voor immunohistochemie. H. pylori infectie
bevestigd door RUT en ELISA [43]. Hematoxyline en eosine gekleurde coupes werden gebruikt om gastritis gesorteerd volgens herziene Sydney classificatie [44] classificeren, maag-tumoren volgens de classificatie van Lauren [45] en de WHO classificatie [46]. We bestudeerden 7 gevallen van normale menselijke maag epitheel (7 biopsies), 26 gevallen van atrofische gastritis (26 biopsies), 21 gevallen van intestinale metaplasie (21 biopsies), 17 gevallen van dysplasie (17 biopsieën) en 36 gevallen van carcinoom waarin 21 gevallen vroege carcinoom en 15 gevallen geavanceerd carcinoom (16 biopten en chirurgische monsters 20).
monoklonale antilichamen
Een panel van drie monoklonale antilichamen werd gebruikt om de expressie van mucinen (MUC2, MUC5AC en MUC6) te bepalen. De specifieke, referenties en verdunningen van de antilichamen worden in tabel 1
Immunohistochemie
secties van normale, pre-neoplastische en neoplastische gastrische weefsels werden immuno gekleurd volgens Reis et al
[47] met lichte wijzigingen . Secties ontworpen voor behandeling met neuraminidase werden tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 gewassen en geïncubeerd met neuraminidase uit Clostridium perfringens Type VI
(Sigma, St Louis, MO) verdund in 0,1 M Na-acetaat, pH 5,5 tot een eindconcentratie van 0,1 U /ml. De incubatie werd gedurende 2 uur uitgevoerd bij 37 ° C en werd gevolgd door drie wassingen in ijskoude PBS. Secties werden behandeld met 0,5% H 2O 2 in methanol gedurende 30 min, gevolgd door 20 min incubatie met konijn niet- immuunserum. Coupes werden gespoeld en geïncubeerd met primair antilichaam (Tabel 1), gedurende de nacht bij 4 ° C. De coupes werden gewassen en geïncubeerd met HRP conjucated konijn anti-muis secundair antilichaam (1: 100 verdunning) gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen met PBS en ontwikkeling met 0,05% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (SRL, Bombay, India ) vers bereid in PBS dat 0,1% H 2O 2. Secties werden teller gekleurd met hematoxyline, uitgedroogd, en gemonteerd. Alle series waaronder positieve en negatieve controles werden uitgevoerd door substitutie van de primaire mAbs met immunoglobulinen van dezelfde klasse en bij dezelfde concentratie.
Scoring mucinen expressie in H. pylori geïnfecteerde
pre-neoplastische en neoplastische menselijke weefsels maag
Een semikwantitatieve benadering werd gebruikt voor de immunokleuring van humane gastrische weefsels te. De objectglaasjes werden onder lichtmicroscoop onderzocht, werden de 100 cellen punten in vijf verschillende gebieden en de resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde percentage. (-), Negatief; +, Enkele positieve cellen (< 25%); ++ Goed gedefinieerde gebieden met een positieve cellen (25-50%); +++, Uitgestrekte gebieden met positieve cellen (50-75%); ++++, De meeste cellen gekleurd (> 75%). Statistische gegevens
Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software pakket SPSS 10.0 voor windows. De Chi-kwadraat test of Fisher's exact test werd gebruikt om de verschillen in frequenties te analyseren. Spearman correlatie test werd gebruikt om de correlatie tussen de parameters te analyseren. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant
Afkortingen
DAB - 3:.
3'-diaminobenzidine tetra-hydrochloride
ELISA:
-Enzyme-linked immunosorbent assay
HRP:
mierikswortelperoxidase
IARC:
Internationaal Agentschap voor kankeronderzoek

IM:
Intestinale metaplasie
mAb's:
monoklonale antilichamen
PBS:
fosfaat gebufferd zoutoplossing
WHO:
World Health Organization
RUT:.
Rapid Ureum Test

verklaringen
Dankwoord
de auteurs danken de Lady Tata Memorial Trust, Mumbai, India voor de financiële steun aan een van de auteurs S. Durai Babu. We dankbaar voor Dr. Narasimhan, professor en hoofd, afdeling Pathologie, Sri Ramachandra Medical College en Ziekenhuis, India, voor de herziening van de histologische en immunohistochemische resultaten en Dr. R. Ravanan, Reader, Bureau voor de statistiek, Presidemcy College, India voor het helpen in statistische analyses. We willen graag bedanken Dr. Celso A. Reis voor het verstrekken van de anti-MUC2, anti-MUC5AC en anti-MUC6 monoklonale antilichamen. 'Originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs'
Auteurs originele ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Authors' 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Auteurs originele bestand voor figuur 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Authors 'originele bestand voor figuur 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Authors' oorspronkelijke bestand voor originele bestand figuur 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc Authors 'voor figuur 5

• Onderscheidingen bij maagkanker gene expression handtekeningen afkomstig van laser capture microdissectie versushistologic macrodissection
• Airway cellulariteit, lipiden beladen macrofagen en microbiologie van maagsap en luchtwegen bij kinderen met reflux oesophagitis