profilo di espressione di mucine (MUC2, MUC5AC e MUC6) in Helicobacter pylori infetta pre-neoplastiche e neoplastiche gastrico profilo epithelium

espressione umana di mucine (MUC2, MUC5AC e MUC6) in Helicobacter pylori
infettato pre-neoplastica e neoplastica dell'epitelio gastrico umano
Astratto
sfondo
Helicobacter pylori
(H. pylori
) provoca gastrite e metaplasia intestinale (IM), che può evolvere a carcinoma gastrico. L'obiettivo di questo studio è stato quello di confrontare il profilo di mucine nella progressiva fasi di H. pylori
infetto dell'epitelio gastrico umano pre-neoplastiche e neoplastiche. Abbiamo utilizzato un pannello di anticorpi monoclonali con specificità ben definite di MUC2, MUC5AC e MUC6 per caratterizzare il pattern di espressione di mucine mediante immunoistochimica.
Metodi
RUT ed ELISA erano giù per la conferma H. ​​pylori
. sezioni di biopsia gastriche umane sono state colorate con immunoistochimica con MUC2, MUC5AC e anticorpi MUC6.
Risultati
MUC5AC stato espresso nell'epitelio superficiale e la parte superiore delle fossette gastriche. espressione MUC6 stato rilevato nella parte inferiore delle ghiandole gastriche. MUC2 era espresso in metaplasia intestinale, prevalentemente in cellule caliciformi. Il profilo di espressione mucina nelle progressive fasi di H. pylori
infettato dell'epitelio gastrico umano permette l'identificazione di metaplasia intestinale, che è caratterizzato da una ridotta espressione delle mucine gastrici (MUC5AC e MUC6) e de novo
espressione di MUC2.
conclusione
in conclusione, i nostri risultati suggeriscono che non vi è alterata espressione di MUC5AC e MUC6 insieme con l'espressione aberrante di MUC2 in metaplasia intestinale, durante il processo di carcinogenesi gastrica. Il presente studio indica che la mucina pattern di espressione MUC2 è un indicatore affidabile di metaplasia intestinale, che appare nel contesto di H. pylori
individui infetti.
Sfondo
Helicobacter pylori
colonizza la mucosa gastrica umana e provoca gastrite e metaplasia intestinale (IM), che può evolvere verso il carcinoma gastrico [1-3]. H. pylori
infezione è stata stabilita come un tipo I cancerogeno per l'uomo in IARC [4]; è stato recentemente dimostrato che i batteri sono anche in grado di indurre gastrite, IM, e carcinoma gastrico in gerbilli della Mongolia [5-8]. Negli esseri umani, H. pylori
colonizza anche la mucosa duodenale ogni volta che c'è metaplasia gastrica [9]. H. pylori
infezione umana dipende pertanto microambiente gastrico, che è determinato in larga misura dalla composizione mucina e carboidrati dello strato di mucina gastrica.
Mucine sono glicoproteine ​​pesantemente glicosilata che sono i principali componenti di il gel viscoso mucosa che copre i tessuti epiteliali superficiali [10]. Ad oggi, nove geni mucina epiteliali distinti (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7, e 8) sono state identificate [11-21]. In situ
ibridazione e gli studi di immunoistochimica hanno dimostrato che questi mucine sono espressi in modo differenziale epiteli con tipo di cellula specificità [21-24]. La mucosa gastrica normale mostra tipi di cellule specifiche espressione di MUC1, MUC5AC e MUC6, con i primi due mucine trovati nell'epitelio superficiale e MUC6 nelle ghiandole profonde [22, 25, 26]. MUC6 si esprime principalmente nella mucosa gastrica. La mucosa gastrica normale non esprimono MUC2 [25, 27].
Cambiamenti nei livelli di espressione e dei modelli di glicosilazione di mucine sono state associate a diverse malattie, tra cui carcinomi [27-31]. Nel cancro gastrico, sono state segnalate alterazioni mucina polipeptide: perdita di espressione di MUC5AC [23, 26, 32], aumentate mucina heterogenesity [23]. Queste osservazioni suggeriscono che le alterazioni mucina possono essere considerate come marcatori "molecolari" di trasformazione maligna della mucosa gastrica. Più ulteriormente più, un'indagine recentemente pubblicata fortemente suggerito MUC5AC come putativo H. pylari
recettore [33, 34].
In questo studio, abbiamo caratterizzato il pattern di espressione mucine nelle progressive fasi di H. pylori
infettato carcinoma gastrico umano. Abbiamo usato un panel completo di anticorpi monoclonali, con specificità ben caratterizzati diretti a MUC2, MUC5AC e MUC6 mucine.
Risultati
pattern di espressione di MUC2, MUC5AC e MUC6 mucine nella normale mucosa gastrica
MUC5AC era altamente espressa nell'epitelio foveolar e cellule collo mucose antro (>. 75%, Fig 1b; Fig. 3b; Tabella 2). L'espressione di MUC6 è stato rilevato nelle ghiandole del antro (> 75%, figura 1c; Fig. 3 quater;. Tabella 3) e MUC2 non è stato rilevato in normale mucosa gastrica (Fig 1a;. Fig. 3 bis, tabella 2). Figura 1 colorazione immunoistochimica di MUC2, MUC5AC e MUC6 mucine a H. pylori infettato pazienti. un. MUC2 colorazione della mucosa gastrica (ingrandimento originale × 100). b. MUC5AC colorazione della mucosa gastrica (ingrandimento originale × 100). c. MUC6 colorazione della mucosa gastrica (ingrandimento originale × 100). d. colorazione MUC2 di gastrite atrofica (ingrandimento originale × 100). e. MUC5AC colorazione di gastrite atrofica (ingrandimento originale × 100). f. colorazione MUC6 di gastrite atrofica (ingrandimento originale × 100). g. MUC2 colorazione dei intestinale metaplasia (ingrandimento originale × 100). h. MUC5AC colorazione dei intestinale metaplasia (ingrandimento originale × 100).
Figura 2 colorazione immunoistochimica di MUC2, MUC5AC e MUC6 mucine a H. pylori pazienti infetti. un. MUC6 colorazione dei intestinale metaplasia (ingrandimento originale × 100). b. colorazione MUC2 di displasia (ingrandimento originale × 100). c. MUC5AC colorazione della displasia (ingrandimento originale × 100). d. colorazione MUC6 di displasia (ingrandimento originale × 100). e. colorazione MUC2 del carcinoma (ingrandimento originale × 100). f. MUC5AC colorazione del carcinoma (ingrandimento originale × 100). g. MUC6 colorazione del carcinoma (ingrandimento originale × 100).
Figura 3 Espressione modello di mucine (MUC2, MUC5AC e MUC6) a H. pylori infetta pre-neoplastica e neoplastica dell'epitelio gastrico umano. un. espressione MUC2 in H. pylori
infettato pre-neoplastica e neoplastica dell'epitelio gastrico umano. b. espressione MUC5AC in H. pylori
infetto dell'epitelio gastrico umano pre-neoplastiche e neoplastiche. c. espressione MUC6 in H. pylori
infettato pre-neoplastica e neoplastica dell'epitelio gastrico umano.
Tabella 1 Specificità, origini e diluizioni degli anticorpi monoclonali.
monoclonale anticorpo
Specificità
Riferimento
diluizione
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
diluito
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tabella 2 Espressione di mucine (MUC2, MUCSAC e MUC6) a H. pylori
infetto pre-neoplastiche e neoplastiche umane gastrica epitelio
Stages

H. pylori
MUC2 Espressione
MUC5AC Espressione
Espressione MUC6
N
P -
+
++
+++
++++ -
+
++
+++
++++ -
+
+ +
+++
++++
normale (n = 7) Pagina 7 -
n = 7 (100%) -
-
- -
- Francia - -
n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) -
-
-
1 (14,3%)
6 (85,7%)
gastrite atrofica (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) -
- -
- -
1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
- -
1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
metaplasia intestinale (n = 21) -
21
- -
n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** -
-
1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
4 (19%) -
-
5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
displasia (n = 17) -
17 -
n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5.9 %) -
- Pagina 3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%) -
- Pagina 3 (17,6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%) -
carcinoma (n = 36) -
36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%) -
- -
28 (77,8%) Pagina 8 (22,2%) -
-
12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%) -
-
N - negativo - (> 5%)
negativo P - positivo + (5-25%) alcune cellule positive
n - Numero di casi ++ (25-50%) ben definiti zona
+++ (50- 75%) vasta zona macchiata
++++ (75-100%), la maggior parte delle cellule colorate
** p < 0.00, * p < 0.05 (differenza significativa nell'espressione)
immunorilevazione di mucine in gastrite atrofica
C'era espressione di MUC5AC in tutti i casi di cellule colonnari (Fig 1e;. Fig. 3b; Tabella 2). La percentuale di cellule colorate varia da caso a caso, nella maggioranza dei casi, c'è stata una tendenza più alto numero di cellule che esprimono MUC5AC (> 75%) nella parte superficiale delle ghiandole metaplastiche che in parte profonda. MUC6 è stata rilevata nelle cellule colonnari (> 50%; Fig. 1f; Fig. 3 quater; Tabella 2) e MUC2 non è stato rilevato in gastrite atrofica (Fig 1d.)
Immunorilevazione di mucine in metaplasia intestinale
. era diminuita espressione livello di MUC5AC e MUC6 in tutti i casi (> 50%), sia in coppa e in cellule colonnari (Fig 1h, Fig 2a,... Fig. 3b, 3c Fig; Tabella 2). La percentuale di cellule colorate varia da caso a caso, è stata osservata de novo
espressione di mucina intestinale MUC2 (> 75%), e la sua espressione visualizzata una forma citoplasmatica diffusa in cellule caliciformi (Fig 1 g;. Fig. 3a; . Tabella 2)
immunorilevazione di mucine a displasia
ci era diminuita espressione livello di MUC5AC e MUC6, di metaplasia intestinale (> 50%). MUC5AC e MUC6 visualizzato un modello di espressione citoplasmatica diffusa in cellule colonnari (Fig 2c; Fig. 2d; Fig. 3d;. Fig. 3; Tabella 2). espressione MUC2 visualizzato un modello citoplasmatica diffusa nelle cellule coppe (> 50%, figura 2b; Fig. 3 bis, tabella 2)
immunorilevazione di mucine nel carcinoma
MUC5AC e di espressione MUC6 sono stati frequentemente osservata nel carcinoma precoce (>.; 50%) rispetto carcinomi avanzati (> 25%). In carcinomi avanzati, abbiamo osservato una tendenza per diminuito immunoreattività nelle zone profonde che nelle zone superficiali. MUC5AC e MUC6 espressioni sono diminuiti in carcinomi avanzati (> 25%; Fig 3a; Fig. 3b;. Fig. 3 quater; Fig. 2e, 2f Fig, figura 2g,.. Tabella 2).
Discussione
in questo studio, abbiamo dimostrato che il pattern di espressione mucine nelle progressive fasi di H. pylori
infetto dell'epitelio gastrico umano. Mucine sono espressi con un motivo cellulo e tessuto-specifica nel tessuto normale. Alterazioni del pattern di espressione di mucine sono stati descritti in carcinomi che nel loro lesioni precursori; In quest'ultimo caso, mucina frazioni di carboidrati e peptidi alterati può costituire marcatori molecolari di aumento del rischio di trasformazione maligna [27, 35, 36, 38-40].
in accordo con gli studi precedenti segnalato la distribuzione di mucine nella normale stomaco, abbiamo trovato MUC5AC è altamente espresso in cellule foveolare di antro, come riportato [26, 27, 32, 37-39]. Abbiamo anche trovato che MUC6 è espresso in cellule mucose della zona collo ghiandole pilorica dello antro con andamento simile a quello descritto in precedenza [22, 23, 47]. L'espressione di MUC2 solito non era rilevata in mucosa gastrica come descritto nelle precedenti relazioni [25, 27, 40].
Metaplasia intestinale è una delle lesioni identificate nella cascata di eventi che precede lo sviluppo di carcinoma gastrico [ ,,,0],41]. metaplasia intestinale comprende la sostituzione della mucosa gastrica da un epitelio simile istologicamente mucosa intestinale. pattern di espressione mucina alterati sono stati osservati in H. pylori
metaplasia intestinale infetto, anche sotto espressione di MUC5AC e MUC6 e de novo
espressione di MUC2 principalmente nelle cellule calice [30, 48]. Questi risultati sostengono l'ipotesi che la metaplasia intestinale rappresenta comunque una differenziazione della mucosa verso un fenotipo intestinale [42, 43].
La diminuita espressione di MUC5AC e MUC6 mucina nei carcinomi gastrici sono stati confermati nel presente studio. L'espressione di MUC5AC all'inizio carcinoma gastrico della presente serie, indipendentemente dal tipo istologico dei tumori, contrasta con l'espressione livello diminuito di MUC5AC immunoreattività in quasi metà dei carcinomi avanzati che suggeriscono che tutti i carcinomi gastrici conservano almeno alcune cellule con un fenotipo gastrica durante le prime fasi di sviluppo neoplastico (26). Questa ipotesi è ulteriormente supportata dal diminuita immunoreattività nelle zone profonde rispetto alle aree superficiali dei carcinomi avanzati. Questi risultati sono in accordo con i risultati precedenti che dimostrano che la progressione del cancro gastrico è accompagnato da alterazione della espressione di diversi geni mucina [14]. Infine, abbiamo osservato che la mucina intestinale MUC2 si esprime in ogni metaplasia intestinale, che è una lesione che appare durante il processo di carcinogenesi gastrica nel contesto di H. pylori
individui infetti.
Conclusione
Sebbene H . pylori
è stato classificato come agente cancerogeno di classe I dalla IARC [4] il meccanismo di carcinogenesi gastrica rimane poco compresa. In mucosa gastrica pre-neoplastica, l'espressione di tutti e tre gli antigeni mucina non sembra correlare con la gravità dell'infiammazione e H. pylori
stato. I risultati di questo studio possono suggerire che H. pylori atti di infezione
come iniziatore di questa cancerogenesi cascata inducendo infiammazione e, in alcuni casi, la successiva modifica metaplastica. metaplasia intestinale è accompagnato dalla induzione dell'espressione MUC2 e diminuita espressione di MUC5AC e MUC6. Queste alterazioni possono favorire lo sviluppo di carcinoma gastrico. Il presente studio suggerisce che MUC2 è un marker di metaplasia intestinale e può essere utilizzato per la diagnosi precoce di questa lesione in H. pylori
infetto pre-neoplastica dell'epitelio gastrico umano.
Materiali e metodi
Tissue campioni
Cinquanta nove campioni di biopsia gastrica e 3 ml di sangue sono stati ottenuti da Stanley Medical college Hospital e, Chennai. Tutti i campioni di tessuto bioptici sono stati raccolti dopo consenso informato. Questo studio è stato effettuato dopo aver ottenuto l'autorizzazione della scheda etico dell'ospedale. Tutti i campioni bioptici sono stati fissati in formalina al 10% tamponata e regolarmente inseriti in paraffina. 4 micron sezioni seriali sottili sono stati tagliati e utilizzati per immunoistochimica. H. pylori
infezione è stata confermata da RUT ed ELISA [43]. Ematossilina e eosina sezioni colorate sono stati usati per classificare le gastrite classificati secondo la classificazione Sydney rivisto [44], i tumori gastrici secondo la classificazione di Lauren [45] e la classificazione WHO [46]. Abbiamo studiato 7 casi di normale epitelio gastrico umano (7 biopsie), 26 casi di gastrite atrofica (26 biopsie), 21 casi di intestinale metaplasia (21 biopsie), 17 casi di displasia (17 biopsie) e 36 casi di carcinoma in cui 21 casi di carcinoma precoce e 15 casi di carcinoma avanzato (16 biopsie e 20 campioni chirurgici).
Gli anticorpi monoclonali
Una giuria di tre anticorpi monoclonali è stato utilizzato per determinare l'espressione di mucine (MUC2, MUC5AC e MUC6). Le specificità, riferimenti e diluizioni degli anticorpi sono elencate nella tabella 1.
Immunoistochimica
Le sezioni normali, pre-neoplastiche e neoplastiche tessuti gastrici sono stati immuno macchiati in base alle Reis et al
[47] con lievi modifiche . Sezioni progettati per il trattamento neuraminidasi sono stati lavati due volte in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.4 e incubate con neuraminidasi da Clostridium perfringens tipo VI
(Sigma, St Louis, MO) diluito in tampone 0,1 M Na-acetato, pH 5,5 per una concentrazione finale di 0,1 U /ml. L'incubazione è stata condotta per 2 ore a 37 ° C ed è stata seguita da tre lavaggi in PBS ghiacciato. Le sezioni sono state trattate con 0,5% H 2O 2 in metanolo per 30 minuti, seguiti da 20 minuti di incubazione con coniglio siero non immune. Le sezioni sono state lavate e incubate con l'anticorpo primario (Tabella 1), per una notte a 4 ° C. Le sezioni sono state lavate e incubate con HRP conjucated coniglio anti-topo anticorpo secondario (diluizione 1: 100) per 1 h seguito da risciacquo con PBS e sviluppando con 0,05% 3,3 'Diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) (SRL, Mumbai, India ) appena preparato nel PBS contenente 0,1% H 2O 2. Le sezioni sono state contatore colorate con ematossilina, disidratate e montate. Tutte le serie compresi i controlli positivi e negativi sono stati eseguiti per sostituzione degli anticorpi monoclonali primari con le immunoglobuline della stessa classe e alla stessa concentrazione.
Punteggio di mucine espressione in H. pylori
infettato i tessuti gastriche umane pre-neoplastiche e neoplastiche
Un approccio quantitativo semi è stato utilizzato per segnare la immunocolorazione dei tessuti gastrici umani. I vetrini sono stati esaminati al microscopio ottico, ogni 100 cellule sono state realizzate in cinque diversi settori ed i risultati sono stati espressi come percentuale media. (-), Negativo; +, poche cellule positive (< 25%); ++ Aree ben definite con cellule positive (25-50%); +++, aree estese con cellule positive (50-75%); ++++, la maggior parte delle cellule colorate (> 75%).
Statistiche
L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il pacchetto software statistico SPSS 10.0 per Windows. Il test chi-quadrato o test esatto di Fisher è stato utilizzato per analizzare le differenze di frequenze. test di correlazione di Spearman è stato utilizzato per analizzare la correlazione tra i parametri. P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo
Abbreviazioni
DAB - 3:.
3'-diaminobenzidina tetra cloridrato
ELISA:
immunoenzimatico saggio
HRP:
rafano perossidasi
IARC:
Agenzia Internazionale per la ricerca sul Cancro

IM:
metaplasia intestinale
anticorpi monoclonali:
anticorpi monoclonali
PBS:
tamponata con fosfato salina
OMS:
Organizzazione mondiale della sanità
RUT:.
Rapid Urea test

Dichiarazione
Ringraziamenti
gli autori ringraziano la Lady Tata Memorial trust, Mumbai, India per il sostegno finanziario a quella di S. Durai Babu autori. Siamo grati al Dr. Narasimhan, Professore e Direttore del Dipartimento di Patologia, Sri Ramachandra Medical College Hospital e, in India, per esaminare i risultati istologici e immunoistochimici e Dr. R. Ravanan, Reader, Dipartimento di Statistica, Presidemcy universitari, India per l'aiuto nell'analisi statistica. Vorremmo ringraziare il Dott Celso A. Reis per la fornitura di anti-MUC2, anti-MUC5AC e anticorpi monoclonale anti-MUC6. 'File inviati originali per le immagini
Di seguito sono riportati i link agli autori'
Autori originale presentato file per le immagini. 'file originale per la figura 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Autori 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc autori file originale per la figura 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Autori file originale per la figura 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Autori file originale per il file originale figura 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc degli autori per la figura 5

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