Ekspressionsprofil af muciner (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori inficerede præneoplastiske og neoplastiske humane gastrisk epithelium

ekspressionsprofil af muciner (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori
inficeret præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske epitel
abstrakt
Baggrund
Helicobacter pylori Hotel (H. pylori
) forårsager gastritis og tarm metaplasi (IM), som kan udvikle sig til at gastrisk karcinom. Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne profilen af ​​muciner i de progressive faser af H. pylori
inficerede præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske epitel. Vi brugte et panel af monoklonale antistoffer med veldefinerede særlige forhold MUC2, MUC5AC og MUC6 at karakteriserer udtryk mønster af muciner ved immunhistokemi.
Metoder
RUT og ELISA var ned for H. pylori
bekræftelse. Humane gastriske biopsi sektioner blev farvet ved hjælp af immunhistokemi med MUC2, MUC5AC og MUC6 antistoffer.
Resultater
MUC5AC blev udtrykt i den overfladiske epitel og den øverste del af mavens gruber. MUC6 ekspression blev detekteret i den nedre del af de gastriske kirtler. MUC2 blev udtrykt i intestinal metaplasi, hovedsagelig i slimceller. Mucin ekspressionsprofil i de progressive faser af H. pylori
inficeret human gastrisk epitel muliggør identifikationen af ​​intestinal metaplasi, som er karakteriseret ved en nedsat ekspression af de gastriske muciner (MUC5AC og MUC6) og de novo
ekspression af MUC2.
konklusion
som konklusion tyder vore resultater, at der er ændret ekspression af MUC5AC og MUC6 sammen med afvigende ekspression af MUC2 i intestinal metaplasi, under processen af ​​gastrisk carcinogenese. Den foreliggende undersøgelse viser, at MUC2 mucin udtryk mønster er en pålidelig markør for tarm metaplasi, der vises i forbindelse med H. pylori
inficerede individer.
Baggrund
Helicobacter pylori
koloniserer menneskets gastrisk mucosa og forårsager gastritis og tarm metaplasi (IM), som kan udvikle sig i retning af gastrisk karcinom [1-3]. H. pylori
infektion blev etableret som en type I kræftfremkaldende for mennesker i IARC [4]; det blev for nylig vist, at bakterierne er også i stand til at inducere gastritis, IM, og gastrisk karcinom i mongolske hoppemus [5-8]. Hos mennesker H. pylori
koloniserer også den duodenale slimhinde, når der er gastrisk metaplasi [9]. H. pylori
infektion i human er derfor afhængig af den gastriske mikromiljø, som bestemmes i vid udstrækning af mucin og kulhydrat sammensætning af mavens mucin lag.
Muciner er stærkt glycosylerede glycoproteiner, der er de vigtigste komponenter i den mukøse viskøse gel dækker overfladen epitelvæv [10]. Til dato ni forskellige epiteliale mucin gener (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7, og 8) er blevet identificeret [11-21]. In situ
hybridisering og immunhistokemiske undersøgelser har vist, at disse muciner differentielt udtrykkes i epitel med celletypespecificitet [21-24]. Den normale maveslimhinden viser celletyper særligt udtryk for MUC1, MUC5AC, og MUC6, med de to første muciner fundet i overfladiske epitel og MUC6 i de dybe kirtler [22, 25, 26]. MUC6 hovedsageligt udtrykkes i maveslimhinden. Den normale maveslimhinden ikke udtrykker MUC2 [25, 27].
Ændringer i ekspressionsniveauerne og glycosyleringsmønstre af muciner er blevet forbundet med adskillige sygdomme, herunder carcinomer [27-31]. I mavekræft, har ændringer i mucin polypeptid rapporteret: tab af ekspressionen af ​​MUC5AC [23, 26, 32], øget mucin heterogenesity [23]. Disse observationer antyder, at mucin ændringer kan betragtes som "molekylære" markører for malign transformation af maveslimhinden. Yderligere mere, en nyligt offentliggjort undersøgelse kraftigt antydet MUC5AC som en formodet H. pylari
receptor [33, 34].
I nærværende undersøgelse har vi karakteriseret mønstret for muciner udtryk i de progressive stadier af H. pylori
inficeret human gastrisk karcinom. Vi har brugt en omfattende panel af monoklonale antistoffer, med godt karakteriserede særlige rettet mod MUC2, MUC5AC og MUC6 muciner.
Resultater
Expression mønster af MUC2, MUC5AC og MUC6 muciner i normal gastrisk mucosa
MUC5AC var meget udtrykt i foveolar epitel og mukøse hals celler af antrum (>. 75%, figur 1b;. figur 3b, tabel 2). Ekspression af MUC6 blev påvist i kirtler i antrum (> 75%, figur 1c;. Figur 3c;. Tabel 3) og MUC2 blev ikke påvist i normal gastrisk mucosa (figur 1a;.. Figur 3a; tabel 2). Figur 1 Immunohistokemisk farvning af MUC2, MUC5AC og MUC6 muciner i H. pylori inficerede patienter. en. MUC2 farvning af normal gastrisk mucosa (oprindelig forstørrelse x 100). b. MUC5AC farvning af normal maveslimhinden (Original forstørrelse × 100). c. MUC6 farvning af normal gastrisk mucosa (oprindelig forstørrelse x 100). d. MUC2 farvning af atrofisk gastritis (oprindelig forstørrelse x 100). e. MUC5AC farvning af atrofisk gastritis (oprindelig forstørrelse x 100). f. MUC6 farvning af atrofisk gastritis (oprindelig forstørrelse x 100). g. MUC2 farvning af Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100). h. MUC5AC farvning af Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100).
Figur 2 immunhistokemisk farvning af MUC2, MUC5AC og MUC6 muciner i H. pylori inficerede patienter. en. MUC6 farvning af Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100). b. MUC2 farvning af dysplasi (Original forstørrelse x 100). c. MUC5AC farvning af dysplasi (Original forstørrelse × 100). d. MUC6 farvning af dysplasi (Original forstørrelse x 100). e. MUC2 farvning af carcinom (Original forstørrelse x 100). f. MUC5AC farvning af karcinom (Original forstørrelse × 100). g. MUC6 farvning af carcinom (Original forstørrelse x 100).
Figur 3 Ekspressionsmønster af muciner (MUC2, MUC5AC og MUC6) i H. pylori inficerede præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske epitel. en. MUC2 ekspression i H. pylori
inficeret præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske epitel. b. MUC5AC ekspression i H. pylori
inficerede præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske epitel. c. MUC6 udtryk i H. pylori
inficeret pre-neoplastisk og neoplastisk menneskelig gastrisk epitel.
Tabel 1 særtræk, oprindelse og fortyndinger af de monoklonale antistoffer.
monoklonalt antistof
Specificitet
reference
Fortynding
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
Ufortyndet
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
tabel 2 Angivelse af muciner (MUC2, MUCSAC og MUC6) i H. pylori
inficerede præ-neoplastisk og neoplastisk menneskelig gastrisk epitel
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P -
+
++
+++
++++ -
+
++
+++
++++ -
+
+ +
+++
++++
Normal (n = 7)
7 -
n = 7 (100%) -
-
- -
-
- -
n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) -
-
-
1 (14,3%)
6 (85,7%)
atrofisk gastritis (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) -
- -
- -
1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
- -
1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
Intestinal metaplasi (n = 21) -
21
- -
n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** -
-
1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
4 (19%) -
-
5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
dysplasi (n = 17) -
17 -
n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5,9 %) -
-
3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%) -
-
3 (17,6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%) -
carcinom (n = 36) -
36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%) -
- -
28 (77,8%)
8 (22,2%) -
-
12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%) -
-
N - negativ - (> 5%) negativ
P - positive + (5-25%) få positive celler
n - Antal sager ++ (25-50%) veldefinerede området
+++ (50- 75%) stort område farves
++++ (75-100%) de fleste af de celler farvet
** p < 0,00, * p < 0,05 (Signifikant forskel i udtryk)
Immundetektion af muciner i atrofisk gastritis
Der var udtryk for MUC5AC i alle de tilfælde af søjleformede celler (Fig 1e;.. Figur 3b, tabel 2). Procentdelen af ​​farvede celler varierede fra tilfælde til tilfælde, i de fleste tilfælde var der en tendens til højere antal celler, der udtrykker MUC5AC (> 75%) i den overfladiske del af de metaplastiske kirtler end i dybe del. MUC6 blev påvist i søjleformede celler (> 50%. Figur 1f;. Figur 3c, tabel 2) og MUC2 blev ikke påvist i atrofisk gastritis (figur 1d.)
Immundetektion af muciner i tarm metaplasi
Der. blev nedsat niveau ekspression af MUC5AC og MUC6 i alle tilfælde (> 50%), både i bæger og i søjleformede celler (fig 1h, figur 2a;.... figur 3b, figur 3c, tabel 2). Procentdelen af ​​farvede celler varierede fra sag til sag, blev de novo
udtryk for tarm mucin MUC2 observeret (> 75%), og dens udtryk viste en diffus cytoplasmatisk mønster i bæger celler (figur 1 g;.. Fig 3a; . tabel 2)
Immundetektion af muciner i dysplasi
Der blev nedsat niveau udtryk for MUC5AC og MUC6, end intestinal metaplasi (> 50%). MUC5AC og MUC6 viste et diffust cytoplasmatisk ekspressionsmønster i søjleformede celler (Fig 2c;. Figur 2d;. Figur 3d,.. Figur 3; tabel 2). MUC2 udtryk viste en diffus cytoplasmatisk mønster i Bægere celler (> 50%, figur 2b;. Figur 3a tabel 2)
Immundetektion af muciner i karcinom
MUC5AC og MUC6 udtryk blev ofte observeret i begyndelsen carcinom (>. , 50%) end avancerede carcinomer (> 25%). I avancerede carcinomer, observerede vi en tendens til nedsat immunoreaktivitet i dybe områder end i de overfladiske områder. MUC5AC og MUC6 udtryk blev nedsat i avancerede karcinomer (> 25%, Fig 3a. Figur 3b,.. Figur 3c,. Figur 2e, fig 2f, figur 2g;.. Tabel 2).
Diskussion
i denne foreliggende undersøgelse har vi vist, at mønsteret af muciner ekspression i de progressive faser af H. pylori
inficeret human gastrisk epithel. Muciner udtrykkes med en celle- og vævsspecifik mønster i normalt væv. Ændringer i ekspressionsmønsteret for muciner er blevet beskrevet i carcinomer samt i deres forstadielæsioner; i sidstnævnte, ændrede mucin kulhydrat og peptid-dele kan udgøre molekylære markører for øget risiko for malign transformation [27, 35, 36, 38-40].
Efter aftale med tidligere undersøgelser rapporterer fordelingen af ​​muciner i normal mave, vi fundet MUC5AC er højt udtrykt i foveolar celler af antrum, som rapporteret [26, 27, 32, 37-39]. Vi fandt også, MUC6 udtrykkes i mukøse celler i halsområdet i pylorus kirtler i antrum med nogenlunde samme mønster som beskrevet tidligere [22, 23, 47]. Ekspressionen af ​​MUC2 var normalt ikke påvist i normal gastrisk mucosa som beskrevet i de tidligere rapporter [25, 27, 40].
Intestinal metaplasi er en af ​​de læsioner der er identificeret i den kaskade af begivenhed, der går forud for udviklingen af ​​gastrisk carcinom [ ,,,0],41]. Intestinal metaplasi omfatter udskiftning af maveslimhinden ved et epithel, der ligner histologisk tarmslimhinden. Altered mucin udtryk mønstre er blevet observeret i H. pylori
inficeret tarm metaplasi, herunder i henhold udtryk for MUC5AC og MUC6 og de novo
udtryk for MUC2 meste i bæger celler [30, 48]. Disse resultater understøtter den antagelse, at tarmens metaplasi gør repræsenterer en differentiering af slimhinden mod en tarm fænotype [42, 43].
Faldt udtryk for MUC5AC og MUC6 mucin i gastriske carcinomer blev bekræftet i den foreliggende undersøgelse. Ekspressionen af ​​MUC5AC i begyndelsen gastrisk karcinom i foreliggende serier, uanset den histologiske type af tumorerne, i kontrast til den formindskede niveau ekspression af MUC5AC immunreaktivitet i næsten halvdelen af ​​de avancerede carcinomer, der antyder, at alle gastriske carcinomer bevarer i det mindste nogle celler med en gastrisk fænotype i de første trin i neoplastisk udvikling (26). Denne antagelse understøttes yderligere af den nedsatte immunoreaktivitet i dybe områder sammenlignet med overfladiske områder af de avancerede karcinomer. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater viser, at mavekræft progression er ledsaget af ændring af ekspressionen af ​​flere mucin gener [14]. Endelig har vi observeret, at intestinal mucin MUC2 udtrykkes i enhver intestinal metaplasi, som er en læsion, der vises under processen med gastrisk carcinogenese i forbindelse med H. pylori
inficerede individer.
Konklusion
Selvom H . pylori
er blevet klassificeret som et klasse i kræftfremkaldende af IARC [4] den mekanisme af gastrisk carcinogenese stadig dårligt forstået. I præ-neoplastisk maveslimhinden, har ekspression af alle de tre mucin antigener ikke at korrelere med sværhedsgraden af ​​inflammation og H. pylori
status. Resultater fra den foreliggende undersøgelse kan antyde, at H. pylori Salg infektion virker som en initiator af denne carcinogenese kaskade ved at inducere inflammation og, i nogle tilfælde, den efterfølgende metaplastisk ændring. Intestinal metaplasi er ledsaget af induktionen af ​​ekspression MUC2 og nedsat ekspression af MUC5AC og MUC6. Disse ændringer kan fremme udviklingen af ​​gastrisk karcinom. Den foreliggende undersøgelse tyder på, at MUC2 er en markør for tarm metaplasi og kan anvendes til tidlig påvisning af denne læsion i H. pylori
inficerede præ-neoplastisk human gastrisk epitel.
Materialer og metoder
vævsprøver
Halvtreds ni gastriske biopsi prøver og 3 ml blod blev opnået fra Stanley Medical College og Hospital, Chennai. Alle biopsiprøver væv blev opsamlet efter informeret samtykke. Denne undersøgelse blev gennemført efter at have indhentet godkendelse fra den etiske bestyrelse hospitalet. Alle biopsiprøver blev fikseret i 10% pufret formalin og rutinemæssigt indlejret i paraffinvoks. 4 um tynde serielle snit blev skåret og anvendt til immunhistokemi. H. pylori
infektionen blev bekræftet af RUT og ELISA [43]. Hematoxylin og eosin farvede sektioner blev brugt til at klassificere gastritis karakter efter reviderede Sydney klassifikationen [44], gastriske tumorer i henhold til klassificeringen af ​​Lauren [45] og WHO klassifikation [46]. Vi studerede 7 tilfælde af normal human gastrisk epitel (7 biopsier), 26 tilfælde af atrofisk gastritis (26 biopsier), 21 tilfælde af Intestinal metaplasi (21 biopsier), 17 tilfælde af dysplasi (17 biopsier) og 36 tilfælde af carcinoma, hvor 21 sager tidlig carcinom og 15 sager avancerede carcinom (16 biopsier og 20 kirurgiske prøver). Salg monoklonale antistoffer
Et panel af tre monoklonale antistoffer blev anvendt til bestemmelse af ekspressionen af ​​muciner (MUC2, MUC5AC og MUC6). De særlige, referencer og fortyndinger af antistofferne er anført i tabel 1.
Immunhistokemi
Sektioner fra normale, præneoplastiske og neoplastiske gastriske væv blev immuno farvet i henhold til Reis et al
[47] med mindre ændringer . Sektioner designet til neuraminidasebehandling blev vasket to gange i phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4 og inkuberet med neuraminidase fra Clostridium perfringens type VI
(Sigma; St Louis, MO) fortyndet i 0,1 M Na-acetatpuffer, pH 5,5 til en slutkoncentration på 0,1 U /ml. Inkubationen blev udført i 2 timer ved 37 ° C og blev efterfulgt af tre vaskninger i iskold PBS. Sektioner blev behandlet med 0,5% H 2O 2 i methanol i 30 min, efterfulgt af 20 minutters inkubation med kanin ikke-immun serum. Snit blev skyllet og inkuberet med primært antistof (tabel 1), natten over ved 4 ° C. Snittene blev skyllet og inkuberet med HRP conjucated kanin-anti-muse-sekundært antistof (1: 100 fortynding) i 1 time efterfulgt af skylning med PBS og udvikling med 0,05% 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (SRL, Mumbai, Indien ) frisk fremstillet i PBS indeholdende 0,1% H 2O 2. Snit blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret. Alle serier herunder positive og negative kontroller blev udført ved substitution af de primære mAb'er med immunoglobuliner af samme klasse og ved samme koncentration.
Scoring af muciner ekspression i H. pylori
inficeret præneoplastiske og neoplastiske humane gastriske væv
En semi kvantitativ tilgang blev brugt til at score immunfarvning af humane gastriske væv. Objektglassene blev undersøgt under lysmikroskop, blev hver 100 celler scoret i fem forskellige områder, og resultaterne blev udtrykt som gennemsnitlige procentvise. (-), Negativ; +, få positive celler (< 25%); ++ Veldefinerede områder med positive celler (25-50%); +++, store områder med positive celler (50-75%); ++++, de fleste celler farvet (> 75%).
Statistik
Dataanalyse blev udført ved hjælp af statistisk programpakke SPSS 10,0 til vinduer. The Chi-Square test eller Fishers eksakte test blev anvendt til at analysere forskelle i frekvenser. Spearmans korrelation test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem parametre. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Forkortelser
DAB - 3:.
3'-diaminobenzidin tetra hydrochlorid
ELISA:
enzymmaerket assay
HRP:
Peberrod peroxidase
IARC:
Internationale Agentur for kræftforskning

IM:
Intestinal metaplasi
mAbs:
monoklonale antistoffer
PBS:
Fosfatbufferet saltvand
WHO:
World Health Organization
RUT:.
Rapid Urea Test

erklæringer
Tak
forfatterne takker Lady Tata Memorial Trust, Mumbai, Indien for økonomisk støtte til en af ​​forfatterne S. Durai Babu. Vi taknemmelig for Dr. Narasimhan, professor og chef, Patologisk Institut, Sri Ramachandra Medical College og Hospital, Indien, for at gennemgå de histologiske og immunhistokemiske resultater og Dr. R. Ravanan, Reader, Department of Statistics, Presidemcy College, Indien for at hjælpe i statistisk analyse. Vi vil gerne takke Dr. Celso A. Reis for levering af anti-MUC2, anti-MUC5AC og anti-MUC6 monoklonale antistoffer.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatterne' original indsendt filer til billeder. 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc Forfatternes oprindelige fil til figur 5

• Udmærkelser i gastrisk cancer genekspression signaturer afledt af laser capture microdissection versushistologic macrodissection
• Airway cellularitet, lipid lastet makrofager og mikrobiologi af mavesaft og luftveje hos børn med refluksøsofagitis