perfil de expresión de mucinas (MUC2, MUC5AC y MUC6) en Helicobacter pylori infecta pre-neoplásicas y neoplásicas perfil gástrico humano Expresión epithelium

de mucinas (MUC2, MUC5AC y MUC6) en Helicobacter pylori
infectados epitelio gástrico humano pre-neoplásicas y neoplásicas
Extracto
Antecedentes
Helicobacter pylori gratis (H. pylori
) causa gastritis y metaplasia intestinal (MI) que puede evolucionar a carcinoma gástrico. El objetivo de este estudio fue comparar el perfil de mucinas en las etapas progresivas de H. pylori
epitelio gástrico humano infectado pre-neoplásicas y neoplásicas. Se utilizó un panel de anticuerpos monoclonales con especificidades bien definidas de MUC2, MUC5AC y MUC6 para caracterizar el patrón de expresión de mucinas por inmunohistoquímica.
Métodos
RUT y ELISA estaban abajo para H. pylori
confirmación. secciones de biopsia gástrica humana se tiñeron utilizando inmunohistoquímica con MUC2, MUC5AC y MUC6 anticuerpos.
Resultados
MUC5AC se expresan en el epitelio superficial y la parte superior de las fosas gástricas. expresión MUC6 se detectó en la parte inferior de las glándulas gástricas. MUC2 se expresó en metaplasia intestinal, principalmente en las células caliciformes. El perfil de expresión de mucina en las etapas progresivas de H. pylori
infectado epitelio gástrico humano permite la identificación de metaplasia intestinal, que se caracteriza por una disminución de expresión de las mucinas gástricos (MUC5AC y MUC6) y de novo
expresión de MUC2.
conclusión
en conclusión, nuestros resultados sugieren que no se altera la expresión de MUC5AC y MUC6 junto con la expresión aberrante de MUC2 en la metaplasia intestinal, durante el proceso de la carcinogénesis gástrica. El presente estudio indica que el patrón de expresión de mucina MUC2 es un marcador fiable de la metaplasia intestinal, que aparece en el contexto de los individuos infectados por H. pylori
.
Antecedentes
Helicobacter pylori coloniza la mucosa gástrica
humana y provoca gastritis y metaplasia intestinal (MI), que puede evolucionar hacia un carcinoma gástrico [1-3]. H. pylori
la infección se estableció como un carcinógeno humano tipo I en la IARC [4]; recientemente se ha demostrado que las bacterias también son capaces de inducir gastritis, IM, y carcinoma gástrico en gerbos de Mongolia [5-8]. En los seres humanos, H. pylori
también coloniza la mucosa duodenal cada vez que hay metaplasia gástrica [9]. H. pylori
infección en humanos depende por lo tanto en el microambiente gástrico, que se determina en gran medida por la composición de mucina y de hidratos de carbono de la capa de mucina gástrica.
Las mucinas son glicoproteínas fuertemente glicosiladas que que son los principales componentes de el gel viscoso mucosa que cubre los tejidos epiteliales de la superficie [10]. Hasta la fecha, nueve genes de mucina distintos (MUC1 epiteliales, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7, y 8) se han identificado [11-21]. En situ
hibridación y los estudios inmunohistoquímicos han demostrado que estas mucinas se expresan diferencialmente en los epitelios con especificidad de tipo celular [21-24]. La mucosa gástrica normal muestra los tipos de células de expresión específica de MUC1, MUC5AC y MUC6, con dos primeros mucinas encontradas en el epitelio superficial y MUC6 en las glándulas profundas [22, 25, 26]. MUC6 se expresa principalmente en la mucosa gástrica. La mucosa gástrica normal no expresa MUC2 [25, 27].
Los cambios en los niveles de expresión y patrones de glicosilación de las mucinas se han asociado con varias enfermedades, incluyendo carcinomas [27-31]. En el cáncer gástrico, se han reportado alteraciones en mucina polipéptido: pérdida de la expresión de MUC5AC [23, 26, 32], el aumento de mucina heterogenesity [23]. Estas observaciones sugieren que las alteraciones de mucina pueden ser considerados como marcadores moleculares "" de la transformación maligna de la mucosa gástrica. Adicionalmente, en una investigación publicada recientemente sugiere fuertemente MUC5AC como un putativo H. pylari
receptor [33, 34].
En el presente estudio, hemos caracterizado el patrón de expresión de mucinas en las etapas progresivas de H. pylori
infectado carcinoma gástrico humano. Hemos utilizado un panel amplio de anticuerpos monoclonales, con especificidades bien caracterizado dirigidos a MUC2, MUC5AC y MUC6 mucinas.
Resultados
patrón de expresión de MUC2, MUC5AC y MUC6 mucinas en la mucosa gástrica normal
MUC5AC era altamente expresado en el epitelio foveolar y las células mucosas del cuello de antro (>. 75%, Fig 1B; la Fig. 3b, Tabla 2). se detectó expresión de MUC6 en las glándulas del antro (> 75%, Fig 1c;. Fig. 3c; Tabla 3) y MUC2 no se detectó en la mucosa gástrica normal (Fig 1a;. la Fig. 3a, Tabla 2). Figura 1 tinción inmunohistoquímica de mucinas MUC2, MUC5AC y MUC6 en H. pylori pacientes infectados. a. MUC2 tinción de la mucosa gástrica normal (Aumento original x 100). segundo. MUC5AC tinción de la mucosa gástrica normal (Aumento original x 100). do. MUC6 tinción de la mucosa gástrica normal (Aumento original x 100). re. MUC2 tinción de la gastritis atrófica (Aumento original x 100). mi. MUC5AC tinción de la gastritis atrófica (Aumento original x 100). F. tinción MUC6 de la gastritis atrófica (Aumento original x 100). gramo. MUC2 tinción de la metaplasia intestinal (Aumento original x 100). marido. MUC5AC tinción de la metaplasia intestinal (Aumento original x 100).
Figura 2 tinción inmunohistoquímica de MUC2, MUC5AC y MUC6 mucinas en H. pylori pacientes infectados. a. MUC6 tinción de la metaplasia intestinal (Aumento original x 100). segundo. tinción MUC2 de displasia (Aumento original x 100). do. MUC5AC tinción de displasia (Aumento original x 100). re. tinción MUC6 de displasia (Aumento original x 100). mi. tinción MUC2 de carcinoma (Aumento original x 100). F. MUC5AC tinción de carcinoma (Aumento original x 100). gramo. tinción MUC6 del carcinoma (Aumento original x 100).
Figura 3 Patrón de expresión de mucinas (MUC2, MUC5AC y MUC6) en H. pylori infecta pre-neoplásicas y el epitelio gástrico humano neoplásica. a. MUC2 expresión en H. pylori
infectado pre-neoplásicas y el epitelio gástrico humano neoplásica. segundo. MUC5AC expresión en H. pylori
epitelio gástrico humano infectado pre-neoplásicas y neoplásicas. do. MUC6 expresión en H. pylori
infectado pre-neoplásicas y el epitelio gástrico humano neoplásica.
Tabla 1 Características específicas, orígenes y diluciones de los anticuerpos monoclonales.
monoclonales anticuerpo
Especificidad
referencia
dilución
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
sin diluir
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tabla 2 Expresión de mucinas (MUC2, MUCSAC y MUC6) en H. pylori
infectada pre-neoplásicas y neoplásicas del epitelio gástrico humano
Stages

H. pylori
Expresión MUC2
MUC5AC expresión
Expresión MUC6
N
P -
+
++
+++ ++++

- + ++

+++ ++++

- + +
+
+++ ++++

normal (n = 7) página 7 -
n = 7 (100%) -
-
- CD - CD - CD - -
n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) -
-
-
1 (14,3%) página 6 (85,7%)
La gastritis atrófica (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) CD - CD - CD - CD -
- 1 (38%) página 13 (50%) página 12 (46,2%)
-
- 1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
metaplasia intestinal (n = 21)
- 21
- -
n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** CD -
- 1 (4,8%)
16 ( 76,2%) ** página 4 (19%) -
- página 5 (23,8%) página 14 (66,7%) ** página 2 (9,5%)
-
Displasia (n = 17)
- 17 -
n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5.9 %) -
- página 3 (17,6%)
10 (58,8%) página 4 (23,5%) -
- página 3 (17,6%) página 11 (64,7%) página 3 (17,3%) -
Carcinoma (n = 36)
- 36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%)
- - -
28 (77,8%) página 8 (22,2%) -
- página 12 (33,3% ): perfil 17 (47,2%): perfil 7 (19,4%) CD -
- N - negativo - (> 5%) negativo
P - positivo + (5-25%) pocas células positivas
n - Número de casos ++ (25-50%) bien definidos area Estados +++ (50- 75%) extensa área manchada
++++ (75-100%) la mayoría de las células teñidas
** p < 0,00, * p < 0,05 (diferencia significativa en la expresión)
La inmunodetección de mucinas en gastritis atrófica
No había expresión de MUC5AC en todos los casos de células columnares (Fig 1E;. La Fig. 3b, Tabla 2). El porcentaje de células teñidas varió de un caso a otro, en la mayoría de los casos, se observó una tendencia para una mayor número de células que expresan MUC5AC (> 75%) en la parte superficial de las glándulas de metaplasia que en parte profunda. MUC6 se detectó en células columnares (> 50%; Fig. 1f; Fig. 3c; Tabla 2) y MUC2 no se detectó en gastritis atrófica (Fig 1d.)
La inmunodetección de las mucinas en la metaplasia intestinal
Hay. se redujo nivel de expresión de MUC5AC y MUC6 en todos los casos (> 50%), tanto en la copa y en las células columnares (Fig 1 h, la figura 2a;... la Fig. 3b, Fig 3c; Tabla 2). El porcentaje de células teñidas varió de un caso a otro, se observó de novo
expresión de mucina intestinal MUC2 (> 75%), y su expresión está representada un patrón citoplasmático difusa en las células caliciformes (Fig 1 g;. La Fig. 3a; . Tabla 2)
La inmunodetección de las mucinas en la displasia
No se disminuyó nivel de expresión de MUC5AC y MUC6, de metaplasia intestinal (> 50%). MUC5AC y MUC6 muestran un patrón de expresión citoplasmática difusa en las células columnares (Fig 2c;. La Fig. 2D; Fig. 3d; Fig. 3, Tabla 2). expresión MUC2 muestra un patrón citoplasmático difusa en las células cubiletes (> 50%, Fig 2b; la Fig. 3a, Tabla 2)
La inmunodetección de mucinas en carcinoma
MUC5AC y MUC6 expresión se observa frecuentemente en el carcinoma temprano (>.; 50%) que los carcinomas avanzados (> 25%). En carcinomas avanzados, se observó una tendencia para inmunoreactividad disminuido en zonas profundas que en las zonas superficiales. MUC5AC y MUC6 expresiones se redujeron en carcinomas avanzados (> 25%; Figura 3a; la Fig. 3b;. Fig. 3c; Fig. 2E, Fig 2F, Fig 2 g;.. Tabla 2). Discusión
en el presente estudio, hemos demostrado que el patrón de expresión mucinas en las etapas progresivas de H. pylori
epitelio gástrico humano infectado. Las mucinas se expresan con un patrón por células y de tejidos específicos en el tejido normal. Las alteraciones del patrón de expresión de mucinas se han descrito en carcinomas, así como en sus lesiones precursoras; en los últimos alterados mucina restos, carbohidratos y péptidos pueden constituir marcadores moleculares de mayor riesgo de transformación maligna [27, 35, 36, 38-40].
De acuerdo con estudios anteriores informar de la distribución de mucinas en el estómago normal, encontrado MUC5AC es altamente expresado en células foveolares de antro, según ha informado [26, 27, 32, 37-39]. También se encontró que MUC6 se expresa en las células mucosas de la zona del cuello en las glándulas pilórica del antro con patrón similar a la descrita anteriormente [22, 23, 47]. La expresión de MUC2 generalmente no se detectó en mucosa gástrica normal como se describe en los informes anteriores [25, 27, 40].
Metaplasia intestinal es una de las lesiones identificadas en la cascada de eventos que precede al desarrollo de carcinoma gástrico [ ,,,0],41]. metaplasia intestinal comprende la sustitución de la mucosa gástrica por un epitelio que se parece histológicamente la mucosa intestinal. los patrones de expresión de mucina alterados se han observado en H. pylori
metaplasia intestinal infectado, incluso debajo de la expresión de MUC5AC y MUC6 y de novo
expresión de MUC2 principalmente en las células caliciformes [30, 48]. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la metaplasia intestinal sí representa una diferenciación de la mucosa hacia un fenotipo intestinal [42, 43]. México La disminución de expresión de MUC5AC y MUC6 mucina en carcinomas gástricos se confirmaron en el presente estudio. La expresión de MUC5AC en el carcinoma gástrico precoz de la presente serie, independientemente del tipo histológico de los tumores, contrasta con la expresión disminución del nivel de MUC5AC inmunoreactividad en casi la mitad de los carcinomas avanzados que sugieren que todos los carcinomas gástricos retienen al menos algunas células con un fenotipo gástrica durante las primeras etapas de desarrollo neoplásico (26). Esta hipótesis se ve apoyada por la inmunoreactividad disminuido en las zonas profundas comparación con las áreas superficiales de los carcinomas avanzados. Estos resultados están de acuerdo con los resultados anteriores que muestran que la progresión del cáncer gástrico es acompañado por la alteración de la expresión de varios genes de mucina [14]. Finalmente, se observó que la mucina intestinal MUC2 se expresa en cada metaplasia intestinal, que es una lesión que aparece durante el proceso de la carcinogénesis gástrica en el contexto de las personas infectadas por H. pylori
.
Conclusión Aunque
H .
pylori ha sido clasificado como un carcinógeno de clase I por la IARC [4] el mecanismo de la carcinogénesis gástrica sigue siendo poco conocida. En la mucosa gástrica pre-neoplásicas, la expresión de todos los tres antígenos de mucina no parece correlacionarse con la gravedad de la inflamación y el H. pylori
de estado. Los resultados del presente estudio pueden sugerir que la infección por H. pylori actos
como un iniciador de esta cascada carcinogénesis mediante la inducción de la inflamación y, en algunos casos, el cambio metaplásico posterior. metaplasia intestinal se acompaña de la inducción de la expresión MUC2 y disminución de la expresión de MUC5AC y MUC6. Estas alteraciones pueden favorecer el desarrollo de carcinoma gástrico. El presente estudio sugiere que MUC2 es un marcador de metaplasia intestinal y puede utilizarse para la detección precoz de esta lesión en H. pylori
infectada pre-neoplásica epitelio gástrico humano.
Materiales y métodos
Tissue muestras
Cincuenta y nueve muestras de biopsias gástricas y 3 ml de sangre se obtuvieron de Stanley Colegio Médico y hospital, Chennai. Todas las muestras de tejido de biopsia se recogieron después de consentimiento informado. Este estudio se llevó a cabo después de obtener el visto bueno de la junta de ética del hospital. Todas las muestras de biopsia fueron fijadas en 10% formalina tamponada y rutinariamente embebidos en cera de parafina. 4 micras de serie de secciones delgadas fueron cortadas y utilizados para inmunohistoquímica. H. pylori
infección fue confirmada por RUT y ELISA [43]. Hematoxilina y eosina secciones teñidas se utilizan para clasificar la gastritis graduada según la clasificación de Sydney revisada [44], tumores gástricos de acuerdo con la clasificación de Lauren [45] y la clasificación de la OMS [46]. Se estudiaron 7 casos de epitelio gástrico humano normal (7 biopsias), 26 casos de gastritis atrófica (26 biopsias), 21 casos de metaplasia intestinal (21 biopsias), 17 casos de displasia (17 biopsias) y 36 casos de carcinoma en la que 21 casos de carcinoma temprano y 15 casos de carcinoma avanzado (16 biopsias y piezas quirúrgicas 20).
los anticuerpos monoclonales
Un panel de tres anticuerpos monoclonales se utilizó para determinar la expresión de mucinas (MUC2, MUC5AC y MUC6). Las especificidades, las referencias y las diluciones de los anticuerpos se enumeran en la Tabla 1.
inmunohistoquímica
Las secciones de tejidos gástricos normales, preneoplásicas y neoplásicas fueron inmuno manchado de acuerdo con Reis et al
[47] con ligeras modificaciones . Secciones diseñado para el tratamiento de la neuraminidasa se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 y se incubaron con neuraminidasa de Clostridium perfringens Tipo VI
(Sigma; St Louis, MO) diluido en tampón 0,1 M de acetato de Na, pH 5,5 a una concentración final de 0,1 U /ml. La incubación se llevó a cabo durante 2 horas a 37 ° C y fue seguido por tres lavados en PBS enfriado en hielo. Las secciones se trataron con 0,5% H 2O 2 en metanol durante 30 min, seguido por 20 min de incubación con suero no inmune de conejo. Las secciones se aclararon y se incubaron con el anticuerpo primario (Tabla 1), durante la noche a 4 ° C. Las secciones se lavaron y se incubaron con HRP conjucated conejo anti-ratón anticuerpo secundario (dilución 1: 100) durante 1 h seguido de lavado con PBS y se desarrollo con 0,05% de 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) (SRL, Mumbai, India ) recién preparada en PBS que contenía 0,1% de H 2O 2. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina contador, se deshidrataron y se montaron. Todas las series incluyendo los controles positivos y negativos se realizaron por sustitución de los mAbs primaria con inmunoglobulinas de la misma clase y a la misma concentración.
De puntuación de la expresión de mucinas en H. pylori
infectado tejidos gástricos humanos pre-neoplásicas y neoplásicas
se utilizó un enfoque cuantitativo para anotar el semi inmunotinción de tejidos gástricos humanos. Las diapositivas fueron examinadas bajo microscopio de luz, cada 100 células fueron anotados en cinco campos diferentes y los resultados se expresaron como porcentaje de la media. (-), Negativo; +, pocas células positivas (< 25%); ++ Áreas bien definidas con células positivas (25-50%); +++, extensas áreas con células positivas (50-75%); ++++, la mayoría de las células teñidas (> 75%). estadísticas
análisis de los datos se realizó mediante el paquete estadístico SPSS 10.0 para Windows. La prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher se utilizó para analizar las diferencias en las frecuencias. Se utilizó la prueba de correlación de Spearman para analizar correlación entre los parámetros. P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
abreviaciones
DAB - 3:.
Clorhidrato de tetra 3'-diaminobencidina
ELISA:
inmunoenzimático ensayo de
HRP:
peroxidasa de rábano picante
IARC:
Agencia Internacional para la Investigación sobre el cáncer

MI:
La metaplasia intestinal
anticuerpos monoclonales: Los anticuerpos monoclonales

PBS: Tampón fosfato
solución salina
OMS: Organización Mundial de la Salud

RUT:.
rápido urea prueba

Declaraciones
Agradecimientos
los autores agradecen la confianza del monumento Señora Tata, Mumbai, India para el apoyo financiero a uno de los autores S. Durai Babu. Estamos agradecidos al Dr. Narasimhan, Profesor y Jefe del Departamento de Patología, Sri Ramachandra Colegio Médico y Hospital, la India, para la revisión de los resultados histológicos e inmunohistoquímicos y el Dr. R. Ravanan, lector, del Departamento de Estadística, Presidemcy College, de la India para ayudar en el análisis estadístico. Nos gustaría agradecer al Dr. Celso A. Reis para el suministro de la anti-MUC2, anti-MUC5AC y los anticuerpos monoclonales anti-MUC6. 'Archivos originales presentados para las imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los autores de los autores
original de expediente sometido a las imágenes. 'archivo original para la figura 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc autores 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Autores archivo original para la figura 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc autores archivo original para la figura 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc autores archivo original para el archivo original de la figura 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc los autores de la figura 5

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