Profil d'expression des mucines (MUC2, MUC5AC et MUC6) à Helicobacter pylori infecté prénéoplasique et gastrique profil epithelium

d'expression humaine néoplasique de mucines (MUC2, MUC5AC et MUC6) à Helicobacter pylori
infecté épithélium gastrique humain pré-néoplasiques et néoplasiques
Résumé de l'arrière-plan
Helicobacter pylori
(H. pylori
) provoque la gastrite et la métaplasie intestinale (GI) qui peuvent évoluer vers un carcinome gastrique. L'objectif de cette étude était de comparer le profil de mucines dans les étapes progressives de H. pylori
épithélium gastrique humaine pré-néoplasiques et néoplasiques infecté. Nous avons utilisé un panel d'anticorps monoclonaux ayant des spécificités bien définies de MUC2, MUC5AC et MUC6 pour caractériser le profil d'expression des mucines par immunohistochimie.
Méthodes
RUT et ELISA ont diminué pour la confirmation de H. pylori. Résultats de coupes de biopsies gastriques humaines ont été colorés par immunohistochimie avec MUC2, MUC5AC et des anticorps MUC6.
MUC5AC a été exprimée dans l'épithélium superficiel et la partie supérieure des fosses gastriques. l'expression MUC6 a été détectée dans la partie inférieure des glandes gastriques. MUC2 a été exprimée dans la métaplasie intestinale, la plupart du temps dans des cellules caliciformes. épithélium gastrique humain Le profil d'expression de mucine dans les étapes progressives de H. pylori
infecté permet l'identification de la métaplasie intestinale, qui se caractérise par une diminution de l'expression des mucines gastriques (MUC5AC et MUC6) et de novo
expression de MUC2.
conclusion
en conclusion, nos résultats suggèrent qu'il y est modifié l'expression de MUC5AC et MUC6 conjointement avec l'expression aberrante de MUC2 dans la métaplasie intestinale, pendant le processus de cancérogenèse gastrique. La présente étude indique que le modèle d'expression mucine MUC2 est un marqueur fiable de la métaplasie intestinale, qui apparaît dans le contexte de H. pylori
individus infectés.
Contexte
Helicobacter pylori
colonise la muqueuse gastrique humaine et provoque la gastrite et la métaplasie intestinale (GI), qui peut évoluer vers un carcinome gastrique [1-3]. l'infection de H. pylori a été créé en tant que type I cancérigène pour l'homme dans le CIRC [4]; il a été récemment démontré que les bactéries sont également capables d'induire la gastrite, la messagerie instantanée, et le carcinome gastrique gerbilles de Mongolie [5-8]. Chez l'homme, H. pylori
colonise aussi la muqueuse duodénale chaque fois qu'il ya une métaplasie gastrique [9]. H.pylori
infection chez l'homme est donc dépendante de la micro-gastrique, qui est déterminé dans une large mesure par la composition de mucine et d'hydrate de carbone de la couche de mucine gastrique.
Les mucines sont des glycoprotéines fortement glycosylées qui sont les principaux composants de le gel visqueux muqueuse recouvrant la surface des tissus épithéliaux [10]. À ce jour, neuf gènes de mucine épithéliales distincts (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7 et 8) ont été identifiés [11-21].
In situ et l'hybridation des études immunohistochimiques ont montré que ces mucines sont exprimés de manière différentielle dans les épithéliums à spécificité de type cellulaire [21-24]. La muqueuse gastrique normale montre des types de cellules spécifiques de l'expression de MUC1, MUC5AC, et MUC6, avec deux premiers mucines présents dans l'épithélium superficiel et MUC6 dans les glandes profondes [22, 25, 26]. MUC6 est principalement exprimé dans la muqueuse gastrique. La muqueuse gastrique normale ne reflète pas MUC2 [25, 27]. Les changements dans des niveaux d'expression et des motifs de glycosylation de mucines ont été associées à de nombreuses maladies, y compris les cancers [27-31]. Dans le cancer gastrique, des altérations de la mucine polypeptide ont été rapportées: perte d'expression de MUC5AC [23, 26, 32], l'augmentation de la mucine heterogenesity [23]. Ces observations suggèrent que des altérations de mucine peuvent être considérés comme des marqueurs moléculaires "" de la transformation maligne de la muqueuse gastrique. De plus, une enquête récemment publiée suggère fortement MUC5AC comme récepteur d'un H. pylari putative [33, 34].
Dans la présente étude, nous avons caractérisé le modèle de mucines expression dans les étapes progressives de H. pylori
infecté carcinome gastrique humain. Nous avons utilisé un panel complet d'anticorps monoclonaux, avec des spécificités bien caractérisées dirigées vers MUC2, MUC5AC et MUC6 mucines.
Motif d'expression de résultats de MUC2, MUC5AC et MUC6 mucines dans la muqueuse gastrique normale
MUC5AC a été très (3b figure;; >.; 75%, la figure 1b. Tableau 2) exprimée dans l'épithélium fovéolaire et les cellules muqueuses du collet de antrum. L'expression de MUC6 a été détectée dans les glandes du sinus maxillaire (> 75%, de la figure 1c;. La figure 3c;. Tableau 3) et MUC2 n'a pas été détectée dans la muqueuse gastrique normale (figure 1a;.. La figure 3a; tableau 2). Figure 1 coloration immunohistochimique de MUC2, MUC5AC et MUC6 mucines chez H. pylori chez les patients infectés. une. MUC2 coloration de la muqueuse gastrique normale (grossissement original × 100). b. MUC5AC coloration de la muqueuse gastrique normale (grossissement original × 100). c. MUC6 coloration de la muqueuse gastrique normale (grossissement original × 100). ré. coloration MUC2 de gastrite atrophique (grossissement original × 100). e. MUC5AC coloration de la gastrite atrophique (grossissement original × 100). F. coloration MUC6 de gastrite atrophique (grossissement original × 100). g. MUC2 coloration des Intestinal métaplasie (grossissement original × 100). h. MUC5AC coloration des Intestinal métaplasie (grossissement original × 100).
Figure 2 immunohistochimique coloration des MUC2, MUC5AC et MUC6 mucines chez H. pylori patients infectés. une. MUC6 coloration des Intestinal métaplasie (grossissement original × 100). b. coloration MUC2 de dysplasie (grossissement original × 100). c. MUC5AC coloration de la dysplasie (grossissement original × 100). ré. coloration MUC6 de dysplasie (grossissement original × 100). e. coloration MUC2 du carcinome (grossissement original × 100). F. MUC5AC coloration du carcinome (grossissement original × 100). g. MUC6 coloration du carcinome (grossissement original × 100).
Figure 3 Expression modèle de mucines (MUC2, MUC5AC et MUC6) dans H. pylori infecté pré-néoplasiques et de l'épithélium gastrique humaine néoplasique. une. expression MUC2 chez H. pylori
infecté pré-néoplasiques et de l'épithélium gastrique humaine néoplasique. b. expression MUC5AC chez H. pylori
épithélium gastrique humaine pré-néoplasiques et néoplasiques infecté. c. expression MUC6 chez H. pylori
infecté pré-néoplasiques et de l'épithélium gastrique humaine néoplasique.
Tableau 1 Spécificités, origines et dilutions des anticorps monoclonaux.
Monoclonal anticorps
Spécificité
Référence
dilution
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
Undiluted
Reis CLH2
MUC5AC et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tableau 2 expression de mucines (MUC2, MUCSAC et MUC6) à H. pylori
infecté pré-néoplasiques et néoplasiques gastrique humaine épithélium
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
Expression MUC6
N
P
- +
++
+++
++++
- +
++ +++

++++
- +
+ +
+++
++++
normal (n = 7)
7
- n = 7 (100%)
- -
-
-
- -
- n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%)
-
- -
1 (14,3%)
6 (85,7%)
gastrite atrophique (n = 26)
- 26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%)
- -
- -
- 1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
-
- 1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
métaplasie intestinale (n = 21)
- 21
-
- n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) **
-
- 1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
4 (19%)
-
- 5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
dysplasie (n = 17)
- 17
- n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5.9 %)
-
- 3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%)
-
- 3 (17,6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%)
- Carcinome (n = 36)
- 36
- 22 (61,1%)
14 (38,9%)
- -
- 28 (77,8%)
8 (22,2%)
-
- 12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%)
-
- N - négatif - (> 5%)
négatif P - positif + (5-25%) quelques cellules positives
n - Nombre de cas ++ (25-50%) bien définis zone
+++ (50- 75%) zone tachée vaste
++++ (75-100%), la plupart des cellules colorées
** p < 0,00, * p < 0,05 (différence significative dans l'expression)
immunodétection de mucines dans gastrite atrophique
Il était l'expression de MUC5AC dans tous les cas de cellules cylindriques (figure 1E; 3b Fig;.. Tableau 2). Le pourcentage de cellules colorées varie d'un cas à la plupart des cas, il y avait une tendance pour le nombre plus élevé de cellules exprimant MUC5AC (> 75%) dans la partie superficielle des glandes métaplasiques que dans une partie profonde. MUC6 a été détectée dans les cellules colonnaires (> 50%;. La figure 1f; 3c figure;. Le tableau 2) et MUC2 n'a pas été détectée dans la gastrite atrophique immunodétection de (figure 1d.) De mucines dans la métaplasie intestinale
Il. a diminué l'expression du niveau de MUC6 MUC5AC et dans tous les cas (> 50%), aussi bien en coupe et dans les cellules colonnaires (figure 1 heure, la figure 2a; 3c la figure 3b, la figure;.... Tableau 2). Le pourcentage de cellules colorées varie d'un cas à, de novo
expression de l'intestin mucine MUC2 a été observée (> 75%), et son expression affiche un motif cytoplasmique diffuse dans les cellules caliciformes (figure de 1g;.. Fig 3a; . Tableau 2)
de immunodétection de mucines dans la dysplasie
Il a diminué l'expression du niveau de MUC5AC et MUC6, que la métaplasie intestinale (> 50%). Et MUC5AC MUC6 affichent un profil d'expression cytoplasmique diffuse dans les cellules colonnaires (figure 2c;. La figure 2d;. La figure 3d;.. La figure 3, tableau 2). expression MUC2 affiche un motif cytoplasmique diffuse dans les cellules des gobelets (> 50%, la figure 2b;. la figure 3a; tableau 2) de immunodétection de mucines dans le carcinome
MUC5AC et d'expression MUC6 ont été fréquemment observées dans le cancer précoce (>.; 50%) que les carcinomes avancés (> 25%). Dans les carcinomes avancés, nous avons observé une tendance à la diminution de l'immunoréactivité dans les zones profondes que dans les zones superficielles. Discussion de
MUC5AC et MUC6 expressions ont diminué dans les carcinomes avancés (tableau 2 > 25%; la figure 3a;. La figure 3b;.. La figure 3c;.; La figure 2e, la figure 2f, la figure 2g..). dans la présente étude, nous avons montré que le modèle de mucines expression dans les étapes progressives de H. pylori
épithélium gastrique humain infecté. Les mucines sont exprimés avec un motif de cellules et de tissu-spécifique dans les tissus normaux. Des modifications du motif d'expression de mucines ont été décrits dans les cancers, ainsi que dans leurs précurseurs; dans ces derniers, modifiés mucine d'hydrates de carbone et de peptides fragments peuvent constituer des marqueurs moléculaires de risque accru de transformation maligne [27, 35, 36, 38-40].
En accord avec les études précédentes de rapports de la distribution de mucines dans l'estomac normal, nous trouvé MUC5AC est fortement exprimé dans les cellules fovéolaires de antrum, tel que rapporté [26, 27, 32, 37-39]. Nous avons également constaté que MUC6 est exprimée dans les cellules muqueuses de la zone du cou dans les glandes pyloriques du sinus maxillaire avec un motif similaire à celui décrit précédemment [22, 23, 47]. L'expression de la MUC2 était habituellement pas détectée dans la muqueuse gastrique normale telle que décrite dans les rapports antérieurs [25, 27, 40].
Est une métaplasie intestinale des lésions identifiées dans la cascade d'événements qui précède le développement d'un carcinome gastrique [ ,,,0],41]. la métaplasie intestinale comprend le remplacement de la muqueuse gastrique par un epithelium qui ressemble histologiquement la muqueuse intestinale. les profils d'expression de mucine Altered ont été observées chez H. pylori
métaplasie intestinale infecté, y compris sous l'expression de MUC5AC et MUC6 et de novo
expression de MUC2 principalement dans les cellules caliciformes [30, 48]. Ces résultats soutiennent l'hypothèse que la métaplasie intestinale ne représente une différenciation de la muqueuse vers un phénotype intestinal [42, 43].
La diminution de l'expression MUC5AC et MUC6 mucine dans les carcinomes gastriques ont été confirmés dans la présente étude. L'expression de MUC5AC dans le carcinome gastrique au début de la présente série, quel que soit le type histologique des tumeurs, contraste avec l'expression de baisse du niveau des MUC5AC immunoréactivité dans presque la moitié des cancers avancés qui suggèrent que tous les carcinomes gastriques conservent au moins quelques cellules avec un phénotype gastrique pendant les premières étapes du développement néoplasique (26). Cette hypothèse est étayée par la diminution de l'immunoréactivité dans les zones profondes par rapport aux zones superficielles des carcinomes avancés. Ces résultats sont en accord avec les résultats antérieurs montrant que la progression du cancer de l'estomac est accompagnée par une altération de l'expression de plusieurs gènes de mucine [14]. Enfin, nous avons observé que la mucine intestinale MUC2 est exprimée dans tous les métaplasie intestinale, ce qui est une lésion qui apparaît pendant le processus de carcinogenèse gastrique dans le contexte de H. pylori
individus infectés.

Conclusion Bien H . pylori
a été classé en tant que classe I carcinogène par l'IARC [4] le mécanisme de la carcinogenèse gastrique reste mal comprise. Dans la muqueuse gastrique prénéoplasique, l'expression de tous les trois antigènes de mucine ne semble pas être en corrélation avec la gravité de l'inflammation et de l'état de H. pylori. Les résultats de la présente étude peuvent suggérer que H. pylori infection
agit comme un initiateur de cette carcinogenèse cascade en induisant l'inflammation et, dans certains cas, le changement métaplasique ultérieure. la métaplasie intestinale est accompagné par l'induction de l'expression MUC2 et une diminution de l'expression de MUC6 et MUC5AC. Ces altérations peuvent favoriser le développement de cancer de l'estomac. La présente étude suggère que MUC2 est un marqueur de la métaplasie intestinale et peut être utilisé pour la détection précoce de cette lésion chez H. pylori
épithélium gastrique humaine pré-néoplasique infecté. Matériaux et méthodes
Tissue échantillons
Cinquante-neuf échantillons de biopsie gastrique et 3 ml de sang ont été obtenus à partir de Stanley Medical College et l'hôpital, Chennai. Tous les échantillons de tissu de biopsie ont été prélevés après leur consentement éclairé. Cette étude a été réalisée après avoir obtenu l'autorisation du comité d'éthique de l'hôpital. Tous les échantillons de biopsie ont été fixés dans 10% de formaline tamponnée et systématiquement intégrées dans la cire de paraffine. 4 sections um série minces ont été coupés et utilisés pour l'immunohistochimie. l'infection de H. pylori a été confirmée par RUT et ELISA [43]. Hématoxyline et éosine sections colorées ont été utilisées pour classer les gastrites classés selon la classification de Sydney révisé [44], les tumeurs gastriques selon la classification de Lauren [45] et de classification de l'OMS [46]. Nous avons étudié 7 cas de l'épithélium gastrique humain normal (7 biopsies), 26 cas de gastrite atrophique (26 biopsies), 21 cas de Intestinal métaplasie (21 biopsies), 17 cas de dysplasie (17 biopsies) et 36 cas de carcinome dans lequel 21 cas de carcinome précoce et 15 cas avancés de carcinome (16 biopsies et 20 prélèvements chirurgicaux). les anticorps monoclonaux
Un panel de trois anticorps monoclonaux a été utilisé pour déterminer l'expression des mucines (MUC2, MUC5AC et MUC6). Les spécificités, des références et des dilutions des anticorps sont énumérés dans le tableau 1.
immunohistochimie de Sections de tissus gastriques normaux, pré-néoplasiques et néoplasiques ont été immuno colorées selon Reis et al
[47] avec de légères modifications . Sections conçues pour le traitement de la neuraminidase ont été lavées deux fois dans du tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4 et on fait incuber avec de la neuraminidase à partir de clostridium perfringens type VI
(Sigma, St Louis, MO) dilué dans du tampon 0,1 M d'acétate de sodium, pH 5,5 à une concentration finale de 0,1 U /ml. L'incubation a été effectuée pendant 2 h à 37 ° C et a été suivi par trois lavages dans du PBS glacé. Les coupes ont été traitées avec 0,5% de H 2 O 2 dans du methanol pendant 30 min, suivi par 20 minutes d'incubation avec du sérum non immun de lapin. Les coupes ont été rincées et incubées avec l'anticorps primaire (tableau 1), pendant une nuit à 4 ° C. Les sections sont rincées et incubées avec conjucated HRP de lapin anti-souris, un anticorps secondaire (dilution 1: 100) pendant 1 h, suivi d'un rinçage avec du PBS et en développant avec 0,05% de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (SRL, Mumbai, Inde ) fraîchement préparé dans du PBS contenant 0,1% de H 2 O 2. Les coupes ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline, déshydratées et montées. Toutes les séries y compris les contrôles positifs et négatifs ont été réalisées par substitution des mAbs primaires avec des immunoglobulines de la même classe et à la même concentration.
Notation de mucines expression dans H. pylori
infecté tissus gastriques humains pré-néoplasiques et néoplasiques
Une approche semi-quantitative a été utilisée pour marquer le immunocoloration des tissus gastriques humaines. Les lames ont été examinées sous microscope optique, 100 cellules ont été notées dans cinq domaines différents et les résultats ont été exprimés en pourcentage moyen. (-), négatif; +, quelques cellules positives (< 25%); ++ Zones bien définies avec des cellules positives (25-50%); +++, de vastes zones avec des cellules positives (50-75%); ++++, la plupart des cellules colorées (> 75%).
Statistiques de l'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel statistique SPSS 10.0 pour Windows. Le test du chi carré ou le test exact de Fisher a été utilisé pour analyser les différences de fréquences. Le test de corrélation de Spearman a été utilisé pour analyser la corrélation entre les paramètres. P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative
abréviations
DAB - 3:.
Chlorhydrate de tétra 3'-diaminobenzidine
ELISA:
immuno-enzymatique test
HRP:
peroxydase de raifort
IARC:
Agence internationale pour la recherche sur le Cancer

IM:
métaplasie intestinale
Acm:
anticorps monoclonaux
PBS:
tamponnée au phosphate saline
OMS:
Organisation mondiale de la Santé
RUT:.
Rapid urée test

Déclarations
Remerciements
les auteurs remercient la Dame Tata Memorial Trust, Mumbai, en Inde pour le soutien financier à l'un des auteurs S. Durai Babu. Nous remercions le Dr Narasimhan, professeur et chef, Département de pathologie, Sri Ramachandra Medical College et l'hôpital, en Inde, pour examiner les résultats histologiques et immunohistochimiques et Dr. R. Ravanan, lecteur, Département de la statistique, Presidemcy College, en Inde pour aider dans l'analyse statistique. Nous tenons à remercier le Dr Celso A. Reis pour la fourniture de l'anti-MUC2, anti-MUC5AC et des anticorps monoclonaux-MUC6 anti-. De fichiers originaux soumis pour les images
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