Expresie profil mucínu (MUC2, MUC5AC a MUC6) v Helicobacter pylori infikovaných preneoplastické a neoplastické humánne gastrický epithelium

výraz profil mucínu (MUC2, MUC5AC a MUC6) v Helicobacter pylori
infikované preneoplastické a neoplastické humánne žalúdočné epitel
abstraktné
pozadia
Helicobacter pylori
(H. pylori
) spôsobuje zápal žalúdka a črevné metaplázia (IM), ktorý môže vyvinúť tak, aby karcinómu žalúdka. Cieľom tejto štúdie bolo porovnať profil mucínu v postupných fázach H. pylori
infikovaný preneoplastické a neoplastické humánne žalúdočné epitel. Použili sme panel monoklonálnych protilátok s dobre definovanými špecifiká MUC2, MUC5AC a MUC6 charakterizovať expresného profilu mucins imunohistochemicky.
Metódy
RUT a ELISA boli po dobu H. pylori
potvrdenie. Ľudské gastrickej biopsie rezy boli zafarbené s použitím imunohistochémia s MUC2, MUC5AC a MUC6 protilátok.
Výsledky
MUC5AC bola vyjadrená v povrchovej epitelu a v hornej časti žalúdka jam. MUC6 expresie bola detekovaná v dolnej časti žalúdočných žliaz. MUC2 bol vyjadrený v črevnej metaplázia, väčšinou v pohárikových buniek. Mucín profil expresie v postupných fázach H. pylori
infikovanej ľudskej žalúdočnej epitel umožňuje identifikáciu črevnej metaplázia, ktorý sa vyznačuje zníženou expresiou žalúdočných mucínu (MUC5AC a MUC6) a de novo expresia
MUC2.
Záver
Záverom možno povedať, naše výsledky naznačujú, že je zmenená expresia MUC5AC a MUC6 spolu s aberantne expresiou MUC2 v črevnej metaplázia, počas procesu žalúdočné rakoviny. Táto štúdia ukazuje, že MUC2 mucín expresné vzor je spoľahlivým markerom črevnej metaplázia, ktorý sa objaví v súvislosti s H. pylori
infikovaných jedincov.
Pozadie
Helicobacter pylori kolonizuje
ľudskej žalúdočnej sliznici a spôsobuje zápal žalúdka a črevné metaplázia (IM), ktoré môžu vyvíjať smerom karcinómu žalúdka [1-3]. H. pylori
infekcia bola založená ako typ Aj ľudský karcinogén v IARC [4]; sa nedávno ukázalo, že baktérie sú tiež schopné vyvolať gastritídu, chát a žalúdočné karcinóm v mongolských Gerbil [5-8]. U ľudí, H. pylori kolonizuje
tiež sliznice duodena vždy, keď je žalúdočné metaplázia [9]. H. pylori
infekcie u človeka je teda závislá na žalúdočné mikroprostredie, ktorá je určená do značnej miery zo strany mucínu a sacharidov zloženie žalúdočného hlienu vrstvy.
Mucíny sú silne glykozylované glykoproteíny, ktoré sú hlavnými zložkami slizničnej viskózny gél krytie povrchových epiteliálnych tkanív [10]. K dnešnému dňu, deväť odlišné epiteliálne mucín gény (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7 a 8), u ktorých bolo zistené [11 až 21]. In situ hybridizácia stroje a imunohistochemické štúdie ukázali, že tieto Mucíny sú rozdielne exprimované v epitelu s typom bunky špecifickosťou [21-24]. Normálny žalúdočnej sliznice vykazuje typov buniek špecifickú expresiu MUC1, MUC5AC a MUC6, s prvými sa nachádzajú v povrchovej epitelu a MUC6 v hlbokých žliaz [22, 25, 26] dvoma mucínu. MUC6 je prevažne exprimovaný v žalúdočnej sliznici. Normálny žalúdočnej sliznice nevyjadruje MUC2 [25, 27].
Zmeny v úrovniach expresie a glykozylácia mucínu je spojená s niekoľkými chorôb, vrátane karcinómov [27-31]. V prípade rakoviny žalúdka, boli hlásené zmeny v mucínu polypeptid: strata expresie MUC5AC [23, 26, 32], zvýšenej mucín heterogenesity [23]. Tieto pozorovania naznačujú, že mucín zmeny môžu byť považované za "molekulárnych markerov" malígny transformáciu žalúdočnej sliznice. Ďalej potom, nedávno zverejnená vyšetrovanie silne navrhol MUC5AC ako domnelého H. pylari
receptor [33, 34].
V tejto štúdii sme vyznačujúci sa vzor expresie Mucíny v postupných fázach H. pylori
infikovaný ľudskou karcinómu žalúdka. Použili sme komplexné panel monoklonálne protilátky, s dobre charakterizované špecifiká zameraných na MUC2, MUC5AC a MUC6 mucins.
Výsledky
Expression vzor MUC2, MUC5AC a MUC6 mucins v normálnej žalúdočnej sliznici
MUC5AC bol vysoko vyjadrené v foveolární epitelu a mukóznych krku buniek antra (výťažok. 75%, 1b, obr. 3b, tabuľka 2). bola detekovaná expresia MUC6 v žliaz v dutine (viac ako 75%, obr 1c, obr. 3c, Tabuľka č. 3) a MUC2 sa v normálnej žalúdočnej sliznici nie je detekovaný (Obr 1a ,. Na obr. 3a, tabuľka 2). Obrázok 1 Imunohistochemické farbenie MUC2, MUC5AC a MUC6 mucins vo H. pylori infikovaných pacientov. a. MUC2 farbenie normálne žalúdočnej sliznice (pôvodné zväčšenie x 100). b. MUC5AC farbenie normálne žalúdočnej sliznice (pôvodné zväčšenie x 100). c. MUC6 farbenie normálne žalúdočnej sliznice (pôvodné zväčšenie x 100). d. MUC2 farbenie atrofickú gastritídu (pôvodné zväčšenie x 100). e. MUC5AC farbenie atrofickú gastritídu (pôvodné zväčšenie x 100). f. MUC6 farbenie atrofickú gastritídu (pôvodné zväčšenie x 100). g. MUC2 farbenie črevnej metaplázia (pôvodné zväčšenie x 100). h. MUC5AC farbenie črevnej metaplázia (pôvodné zväčšenie x 100).
Obrázok 2 Imunohistochemické farbenie MUC2, MUC5AC a MUC6 Mucíny v H. pylori infikovaných pacientov. a. MUC6 farbenie črevnej metaplázia (pôvodné zväčšenie x 100). b. MUC2 farbenie dysplázia (pôvodné zväčšenie x 100). c. MUC5AC farbenie dysplázia (pôvodné zväčšenie x 100). d. MUC6 farbenie dysplázia (pôvodné zväčšenie x 100). e. MUC2 farbenie karcinómu (pôvodné zväčšenie x 100). f. MUC5AC farbenie karcinómu (pôvodné zväčšenie x 100). g. MUC6 farbenie karcinómu (pôvodné zväčšenie x 100). Obrázok 3
expresného profilu mucínu (MUC2, MUC5AC a MUC6) v H. pylori infikovaných pre-neoplastických a neoplastické humánne žalúdočné epitel. a. MUC2 expresie v infikovaných H. pylori
pre-neoplastických a neoplastické humánne žalúdočné epitel. b. MUC5AC expresie v infikovaných H. pylori
preneoplastické a neoplastické humánne žalúdočné epitel. c. MUC6 výraz v H. pylori
infikované preneoplastické a neoplastické humánne žalúdočné epitel.
Tabuľka 1 Špecifiká, pôvod a riedenie monoklonálnych protilátok.
Monoclonal protilátka
Špecifickosť Logo Microton: referencie
Riedenie
PMH1
MUC2
Reis a kol
[11]
neriedený
CLH2
MUC5AC
Reis a kol
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis a kol
[10]
1: 2
Tabuľka 2 Expresia mucínu (MUC2, MUCSAC a MUC6) v H. pylori
infikovanej pre-neoplastické a neoplastické humánne žalúdočné epitelu
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P -
+
++
+++
++++ -
+
++ +++
++++ -
+
+ +
+++ ++++
Normal (n = 7)
7 -
n = 7 (100%) -
-
- -
- - -
n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) - -
- foto 1 (14,3%)
6 (85,7%)
atrofická gastritída (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) -
- -
- -
1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
- -
1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
črevnej metaplázia (n = 21) -
21
- -
n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** - -
1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
4 (19%) - -
5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
dysplázia (n = 17) -
17 -
n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5,9 %) -
- Sims 3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%) -
- Sims 3 (17.6%)
11 (64,7%) Sims 3 (17,3%) -
karcinómu (n = 36) -
36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%) -
- -
28 (77,8%)
8 (22,2%) - -
12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%) -
- www.Booked.cz N - negatívne - (> 5%) negatívne
P - kladná + (5-25%), niekoľko pozitívnych buniek
n - počet prípadov ++ (25-50%), dobre vymedzenej zemepisnej oblasti
+++ (50- 75%) rozsiahla oblasť zafarbia
++++ (75-100%), väčšina buniek zafarbených
** p < 0,00, * p < 0,05 (Významný rozdiel vo výraze)
Imunodetekce mucins v atrofickej gastritídy
Tam bol vyjadrenie MUC5AC vo všetkých prípadoch cylindrických buniek (obrázok 1e;. Na obr. 3b, tabuľka 2). Percento zafarbených buniek sa pohybovala od prípadu k prípadu, vo väčšine prípadov, bol trend pre zvýšenie počtu buniek, ktoré exprimujú MUC5AC (viac ako 75%) v povrchovej časti metaplastického žliaz než v hlbšej časti. MUC6 bola detekovaná v cylindrických buniek (viac ako 50%, obr. 1f, obr. 3c, tabuľka 2) a MUC2 sa v atrofickej gastritídy, nie je detekovaný (Obr. 1D)
Imunodetekce mucínu v črevnej metaplázia
tam. sa znížila hladinu expresie MUC5AC a MUC6 vo všetkých prípadoch (viac ako 50%), a to ako v pohári a v cylindrických buniek (obr 1H, obr 2a, ... na obr. 3b, obr 3c; tabuľka 2). Percento zafarbených buniek sa pohybovala od prípadu k prípadu, bola pozorovaná de novo
expresie črevnej mucínu MUC2 (viac ako 75%), a jeho expresie vykazovali difúzne cytoplazmatickú vzor v pohárikových buniek (obr. 1G; obr. 3a; Tabuľka č. 2)
Imunodetekce mucínu v dysplázia
Tam došlo k zníženiu úrovne expresie MUC5AC a MUC6, ako črevná metaplázia (viac ako 50%). MUC5AC a MUC6 zobrazená difúzna cytoplazmatickú expresný vzor v cylindrických buniek (obrázok 2c, obr. 2d, obr. 3d ,. Obr. 3, tabuľka 2). MUC2 výraz zobrazená difúzna cytoplazmatickú vzor v kalíšky bunkách (viac ako 50%, obr 2b, obr. 3a, tabuľka 2)
Imunodetekce mucínu v karcinómu
MUC5AC a expresiu MUC6 boli často pozorované na začiatku karcinómu (väčšie. 50%), než pokročilými karcinómy (viac ako 25%). V pokročilých karcinómov sme pozorovali trend pre zníženú imunoreaktivity v hlbokých oblastiach než v povrchových oblastiach. MUC5AC a MUC6 výrazy boli v pokročilých karcinómov znížil (viac ako 25%, obr 3a, obr. 3b ,. Na obr. 3c, obr. 2e, 2f obor, obr 2 g; .. Tabuľka 2).
Diskusia
v tejto štúdii sme ukázali, že vzor expresie mucínu v progresívnych fázach H. pylori
infikovanej ľudskej žalúdočnej epitel. Mucíny sú vyjadrené s neobsahujúceho bunky a tkanivové špecifické pre vzorku v normálnej tkanive. Alterácie expresného profilu mucínu boli popísané v karcinómov, rovnako ako v ich prekurzorové lézie; U posledne menovaných pozmenených hlienu sacharidových a peptidových skupín môžu predstavovať molekulárnych markerov zvýšeného rizika malígne transformácie [27, 35, 36, 38-40].
V súlade s predchádzajúce štúdie podávanie správ o distribúcii mucins v normálnom žalúdku, my nájdených MUC5AC je vysoko exprimovaný v bunkách foveolární dutine, ako je uvedené [26, 27, 32, 37-39]. Tiež sme zistili, že je exprimovaný v MUC6 mukóznych bunkách krku zóny v pyloru žliaz antra s podobným vzorom, aký je opísaný skôr [22, 23, 47]. Expresia MUC2 sa obvykle detekovaná v normálnej žalúdočnej sliznice, ako je popísané v predchádzajúcich správach [25, 27, 40].
Črevná metaplázia je jedným z lézií zistených v kaskádu udalostí, ktoré predchádza rozvoju karcinómu žalúdka [ ,,,0],41]. Intestinálna metaplázia zahŕňa nahradenie žalúdočnej sliznice epitelu, ktorý sa podobá histologicky črevnú sliznicu. Zmenené mucín expresné vzory boli pozorované u H. pylori
infikované črevnej metaplázia, ako aj na základe vyjadrenia MUC5AC a MUC6 a de novo
vyjadrenie MUC2 väčšinou v pohárikových bunkách [30, 48]. Tieto výsledky podporujú predpoklad, že črevná metaplázia robí predstavujú diferenciáciu sliznici črevnej smerom k fenotypu [42, 43].
Znížená expresie MUC5AC a MUC6 mucínu v žalúdočných karcinómov boli potvrdené v tejto štúdii. Expresia MUC5AC začiatkom karcinómu žalúdka predkladaného série, bez ohľadu na histologických typov nádorov, v kontraste s zníženou hladinou expresie MUC5AC imunoreaktivity takmer v polovici pokročilých karcinómov, ktoré naznačujú, že všetky žalúdočné karcinómy zachovať aspoň niektoré bunky s žalúdočné fenotyp pri prvých krokoch neoplastických vývoja (26). Tento predpoklad je ďalej podporovaný zníženú imunoreaktivity v hlbokých oblastiach v porovnaní s povrchových oblastiach pokročilých karcinómov. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi výsledky ukazujú, že žalúdka progresie rakoviny je sprevádzaná zmenou expresie niekoľkých mucínu génov [14]. Nakoniec sme pozorovali, že črevné mucín MUC2 je vyjadrená v každom črevnej metaplázia, čo je porucha, ktorá sa objaví v priebehu procesu žalúdočnej karcinogenézy v súvislosti s H. pylori
infikovaných jedincov.
Záver
I H . pylori
bola klasifikovaná ako karcinogén triedy I podľa IARC [4] mechanizmus žalúdočnej karcinogenéze zostáva zle pochopený. V pre-neoplastických žalúdočnej sliznice, expresia všetkých troch antigénov mucínu nepreukázalo, že koreluje so závažnosťou zápalu a H. pylori
stave. Výsledky z tejto štúdie ukazujú, že sa môžu H. pylori infekcie
pôsobí ako iniciátor tohto karcinogenézy kaskády vyvolaním zápalu a v niektorých prípadoch, následné metaplastická zmeny. Intestinálna metaplázia je sprevádzaný indukcia expresie MUC2 a znížená expresia MUC5AC a MUC6. Tieto zmeny môžu napomôcť rozvoj karcinómu žalúdka. Táto štúdia naznačuje, že MUC2 je markerom črevnej metaplázia a môžu byť použité pre včasné odhalenie tejto lézie u H. pylori
infikovaných pre-neoplastických humánnych žalúdočné epitel.
Materiály a metódy
Tissue vzorky
Päťdesiat deväť žalúdočné biopsia a 3 ml krvi boli získané od Stanley Medical College a nemocnice, Chennai. Všetky vzorky biopsie tkaniva boli odobraté po informovanom súhlase. Táto štúdia bola vykonaná po získaní povolenia od etickej rady nemocnice. Všetky biopsie boli fixované v 10% pufrovanom formalínu a bežne vložené do parafínu. 4 um tenké Sériové rezy boli narezané a použité pre imunohistochémia. H. pylori
infekcia bola potvrdená RUT a ELISA [43]. Hematoxylin a Eozín zafarbené rezy boli použité na klasifikáciu gastritídu odstupňovaná podľa revidovanej klasifikácie Sydney [44], gastrických nádorov podľa klasifikácie Laurena [45] a WHO klasifikácie [46]. Študovali sme 7 prípadov normálnej ľudskej žalúdočnej epitel (7 biopsia), 26 prípadov atrofickej gastritídy (26 biopsia), 21 prípadov črevnej metaplázia (21 biopsia), 17 prípadov dysplázie (17 biopsiou) a 36 prípadov karcinómu, v ktorom 21 púzdra čoskoro karcinómu a 15 prípadov pokročilou rakovinou (16 biopsia a 20 chirurgické vzorky).
monoklonálne protilátky
panel troch monoklonálnych protilátok bola použitá pre stanovenie expresie mucínu (MUC2, MUC5AC a MUC6). Špecifiká, odkazy a riedenie protilátok sú uvedené v tabuľke 1.
imunohistochémia
oddielov od normálnych, pre-neoplastických a neoplastických žalúdočných tkanivách boli imunodifúzny zafarbené podľa Reis a kol
[47] s miernymi úpravami , Profily určené na liečbu neuraminidázy boli dvakrát premyté fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS), pH 7,4 a inkubuje sa neuraminidázy z Clostridium perfringens typu VI
(Sigma, St. Louis, MO), zriedené v 0,1 M Na-octanového pufra, pH 5,5 až konečnej koncentrácie 0,1 U /ml. Inkubácia sa vykonáva po dobu 2 hodín pri teplote 37 ° C a nasledovali tri premytí ľadovo chladným PBS. Rezy boli ošetrené 0,5% H 2O 2 v metanole po dobu 30 minút, nasledovalo 20 min inkubácie s králičím non-imunitným sérom. Rezy boli opláchnuté a inkubované s primárnou protilátkou (Tabuľka 1), cez noc pri 4 ° C. Rezy boli opláchnuté a inkubované s HRP conjucated králičie anti-myšou sekundárnej protilátky (riedenie 1: 100) po dobu 1 hodiny s následným opláchnutím PBS a rozvíjať s 0,05% 3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) (SRL, Mumbai, India ) čerstvo pripravený v PBS obsahujúcom 0,1% H 2O 2. Rezy boli zafarbené hematoxylínom pult, dehydrované, a nasadol. Všetky série, vrátane pozitívne a negatívne kontroly boli vykonané substitúciou primárne mAb s imunoglobulíny rovnakej triedy a pri rovnakej koncentrácii.
Bodové hodnotenie mucínu expresiu v infikovaných H. pylori
preneoplastické a neoplastické humánne žalúdočné tkaniva
Semi kvantitatívny prístup bol použitý na skóre imunologické ľudských žalúdočných tkanív. Sklíčka bola skúmané pod mikroskopom, každých 100 bunky boli hodnotené v piatich rôznych oblastiach, a výsledky boli vyjadrené ako priemerné percento. (-), negatívna; +, Niekoľko pozitívnych buniek (menej ako 25%); ++ Dobre definované oblasti s pozitívne bunky (25 až 50%); +++, Rozsiahle územia s pozitívnymi bunkami (50-75%); ++++, Väčšina buniek farbených (viac ako 75%). Štatistiky
Analýza dát bola vykonaná pomocou štatistického softvérového balíka SPSS 10.0 pre Windows. Test chí-kvadrát alebo Fisherov presný test bol použitý na analýzu rozdiely v kmitočtoch. Spearmanův korelačný test bol použitý pre analýzu korelácie medzi parametrami. P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú
Skratky
DAB - 3 :.
3'- Diaminobenzidine tetra-hydrochloridu
ELISA:
Enzyme-linked ImmunoSorbent test
HRP:
chrenovej peroxidáze
IARC:
Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny

IM:
črevná metaplázia
mAbs:
monoklonálnych protilátok
PBS:
fosfátový pufrovaný fyziologický roztok
WHO:
svetová zdravotnícka organizácia
RUT :.
Rapid Močovina test

vyhlásenie
Poďakovanie
autori ďakujú na Lady Tata Memorial Trust, Bombaj, India za finančnej podpory v prospech jedného z autorov S. Dura Babu. Sme vďační dr Narasimhan, profesor a vedúci, Oddelenie patológie, Srí Ramachandra Medical College a nemocnice, India, pre preskúmanie histologické a imunohistochemické výsledky a Dr. R. Ravanan, Reader, Ústav štatistiky, Presidemcy koľaj, India na pomoc pri štatistickej analýze. Radi by sme poďakovali Dr. Celso A. Reis o poskytnutie anti-MUC2, anti-MUC5AC a anti-MUC6 monoklonálnej protilátky. "Originál predloženej súbory pre obrazy
Nižšie sú uvedené odkazy k autorom '
Autori pôvodné predložený súbory pre obrazy. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc autorského 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc autorského pôvodného súboru pre Obrázok 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc autorského pôvodného súboru originálneho súboru Obrázok 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc autorského na obrázku 5

• Rozdiely v žalúdočnom génovej expresie rakoviny podpisov získaných z laserového zachytenie mikrodisekcii versushistologic macrodissection
• Airway cellularity, lipidov naložený makrofágy a mikrobiológie žalúdočnej šťavy a dýchacích ciest u detí s refluxnou ezofagitídou