Metastatisk tumörutveckling och organoid modellering implicerade TGFBR2as en cancer förare i diffus magsäckscancer

Metastatisk tumörutveckling och organoid modellering implicerar TGFBR2
som en cancer förare i diffus magsäckscancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till globala dödsfall i cancer, med metastaserad sjukdom vilket är den främsta orsaken dödlighet. För att identifiera kandidat förare som är inblandade i onkogenes och tumörutveckling, vi genomföra en omfattande genom sekvensanalys av metastasutvecklingen i en diffus magcancer. Detta innebär en jämförelse mellan en primärtumör från en ärftlig diffus magcancer syndrom proband och dess återkomst som en äggstocks metastaser.
Resultat
Både primärtumören och äggstocks metastaser har gemensamt bialleliska förlust-of-funktion av både CDH1 Köpa och TP53
tumörsuppressorer, vilket tyder på en gemensam genetisk ursprung. Medan det primära tumör uppvisar amplifiering av Fibroblast tillväxtfaktorreceptor 2 (FGFR2
) -genen, metastasen synnerhet saknar FGFR2
amplifiering utan snarare besitter unika bialleliska förändringar av Transformerande tillväxtfaktor-beta-receptorn 2 (TGFBR2
) , vilket indikerar det divergenta in vivo
utvecklingen av en TGFBR2
-mutant metastaserad klonpopulation i denna patientgrupp. Som TGFBR2
mutationer har inte tidigare funktionellt validerats i magcancer, modellerade vi den metastatiska potentialen av TGFBR2 förlust i en murin tredimensionell primär gastric organoid kultur. Den Tgfbr2
shRNA knockdown i Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoids genererar invasion in vitro Mössor och robust metastatisk tumörbildning in vivo
, bekräftar Tgfbr2
metastaser suppressor aktivitet
slutsatser
Vi dokumenterar metastaserande differentiering och genetiska heterogenitet diffus magcancer och avslöja potentiella metastaserad roll TGFBR2
förlust av funktion. Till stöd för denna studie använder vi en mus primär organoid odlingsmetod kan rekapitulera in vivo
magsäckscancer. Sammantaget beskriver vi en integrerad strategi för att identifiera och funktionellt validera förmodade cancer förare som är inblandade i metastasering.
Bakgrund
Worldwide, magcancer är den fjärde vanligaste malignitet och den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer bland män och kvinnor. Baserat på distinkta histopatologiska funktioner, är magcancer kategoriseras i diffusa och tarm subtyper [1]. När det gäller histopatologi, diffusa gastric cancer är i allmänhet odifferentierade, ofta har signet cell ringen funktioner och invasivt infiltrera normal mage vävnad. I motsats härtill har den intestinala subtyp epiteliala funktioner och bildar diskreta tumörmassor som liknar koloncancer. Diffus magcancer har en högre förekomst av metastaserande sjukdom och en generellt sämre prognos jämfört med tarm subtyp [2], [3]. För närvarande har de genomiska analyser av diffus magcancer involverat ett litet antal prover inklusive en färsk studie från Cancer Genome Atlas Project (TCGA) och en hela genomet sekvense undersökning av en rad diffusa gastric tumörer [4]. Men det finns få, om några, studier som detalj den metastatiska utvecklingen av gastrisk cancer; metastaserande tumörer är vanligtvis frånvarande från storskaliga iska cancer undersökningar som TCGA. Sammantaget lite är känt om den onkogena processen och tumörutveckling av magsäckscancer trots sin största kliniska betydelse [5].
Ärftlig diffusa magcancer (HDGC), nedärvda mutationer i CDH1
(det vill säga, E- cadherin) ger en 70% livstid risk att utveckla diffus magcancer [6], [7]. Den CDH1
tumörsuppressorgenen kodar E-cadherin, en transmembran glykoprotein som medierar kalciumberoende cell-celladhesion. Förändringar i CDH1 funktion påverkar epitel-mesenkymala övergång (EMT) som har implicerats som att spela en roll i tumörbildning. Studier av drabbade HDGC individers tumörer ger en unik möjlighet att avgöra de viktigaste drivkrafterna för diffus magcancer i samband med CDH1
funktionsförlust. Bevisning av den roll CDH1
i sporadiska diffusa gastric cancer inkluderar observationen att 50% innehåller CDH1
mutationer eller hypermetylering av CDH1
promotorn [8], [9]. En nyligen hela genomet sekvense undersökning av diffus magcancer identifieras också ofta CDH1
mutationer som den vanligaste föraren händelse [4]. Magsäckscancer uppgifter TCGA visar också en hög frekvens av somatiska CDH1
mutationer [10]. Betydligt mindre är känt om identitet och roll co förekommande förare som bidrar till att sprida gastric metastaser.
Häri rapporterar vi en studie av metastaserad evolutionära processen i diffus magsäckscancer. Vårt mål var att identifiera kända och kandidat förare som avgränsar tumörprogression under metastas. Vi genomförde en omfattande genom sekvenseringsanalys av en primär gastric tumör och metastas från en individ med en könsceller CDH1
mutation (figur 1) som presenteras med en gastric primär, följt efter 3 år av metastaser i vänster äggstock. Med tanke på den nuvarande könsceller mutation i CDH1,
cancer genomet kräver endast en andra allel hit via en somatisk genetisk avvikelse, vilket framgår i tumören från denna person. Eftersom den ursprungliga cancer föraren händelse är känd, Mendelian cancer genomen ger en sällsynt och mycket informativ `experiment av naturen" som ger en möjlighet att avgränsa somatiska genetik metastaser. Genome sekvenseringsanalys av både tumörer visade tecken på ett gemensamt ursprung baserad på gemensamma mutationer men större iska mångfalden ses både på nivån av mutationer samt omfattande allelisk obalans och kopienummer avvikelser för metatasis. Figur 1 Familj och sjukdomshistoria Mendels diffus magcancer. Stamtavla index patienten 525 (III-1) visas. Tumörtyper indikeras med färg, inklusive grönt för bukspottkörtelcancer, röd för diffus magcancer, och gult för bröstcancer. Patienten presenteras med sin primära magcancer vid en ålder av 37 år. Tre år senare presenterade hon med en magbesvär. Kontrastförstärkt datortomografi av bäckenet identifierade en vänster äggstock massa (gul cirkel) som bekräftades på biopsi för att vara en diffus magcancer metastaser (det vill säga Krukenberg tumör). Under loppet av metastatisk tumörutveckling, ett antal kända och kandidat cancer förar händelser avgränsas tumörutvecklingen och genetiska skillnader i metastas från den primära tumören.
Vi bestämde om kandidat förare från denna metastasutvecklingen var tillräckliga för att reproducera diffusa magcancer. Vår cancer modelleringsmetod som används in vitro
gastric organoids och gör att man kan konstruera den genetiska föraren ramen för dessa cancerformer och studera processen med metastaserande utveckling och onkogen väg divergens. Integrera genetisk analys och biologisk modellering, bestämde vi oberoende roll TGFBR2
(transformerande tillväxtfaktor β receptor 2) i onkogenes av diffusa magcancer. Vår experimentella cancer modellering bygger på en luft-vätske-gränssnitt för primär mus intestinal kultur som innehåller både epiteliala och mesenkymala element, exakt rekapitulerar långsiktig spridning, multilineage differentiering, Wnt /Notch-beroende stamcells nisch, och peristaltiken [11]. Vi rapporterade en analog primär gastric organoid kultursystem som exakt rekapitulerar multilineage epiteldifferentiering och stromala element [12]. Nyligen nådde vi robust vitro
onkogen transformation av primära gastric, kolon och pankreas organoids in via mutationer i Kras Mössor och Trp53
, som inducerar höggradig dysplasi och invasion in vitro hotell med adenokarcinom på subkutan transplantation till möss [13]. Vi visar den funktionella validering av kandidat magcancer metastaser förare från cancer genomisk profilering studier, med fokus på att modellera TGFBR2
föraren som bevis på principen.
Resultat
Diffusa magcancer och metastasutvecklingen
Vid en ålder 37 år, var index patienten (525) diagnostiserats med stadium III (T3N1M0) dåligt differentierade diffus gastrisk adenokarcinom (Figur 1). Hennes 42-åriga syster fick diagnosen diffus magcancer 2 månader tidigare. Baserat på familjehistoria av magcancer och ovanligt ung ålder för debut, genomgick hon nedärvda CDH1
mutation testning. Patienten och hennes syster befanns ha en germline splitsställe mutation i intron 10 (c.1565 + 2insT). Detta nedärvda mutation redovisas därefter i en annan familj med ärftlig diffus magsäckscancer (HDGC) [14]. Patienten genomgick en total gastrektomi för att ta bort sin primärtumören och befanns ha en enda lymfkörtel metastas. Hon fick standard adjuvant behandling inklusive kombinerad kemoterapi (cis-platina och 5-fluorouracil) och strålning. Tre år efter hennes första presentation, rapporterade patienten progressiva nedre delen av buken fullhet. En datortomografi (CT) scan visade ett stort bäcken massa överensstämmer med en vänster äggstocks metastas (Figur 1). Därefter patient genomgick laparotomi med bilateral salpingooforektomi och biopsi av bäcken massan. Patologiska studier visade metastatiskt adenokarcinom involverar äggstocken, annars hänvisad till som en Krukenberg tumör, som har samma histologiska utseende som den primära tumören. En studie rapporterade att bland diffus magsäckscancer med metastaserande spridning, äggstocken var en metastatisk plats i 28,8% av fallen [15]. Således är äggstocken en gemensam plats för metastaserad sjukdom.
Cancer genom sekvensanalys
Både exome och hela genomet parade slut sekvensering utfördes på primärtumören, äggstocks metastas och normal vävnad som ingår blod och normal gastric vävnad (Ytterligare fil 1: Tabell S1). Vävnad från lymfkörteln metastaser var inte tillgänglig för analys. Multipla sekvenseringsmetoder användes för att kompensera för den del av den normala stromala blandning, ett direkt resultat av den infiltrativt invasivitet av den diffusa magcancer subtyp. Vi bestämde omfattningen av normala genomet blandning och korrigerat för införande av den normala DNA (Ytterligare fil 1: Metoder). Med tanke på komplexiteten i tumörprover, genomförde vi en ytterligare runda av riktad sekvensering för att bekräfta närvaron av mutationer och andra genetiska avvikelser som inträffade i exoner, nära exongränser eller promotorer.
Totalt fick vi mer än 100 × genomsnittlig täckning för varje exome och i allmänhet förlitat sig på exome data för upptäckten av kodande regionen mutationer. För hela genomet sekvensering, hade vi mer än 60 × genomsnittlig täckning för den primära cancern hela genomet prov och 30 × för metastaserad genomet. Hela genomet sekvensering användes för att identifiera större skala genetiska avvikelser såsom antalet kopior variation (CNVs), alleliska obalanser, omflyttningar och andra klasser av strukturella omdisponeringar. Efter justering, genomförde vi variant ringer för att identifiera somatiska mutationer och andra klasser av genetiska avvikelser. Detta inkluderade somatiska mutationer, inför-deletioner (InDels), CNVs, förlust-of-heterozygositet regioner (LOH), och cancer omflyttningar (Ytterligare fil 1: Tabell S3 och tabell S4). Som en kontroll för enstaka nukleotid variant ringer, genotypas vi proverna med Affymetrix 6,0 single nucleotide polymorphism (SNP) arrayer; jämförde vi genotyper på kartlagda SNPS från sekvensdata. Överensstämmelsen av exome och hela genomet SNP data till array data var 99%.
Kodande regionen mutationer och validering med djup sekvense
Vi identifierade mutationer som inträffat i exoner och intron mutationer inom 100 baser i exon gränsen och resultaten sammanfattas i kompletterande fil 1: Tabell S2. Såsom tidigare noterats, de tumörprover hade komplex sammansättning som minskade sekvenstäckning av vissa mutationer. Vi fortsatte med ytterligare en runda av riktad sekvensering för att validera dessa mutationer och bestämma deras närvaro i båda tumörer. Vi har utformat en analys för djup riktad sekvenserings som täckte cirka 300 baser runt specifik mutation loci (Ytterligare fil 1: Tabell S5). Den genomsnittliga riktade sekvense täckning för varje förmodad mutation eller loci var 278 × för normala, 251 × för primärtumören och 152 × för metastaser.
Mellan de två tumörer, oberoende validerade vi totalt 77 mutationer som inträffat inom eller proximalt exoner (Ytterligare fil 1: Metoder och tabell S5). Validerade genetiska avvikelser ingår: (1) icke-synonyma mutationer, (2) synonyma mutationer, (3) insättningar eller (4) strykningar. Med den riktade sekvenseringsdata, bestämde vi mutations allelisk frekvens (MAF) mellan den primära tumören och metastaser för varje mutation. Detta innebär att bestämma den fraktion av en sekvens avlästes med en mutation i jämförelse med referenssekvensen läser. Vi kunde identifiera vilka mutationer var vanliga eller exklusiva för den primära tumören jämfört med metastaser. Bland de 77 validerade mutationer var fördelningen så att mutationer i allmänhet unik antingen primärtumören eller metastaserad plats. Till exempel hade den primära tumören åtta mutationer som inte var närvarande i metastaser medan metastaser hade 37 mutationer som inte finns i den primära tumören. Gemensamt för båda cancer var 32 mutationer.
Tanke intervallet tre år innan upptäckten av metastaser, finns det en möjlighet att metastaser specifika mutationer inträffade oberoende av den primära tumören. Mutationer som är specifika för den primära tumören som inte var närvarande i äggstocks metastas kan ha varit resultatet av slumpmässiga genetiska drift. Mutationerna är gemensamma för båda indikerar ett gemensamt ursprung men den exakta tidpunkten för differentieringen mellan de två tumörer är mindre tydlig som noterats av dessa mutationer med lägre MAF. En undergrupp av dessa gener hade höga MAF-värden, vilket tyder på en högre sannolikhet för att vara närvarande i alla klonala populationer i primärtumören eller metastaser. Som vi beskriver senare var dessa gener prioriteras för ytterligare försöksverksamhet gastric organoids.
Mutationer som påverkar genfunktionen
Bland de mutationer som var externt validerade har vi fokuserat på den undergrupp av mutationer som leder till aminosyrasubstitutioner, tidig stopp kodoner och InDels som förändrade den öppna läsramen. Därefter bestämde vi om dessa kodnings mutationer var potentiellt skadliga för genfunktion användning av ett antal prediktionsalgoritmer såsom Polyphen [16] och SIFT [17] bland andra. Baserat på MAF information för varje mutation, bestämde vi huruvida dessa mutationer med en eventuell skadlig inverkan på genprodukter var vanliga eller exklusiva för primärtumör och metastas (Figur 2). Figur 2 Jämförelse av genetiska avvikelser i den primära tumören och metastasis. Gemensamt kontra
exklusiva genetiska avvikelser jämförs mellan de två tumör genomen. (A) Gener med kodning mutationer har en potentiell skadlig inverkan listas. Dessa gener klassificeras beroende på om de är exklusiva (röda tecken) eller vanliga (gröna tecken) till den primära tumören och metastaser. Mutationerna alla leda till förändringar i aminosyrasammansättningen av genprodukten och identifierades att ha en påtaglig förändring med en hög sannolikhet för att påverka genprodukten funktionen. (B) En sammanfattning av kromosomavvikelser visas över hela cancer genomet hos båda tumörer. Detta inkluderar kopietal variation (CNV) eller förlust av heterozygositet (LOH). De röda blocken indikerar händelser exklusivt för primärtumören eller metastaser. De gröna blocken indikerar händelser som är gemensamma för båda. Antalet händelser per kromosom finns med i varje block. Pilar indikerar LOH händelser eller strykningar som omfattar p arm, q arm, eller hela kromosom. Röda pilar indikerar kromosomavvikelser som är exklusiva och gröna pilar visar händelser som är gemensamma.
Den delmängd av skadliga mutationer, genomförde vi ytterligare biologisk väg analys, litteraturgenomgång och jämförelse mot cancer Genome Atlas data tillgängliga för diffus magsäckscancer. Detta identifierade ett antal kända cancergener och sannolika cancerrelaterade kandidater med mutationer som sannolikt påverkat proteiners funktion. Vi fokuserade på ett antal förare kandidatgener (Tabell 1) som tidigare visats ha onkogen potential eller var kända tumörsuppressorer med bialleliska förändringar som förekommer i cancer genomes.Table 1 Cancer onkogener med förstärkningar eller cancer förare med bialleliska händelser
Vari
Känd eller kandidat cancer förare
bialleliska händelse
Allelisk förändring 1
Mutation eller genomisk aberration
Chr

Chr läge eller intervall
Allelisk förändring 2
Unikt för den primära
FGFR2 *
förstärkning
6-faldig förstärkning
10
117820033 - 119748751
Gemensamt för primärtumören och metastaser
CDH1
Ja
radering
Partiell deletion av exon 9
16
68.847.326-68.847.403
nedärvda mutation i CDH1
TP53
Ja
5'-splitsstället mutation
avvikande splitsning
17
7.578.370
hemizygot förlust av 17p arm
Unikt för metastas
TGFBR2
Ja
ramskifte Indel
stoppkodon i exon 4
3
30691871
hemizygot deletion av vildtyp TGFBR2
lokus
PCDH7
Ja
missense
S87R
4
30723305
hemizygot deletion av vildtyp fyra armen
FERMT1
loci
ja
Förlust av heterozygositet
FERMT
en belägen i 20p12.3
20
FERMT
en mutation
BMP7
loci
ja
Förlust av heterozygositet
BMP7
ligger i 20q13.3
20
BMP7
mutation
Chr. kromosom
kopieantal variationer och alleliska obalanser som särskiljer den primära tumören från metastaser
Vi noterade större skala genomiska avvikelser som differentierade primär från metastaser (figurerna 2b och 3a). Detta inkluderade kopietal förändringar och LOH händelser. Unikt för den primära tumören var två genomiska amplifieringar på kromosomerna 5 och 10, och två inversioner på kromosomerna 15 och 16 (Ytterligare fil 1: Tabell S4). Kromosomen 10 förstärkning omfattade en 1,66 Mb intervall. När man överväger deletioner eller alleliska obalanser, den enda stora händelsen som noterades innebar en förlust av p armen av kromosom 17. Figur 3 genetiska skillnader i äggstocks metastas från den primära magcancer för kritiska kandidat förare. Den genomiska positionen för mutationen, kopienummer variationer (CNV) regioner eller förlust av heterozygositet (LOH) intervall visas från cancer genomen. För kromosom tomter, Y-axeln betecknar positionen med respektive kromosom, dess längd i megabaser (MB) och ideogram beteckning som visas till vänster om kopietalet profilen. Skadliga mutationer visas som boxed pilar med genen symbol. (A) genom bred distribution av cancerspecifika CNVs och LOH intervaller sammanfattas i alla kromosomer för den primära tumören och metastaser. (B) på kromosom tre, hade metastaser unika bialleliska händelser med en skadlig TGFBR2
mutation och en genomisk deletion påverkar andra allelen som tydligast med LOH mellanrum. Sekundärt till genomiska deletioner är LOH visat som en förskjutning i mindre alleliska frekvensen kvotvärde -1 och korrelerar med en genomisk deletion. (C) på kromosom 10, var FGFR2
genen ligger i en genomisk förstärkningsregion sett endast i den primära och inte metastaser. Förstärkningen noteras i en röd cirkel.
I motsats till primärtumören hade metastatisk tumör många kromosom skala LOH händelser och iska deletioner påverkar 12 olika kromosomer, varav de flesta var unikt för metastatisk tumör (figur 2) . Detta inkluderade flera strykningar och kopiera neutrala LOH händelser som beskrivs i kompletterande fil 1: Tabell S3. Det fanns en femfaldig genomisk amplifiering i kromosom 2 men inga specifika kända gener fanns i det drabbade intervall. Det fanns inga detekterbara inter-kromosomala transloka i antingen den primära tumören eller metastasering genom. Andra canceromarrangemang identifierades men inte peka mot avvikelser i alla förare kandidatgener (Ytterligare fil 1: Tabell S4). Det fanns tecken på storskalig genomisk instabilitet baserat på allel obalans analys; kromosomer 14, 17, 20 och 22 alla inblandade hela kromosomen. Hus Till kopietal aberrationer och alleliska obalanser, identifierade vi exklusiv kontra vanliga händelser mellan den primära tumören och metastaser. Den enda gemensamma genetiska avvikelse involverade p armen av kromosom 17. Sammantaget avsaknaden av överlappning var ett tecken på betydande genetisk avvikelse från den primära tumören och metastaser trots ett gemensamt ursprung som betecknas med delade mutationer i kritiska tumörsuppressorer.
Iska intervall av LOH, antalet exemplar aberration och polyadditionsprodukter händelser jämfördes med läget för validerade genmutationer. Detta integrerad analys pekade på ett antal gener som hade bialleliska förändringar som innebär både en förlust av vildtyp allelen från en stor intervall genomisk aberration och en mutant allel. Resultaten för gener med bialleliska träffar ansågs vara starka kandidater för en förlust av funktions inblandning i cancer (tabell 1).
Identifiering av cancer förare gemensamma för primärtumören och metastaser
Både den primära och metastaser innehöll cancer förare händelser som sannolikt skulle vara avgörande för tumörbildning i samband med den inledande CDH1
mutation (tabell 1, figur 2). Förutom könscellinjen CDH1
intron mutation, den andra CDH1
allelen hade en somatisk 77 bp genomisk deletion av en del av exon 9 som påverkar nedströms kodande regionerna samt. Den CDH1
somatisk mutation var identisk i både de primära och magsäckscancer genom, visar en gemensam genetisk ursprung och ger stark genetisk bevis för att denna drivrutin hade en avgörande roll i diffus gastrisk tumörbildning. Mutationer som påverkar CDH1
exon 9 som leder till förlust av proteinuttryck har ofta påvisats i diffus magsäckscancer [18] - [20]. Denna exon s aminosyrasekvens är en förmodad kalciumbindande ställe som sannolikt viktigt för receptorfunktion
primär och metastatisk tumör också delad bialleliska splitsningsgivarställe mutation. (C.559 + 1G > A) av den femte intronen av TP53 Mössor och en kromosom 17p LOH händelse som omfattar TP53
locus (Ytterligare fil 1: Figur S1). Den TP53
skarvning mutation avbryter RNA-splitsning [21] och är en tidigare rapporterad cancer mutation [22], [23]. Analyserna av sporadiska och ärvda gastric cancer har identifierat TP53
mutationer som inträffar samtidigt med CDH1
mutation [24], [25]. CDH1
inaktive i magsäckens parietalceller inducerar inte gastric carcinoma, vilket tyder på att förlusten av CDH1
är otillräcklig för tumör inledande [26]. Men dubbel villkorad knockout av CDH1 Mössor och TP53
inducerar utveckling av diffus gastrisk cancer [26]. Intressant nog iska intervallet för LOH händelse som påverkar TP53
locus var större i metastaser i förhållande till den primära tumören. Detta kan ha skett på grund av oberoende genomisk instabilitet händelser med tanke på den starka val för bialleliska förlust av TP53 funktion.
FGFRis en talan cancer förare exklusivt till den primära ventrikeltumör
I den primära tumören fanns en sexfaldig genomisk förstärkning av en region på kromosom 10 q arm och täckte ett intervall på 1,66 Mb. Inom detta genomiska regioner var en onkogen sökanden själv FGFR2
även hänvisad till som fibroblast growth factor receptor 2 (figur 3c). Detta bekräftades med flera metoder inklusive sekvensering, array analys och validering av kvantitativ PCR. FGFR2 är en transmembranreceptor som fungerar som en del av en nyckel signaltransduktionsvägen reglerar vävnadsreparation och embryonal utveckling hos en mängd andra funktioner [26].
Att bekräfta förekomsten av FGFR2
förstärkning i diffusa kontra tarm gastric cancer analyserade vi 37 diffus och 27 tarm subtyp primära gastric tumörprover med digital PCR [27]. Tidigare visade vi att denna metod är djupt känslig för att upptäcka kopieantal aberration även inom ramen för normala diploida DNA späd tumör DNA. Vår studie visade FGFR2
förstärkning i fyra av 37 (11%) diffus tumörprover, som var frånvarande i tarm subtyp proverna (Figur 4a). Figur 4 Förekomst av FGFR2 i gastriska tumörer mänskliga och dess bidrag till cellulär proliferation. (A) Sporadiska magcancer prover utvärderades genom kvantitativ digital PCR för att bestämma FGFR2 genomisk kopietal. Svarta punkter representerar diffusa gastric cancer. Röda prickarna visar tarm subtyp av magcancer. (B) genetiska egenskaper hos AGS (FGFR2
diploida) och KatoIII (FGFR2 förstärkt) gastric cancercellinjer visas. (C) Procent överlevnad för AGS cancer cellinje visas med FGFR2 hämmare av varierande specificitet. (D) KatoIII diffusa magcancer cellinje behandlades med FGFR2 hämmare av varierande specificitet. Y-axeln visar procent överlevnad jämfört
X-axeln med log koncentrationer. I alla paneler, felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. Skillnaden i procent cellöverlevnad mellan KatoIII och AGS-celler var statistiskt signifikant (P Hotel < 0,05). I de tre högsta koncentrationerna av alla droger, utom Brivanib som var endast signifikant vid den högsta koncentrationen
Till stöd för sin roll som sökanden själv, är FGFR2
förstärkning närvarande i ett antal av gastriska cancercellinjer [28], [29] och därefter rapporterats i olika gastrointestinala maligniteter, såsom matstrupen adenokarcinom [30]. Dessutom behandling av cancer cellinjer med FGFR2 specifika små molekylhämmare eller shRNAs leder till potent tillväxthämning [28] tyder på en funktionell roll för FGFR2
amplifiering i den diffusa subtyp.
Funktionell analys av FGFR2 föraren i kombination med CDH1 och TP53
Vi identifierade två exempel på en primär diffus magsäckscancer med samtidig förekomst av kända och förmodade cancer förare som involverar CDH1
, TP53
och FGFR2
sett i index patienten . Det första exemplet ingår en diffus magcancer prov som var bland de gastric adenokarcinom analyseras av TCGA. Använda cBio TCGA portalen [10], identifierade vi en patient (TCGA-BR-6803) som hade en liknande komplement av genetiska avvikelser i CDH1
, TP53
och FGFR2
, som alla har varit tidigare beskrivits i cancer som kan ses i den kosmiska cancer mutation förvaret. Detta bland annat följande: en missense-mutation i CDH1
(D254Y) som har beskrivits i tre andra cancerformer; en missense-mutation (L130F) i TP53
där mutationer i detta kodon har rapporterats i 37 andra cancerformer; den FGFR2
förstärkning som vi och andra har identifierat i diffust magsäckscancer.
Som andra exempel identifierade vi en människa diffusa magcancer cellinje KatoIII, som har en liknande sammansättning av genetiska avvikelser som påverkar samma cancergener som den primära tumören av vårt index patienten. KatoIII har en CDH1
mutation som leder till en intronsekvens insättning i mRNA [31], [32], en TP53
mutation som leder till en fullständig gendeletion [33] och FGFR2
förstärkning [29] (Figur 4b). Denna cellinje tillät oss att utvärdera potentiella onkogena roll FGFR2
förstärkning i specifika genetiska sammanhang CDH1 Mössor och TP53
mutationer, liknande index patientens primärtumör.
Att bestämma bidraget av FGFR signalering till neoplastisk tillväxt, behandlade vi KatoIII celler med flera FGFR2 små molekyler tyrosin-kinas-hämmare (TKI), inklusive Brivanib, TKI258, Ponatinib, och AZD4547 [34]. Som kontroll använde vi magcancer-cellinjen AGS som är vild typ för FGFR2
, CDH1
och TP53
, men har mutationer i KRAS Mössor och PIK3CA
[35] ( figur 4b). Alla FGFR2 hämmare inducerade celldöd i KatoIII men inte AGS celler (figur 4C och D). Den mest potenta av dessa TKI, AZD4547, har ett IC 50 av ungefär 2 nM i KatoIII celler och 39580 nM i AGS-celler (Figur 4c och d). Var och en av de inhibitorer visade en statistiskt signifikant lägre IC 50 i FGFR2-förstärkt KatoIII celler jämfört med icke-FGFR2-förstärkt AGS celler vid alla testade koncentrationer (figur 4c och d) katalog I motsats. Behandling av KatoIII och AGS-celler med cytotoxiska kemoterapeutiska medel, såsom paklitaxel, 5-fluorouracil och karboplatin inte har en betydande inverkan på vare sig KatoIII eller AGS linjer, med liknande IC 50 identifierades i varje (Ytterligare fil 1: Tabell S7). För AZD4547, föreslår 20.000-faldig skillnad i känslighet för FGFR hämmare som FGF-signalering är en kritisk föraren att CDH1
-initiated gastric cellulär proliferation och detta TKI utgör en potentiell riktad terapi i diffusa subtyp cancer hyser FGFR2
förstärkningar.
bialleliska inaktivering av TGFBRis exklusiva för äggstocks metastaser
genetiska skillnader var uppenbar; metastasen hyste sin egen unika delmängd av mutationer och genomiska avvikelser. Tabell S1. Tabell S3. Tabell S4. Tabell S5. Tabell S6. Tabell S7. Figur S1. Figur S2. Figur S3.

• Botulinumtoxin i gastric submukosa minskar stimulerad HCI produktion i rats
• Förutsägelse av metachronous flera primära cancer efter kurativ resektion av gastric cancer