эволюция метастатической опухоли и Органоид моделирование имплицитный TGFBR2as драйвер рака при диффузной рака желудка

эволюция метастатической опухоли и Органоид моделирование вовлекают TGFBR2
как водитель рак при диффузном раке желудка
Аннотация
Справочная информация
Желудочный рак является второй ведущей причиной смерти во всем мире от рака, с метастазами, представляющий основную причину смертности. Для того, чтобы определить кандидатов водителей, участвующих в онкогенеза и эволюции опухоли, мы проводим обширный анализ секвенирование генома метастатического прогрессирования диффузного рака желудка. Это предполагает сравнение между первичной опухоли с наследственной диффузного желудочного синдрома рака пробанда и его рецидив как метастаза яичников.

Результаты Оба первичной опухоли и метастазирование яичников имеют общую диаллельных с потерей функции как CDH1
и TP53
опухолевых супрессоров, что указывает на общее генетическое происхождение. В то время как первичная опухоль проявляет усиление 2 (FGFR2
) гена фактора роста фибробластов рецептора, метастаз в частности, не хватает FGFR2
амплификацию, а скорее обладает уникальными биаллельной переделок трансформирующий фактор роста-бета-рецептор 2 (TGFBR2
) , что указывает на расширяющуюся в естественных условиях
эволюции TGFBR2
-mutant метастатическим клонального населения у данного пациента. Как TGFBR2
мутации не были ранее функционально проверены при раке желудка, мы смоделировали метастатического потенциала потери TGFBR2 в мышиной трехмерной первичной желудочной Органоид культуры. Tgfbr2
shRNA нокдаун в CDH1
- /-
; TP53
- /-.
Органоиды генерирует вторжения в пробирке
и надежные метастатическим туморогенности в естественных условиях
, подтвердив Tgfbr2
метастаз супрессора
Выводы
Мы документируют метастатическим дифференциация и генетическая гетерогенность диффузного рака желудка и выявить потенциальную метастатического роль TGFBR2
с потерей функции. В поддержку этого исследования, мы применяем метод мышиный первичной Органоид культуры, способной обобщал в естественных условиях
метастатическим раком желудка. В целом, мы описываем комплексный подход к выявлению и функционально проверки предполагаемых водителей рака, участвующих в метастазировании.
Фон
по всему миру, аденокарциномы желудка является четвертым наиболее распространенным злокачественным и второй ведущей причиной смерти от рака среди мужчин и женщин. На основе отличительных признаков гистологических, аденокарциномы желудка подразделяются на диффузные и кишечных подтипов [1]. С точки зрения гистопатологии, диффузные рака желудка, как правило, недифференцированные, часто имеют признаки печаткой клеток кольцо и инвазивное инфильтрата нормальные ткани желудка. В противоположность этому, кишечная подтип имеет эпителиальные особенности и формирует дискретные массы опухоли, похожие на рак толстой кишки. Диффузный рак желудка имеет более высокую частоту метастазирования и в целом худший прогноз по сравнению с кишечным подтипа [2], [3]. В настоящее время геномный анализ диффузного рака желудка привлекли небольшое число образцов включая недавнее исследование, проведенное Cancer Genome Atlas Project (TCGA) и целого генома секвенирования обследования множества диффузных опухолей желудка [4]. Тем не менее, есть немногие, если таковые имеются, исследования, которые подробно метастатическое развитие рака желудка; метастатические опухоли, как правило, отсутствует в крупномасштабных геномных исследованиях рака, таких как TCGA. В целом, очень мало известно о онкогенного процессе эволюции и опухоли метастатического рака желудка, несмотря на огромное клиническое значение [5].
В наследственной диффузной рак желудка (HDGC), зародышевых мутации в CDH1
(то есть, E- кадгерина) награждает 70% жизни риск развития диффузного рака желудка в [6], [7]. В CDH1
ген-супрессор опухолей кодирует Е-кадгерина, трансмембранным гликопротеином, который опосредует межклеточную адгезию кальций-зависимой. Изменения функции CDH1 влияют на эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT), который был замешан, как играет определенную роль в онкогенеза. Исследования опухолей затрагиваемых HDGC физических лиц предоставляют уникальную возможность определить необходимые драйверы диффузного рака желудка в контексте CDH1
потери функции. Подтверждающие данные о роли CDH1
в спорадических диффузного рака желудка включает в себя наблюдение, что 50% содержат CDH1
мутации или гиперметилирование CDH1
промотора [8], [9]. Недавно весь секвенирование генома обзор диффузного рака желудка также выявлены частые CDH1
мутации как наиболее распространенный событие водителя [4]. Данные рак желудка TCGA также показывают высокую частоту соматических мутаций CDH1
[10]. Значительно меньше известно о личности и роли сопутствующих водителей, которые способствуют диффузного желудочного метастазирование.
Здесь мы приводим исследование метастатическим эволюционного процесса в диффузного рака желудка. Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать известные и кандидатских драйверы, которые разграничивают прогрессирование опухоли во время метастазирования. Мы провели обширный анализ секвенирование генома первичной опухоли желудка и метастазирование от человека с зародышевой CDH1
мутации (рисунок 1), которые представлены с желудочным первичной, а затем через 3 года метастазами в левом яичнике. С учетом существующей мутации зародышевой линии в CDH1,
геном рака только требует второй аллельные попадания через соматической генетической аберрацией, как показано в опухоли от этого индивидуума. Поскольку исходное событие водитель рака известно, Менделевская геномы рака дают редкую и весьма информативный `эксперимент природы", который обеспечивает возможность очертить генетики соматических метастазирования. Секвенирование генома анализ обоих опухолей выявлены доказательства общего происхождения на основе общих мутаций, но больше геномного разнообразия видели как на уровне мутаций, а также обширного аллельного дисбаланса и количество копий аберраций для metatasis. Рисунок 1 Семья и клиническая история менделевской диффузного рака желудка. Родословная индекса пациента 525 (III-1) изображен. Опухолевые типы обозначены цветом, включая зеленый для рака поджелудочной железы, красный для диффузного рака желудка, и желтый для рака молочной железы. Пациент с ее первичным раком желудка в возрасте 37 лет. Три года спустя она представила с абдоминальный дискомфорт. Контрастное КТ таза выявили массу левого яичника (желтый круг), что было подтверждено на биопсии, чтобы быть диффузный желудка метастазирования рака (то есть, Крукенберг опухоль). В процессе эволюции метастатических опухолей, ряд известных и рака кандидат событий водитель очерчены эволюции опухоли и генетической дивергенции метастаза от первичной опухоли.
Мы определили, если кандидаты драйверы от этого метастатического прогрессирования было достаточно, чтобы воспроизвести диффузный рак желудка. Наша методика моделирования рака используется в пробирке
желудка органоидов и позволяет проектировать генетический контекст драйвера этих видов рака и изучить процесс эволюции метастатическим и онкогенного затрагивающего пути дивергенции. Интеграция генетического анализа и биологического моделирования, мы определили независимую роль TGFBR2
(трансформирующий фактор роста-β-рецептора 2) в онкогенеза диффузного рака желудка. Наше экспериментальное моделирование рака опирается на границе раздела воздух-жидкость для культуры кишечной первичной мыши, который содержит как эпителиальные и мезенхимальные элементы, точно повторяет долгосрочный пролиферацию, мультилинейной дифференцировки Wnt /Notch-зависимой ниши стволовых клеток, и перистальтики [11]. Мы сообщили об аналогичной первичной желудочной Органоид системы культуры, которая точно повторяет мультилинейной эпителиальной дифференцировки и стромальных элементов [12]. В последнее время мы достигли надежные в пробирке
онкогенного преобразование первичной желудка, толстой кишки, поджелудочной железы и органоидов с помощью мутаций в Крас
и Trp53
, которые индуцируют дисплазии высокой степени и инвазии в пробирке с аденокарциномой
на подкожной трансплантации в организм мышей [13]. Продемонстрирована функциональную проверку кандидата желудка метастазирования рака водителей от исследований рака геномные профилирующими, сосредоточившись на моделировании TGFBR2
водителя в качестве доказательства принципа.
Результаты
диффузный рак желудка и метастатического прогрессирования
В возрасте 37 лет, пациент индекс (525) был поставлен диагноз стадии III (T3N1M0) слабо дифференцированной диффузного аденокарциномы желудка (рисунок 1). Ее 42-летняя сестра была диагностирована с диффузным аденокарциномы желудка 2 месяцами ранее. На основании семейной истории рака желудка и необычно молодой возраст начала, она подверглась зародышевой CDH1
тестирование мутации. были найдены пациента и ее сестра, чтобы иметь зародышевой линии мутации сайтов сплайсинга в интроне 10 (c.1565 + 2insT). Эта мутация зародышевой впоследствии сообщалось в другой семье с наследственной диффузной раком желудка (HDGC) [14]. Пациент подвергся тотальной гастрэктомии, чтобы удалить ее первичную опухоль, и было обнаружено у одного метастазировании в лимфатические узлы. Она получила стандартное лечение адъювантной включая комбинированной химиотерапии (цисплатин и 5-фторурацил) и излучения. Через три года после того, как ее первоначальной презентации, пациент сообщил о прогрессивную нижней части живота наполненность. Компьютерная томография (КТ) показала большую массу тазовую в соответствии с левым метастаз яичника (Рисунок 1). Впоследствии, пациент было подвергнуто лапаротомии с двусторонним придатков матки и биопсии в малом тазу. Патологические исследования показали, метастатической аденокарциномы с участием яичник, иначе называемый как опухоль Крукенберг, с тем же гистологической внешний вид как первичной опухоли. В одном исследовании сообщалось, что среди диффузного рака желудка с метастатическим распространением, яичник был метастатической сайт в 28,8% случаев [15]. Таким образом, яичник общий сайт для метастазирования.
Анализ секвенирования генома рака
Оба ExoME и весь геном парноконцевое Секвенирование проводили на первичной опухоли, метастазирование яичников и нормальной ткани, которая включала крови и нормальному желудка ткань (Дополнительный файл 1: Таблица S1). Ткань из метастазировании в лимфатические узлы не был доступен для анализа. Несколько методов секвенирования были использованы для компенсации степени нормальной стромы смеси, непосредственно в результате инфильтративных инвазивности диффузного желудочного подтипа рака. Мы определили степень нормального генома смеси и корректируется для включения нормальной ДНК (дополнительный файл 1: Методы). Учитывая сложность образцов опухолей, мы провели дополнительный раунд целевой последовательности, чтобы подтвердить наличие мутаций и других генетических аберраций, которые имели место в экзонов, вблизи границ экзона или стимуляторы.
В целом, мы получили больше, чем 100 × средний охват для каждого ExoME и обычно опирались на данные ExoME для открытия кодирующей область мутации. Для целого генома, мы имели больше, чем 60 × средний охват для рака всей выборки первичного генома и 30 × для метастатической генома. Весь секвенирование генома была использована для определения более широкомасштабных генетических аберраций, таких как изменение числа копий (ВКК), аллельные дисбалансов, перестроек и других классов структурных перестроек. После выравнивания, мы проводили вариант, призывающую для выявления соматических мутаций и других классов генетических аберраций. Это включало соматические мутации, делеции погружного (вставкам), ВКК, с потерей гетерозиготности регионов (LOH), а также рак перегруппировки (дополнительный файл 1: Таблица S3 и S4) Таблица. В качестве контроля для одного нуклеотида варианта призванию, мы генотипирование образцов с Affymetrix 6.0 однонуклеотидным полиморфизма (SNP) массивы; мы сравнили генотипов с выявленными СНПС из данных последовательностей. Согласованность ExoME и весь геном SNP данных к данным массива составляет 99%.
Кодирующая область мутации и проверки с глубоким секвенирования
Мы выявили мутации, которые произошли в экзонов и интронных мутаций в пределах 100 оснований границы экзона и результаты сведены в дополнительный файл 1: Таблица S2. Как уже отмечалось ранее, образцы опухоли имели сложный состав, что уменьшило охват последовательности некоторых мутаций. Мы исходили с дополнительным раунде целевой последовательности, чтобы подтвердить эти мутации и определяют их присутствие в обеих опухолей. Мы разработали метод количественного глубокого целевого переупорядочения, который охватывает около 300 баз вокруг конкретной мутации локусов (дополнительный файл 1: Таблица S5). Средняя охват целевой последовательности для каждого мнимого мутации или локусам составляет 278 × для нормального, 251 × для первичной опухоли и 152 × для метастазирования.
Между этими двумя опухолями, мы независимо друг от друга подтверждены в общей сложности 77 мутаций, которые произошли в течение или вблизи экзонов (Дополнительный файл 1: Методы и таблица S5). Подтвержденные генетические аберрации включали: (1), не синонимичные мутации, (2) синонимичные мутации, (3) вставки, или (4) делеции. При целевой последовательности данных, мы определили частоту мутации аллельного (MAF) между первичной опухоли и метастаз для каждой мутации. Это включает в себя определение доли последовательности считывания с мутацией по сравнению с эталонной последовательностью читает. Мы были в состоянии определить, какие мутации были распространены или исключительно для первичной опухоли по отношению к метастазированию. Среди 77 проверенных мутаций, то распределение было таково, что мутации, как правило, уникальны либо для первичной опухоли или метастатического сайта. Например, первичная опухоль имела восемь мутаций, которые не присутствовали в метастазировании в то время как метастаз было 37 мутаций, не присутствующих в первичной опухоли. Общим для обоих видов рака были 32 мутации.
Учитывая интервал трех лет до обнаружения метастаз, существует вероятность того, что метастазирование-специфические мутации происходили независимо от первичной опухоли. Мутации, специфичные для первичной опухоли, которые не присутствовали в метастаз яичника может быть результатом случайного генетического дрейфа. Мутации общие для обоих указывают на общее происхождение, но точные сроки дифференциации между двумя опухолями менее ясна, как отмечено этими мутациями с более низким МАФ. Часть этих генов имели высокие значения MAF, что указывает на более высокую вероятность присутствия во всех клоновых популяциях в первичной опухоли или метастазов. Как мы опишем ниже, эти гены были приоритетными для дальнейшего экспериментального тестирования в желудочном органоидов.
Мутации, влияющие на функцию гена
Среди мутаций, которые внешне были проверены, мы сосредоточились на подмножестве мутаций, приводящих к аминокислотным заменам, преждевременный стоп кодоны и вставки подсчитывали, которые изменили открытую рамку считывания. В дальнейшем, мы определили, если эти кодирующие мутации были потенциально вредными для функции генов с помощью ряда алгоритмов прогнозирования, таких как Polyphen [16] и SIFT [17] среди других. На основании информации, MAF для каждой мутации, мы определили, были ли эти мутации с возможным вредного влияния на генные продукты, общим или исключительно к первичной опухоли и метастазирование (рисунок 2). Рисунок 2. Сравнение генетических аберраций в первичной опухоли и метастазов. Общие по сравнению с
эксклюзивных генетических аберраций сравниваются между двумя опухолевые геномов. (А) Гены с кодированием мутации, имеющие потенциальное пагубное воздействие перечислены. Эти гены классифицируются на основе того, являются ли они эксклюзивные (красные символы) или общие (зеленые символы) к первичной опухоли и метастазов. Мутации, все это приводит к изменениям в составе аминокислот продукта гена, и были идентифицированы, чтобы иметь значительное изменение с высокой вероятностью влияния на функцию генного продукта. (Б) Краткое изложение хромосомных аберраций показано через весь геном рака обеих опухолей. Это включает в себя изменение числа копий (CNV) или потеря гетерозиготности (LOH). Красные блоки указывает на события исключительные к первичной опухоли или метастазов. Зеленые блоки указывают на события, общие для обоих. Число событий на хромосоме указана в каждом блоке. Стрелки показывают события лох или делеции, которые охватывают р руку, Q руку или целую хромосому. Красные стрелки указывают на хромосомные аберрации, которые являются исключительными и зеленые стрелки указывают на события, которые являются общими.
На подмножестве вредных мутаций, мы провели дополнительный биологический анализ токопровода, обзор литературы и сравнение с данными Атлас генома рака, доступных для диффузного рака желудка. Это был выявлен ряд известных генов рака и вероятных кандидатов, связанных с раком с мутациями, которые, вероятно, оказало влияние на функции белка. Мы сосредоточили свое внимание на ряде генов водителей кандидат (таблица 1), которые ранее были продемонстрированы иметь онкогенные потенциальных или были известны супрессоры опухоли с биаллельных изменениями, присутствующими в онкогенов Рак Рак genomes.Table 1 с усилениями или водителей рака с биаллельных событий <Ьг> Происхождение

Известный или водитель рак кандидат

биаллельных событие

аллельных Изменение 1

мутацию или геномную аберрацию

Chr
положение
Chr или интервал

аллельные изменения 2

Уникальный для первичной
FGFR2 *

Amplification
6-кратное усиление
10
117820033 - 119748751
Общим для первичной опухоли и метастазов
CDH1

Да
Удаление
Частичное удаление экзона 9
16
68847326 - 68847403 <бр> Половые мутации в CDH1

TP53

Да
5 'сплайсинга мутации сайта
Аберрантная сплайсинга
17
7578370
гемизиготной потеря 17р руку <бр> Уникальный для метастазирования
TGFBR2

Да
INDEL
сдвигом рамки стоп-кодона в экзоне 4 страница 3 30691871
гемизиготной удаление дикого типа TGFBR2
локус
PCDH7

Да
миссенс
S87R 4
30723305
гемизиготной удаление дикого типа 4 руки
FERMT1
локусов
Да
Потеря гетерозиготности
FERMT
1 расположен в 20p12.3
20
FERMT
1 мутацию
BMP7
локусы
Да
Потеря гетерозиготность
BMP7
расположен в 20q13.3
20
BMP7
мутации
Chr.:
хромосома вариации числа копий и аллельных дисбалансов, отличающих первичной опухоли с метастазированием <бр> Мы отметили более крупном масштабе геномных аберраций, дифференцированные первичные от метастаз (рис 2b и 3а). Это включало изменения количества копий и события лох. Уникальный для первичной опухоли были две геномные усилений на хромосомах 5 и 10, а две инверсии на хромосомах 15 и 16 (дополнительный файл 1: Таблица S4). Хромосома 10 усиления охватывает 1.66 Mb интервал. При рассмотрении вопроса о делеции или аллельные дисбалансов, единственным крупным событием, которое было отмечено участие потерю р плеча хромосомы 17. Рисунок 3 генетической дивергенции метастаз яичника от первичного рака желудка для критических водителей-кандидатов. Геномная положение мутации, копировать вариации числа (CNV) области или с потерей гетерозиготности (LOH) интервалы показаны из геномов рака. Для хромосомных участков, ось Y. обозначает положение с соответствующей хромосоме, его длина в megabases (МБ) и идеограмма обозначения, показанные слева от профиля числа копий. Вредных мутаций показаны в виде коробочной стрелки с символом гена. (А) генома широкое распространение раковых конкретных интервалов ВКК и LOH суммируются по всем хромосом для первичной опухоли и метастазов. (Б) на хромосоме 3, метастаз имели уникальные биаллельных события, связанные с пагубное TGFBR2
мутации и геномную удаление, влияющего на другой аллель, как видно наиболее отчетливо с интервалами лох. Вторично к геномных делеций, LOH демонстрируется как сдвиг в малом аллельного значения отношения частот -1 и коррелирует с геномной делецией. (С) на хромосоме 10, в Fgfr2
ген расположен в геномной области усиления видели только в первичном, а не метастаз. Усиление отмечается в красном круге.
В отличие от первичной опухоли, метастатической опухоли имели многочисленные хромосомные масштабных лох событий и геномные делеции, затрагивающие 12 различных хромосом, большинство из которых были уникальны для метастатической опухоли (рис 2) , Это включало несколько удалений и скопировать нейтральные лох события, которые подробно описаны в файле Дополнительный 1: Таблица S3. Был пятикратное геномная усиление в хромосоме 2, но никаких конкретных известных генов не существовало в пораженном интервале. Там не было никаких видимых между хромосомные транслокации либо в первичной опухоли или метастаз геномов. Другие перегруппировки рака были идентифицированы, но не указывают на аберраций в каких-либо генов водителя кандидата (Дополнительный файл 1: Таблица S4). Были признаки крупномасштабной геномной нестабильности на основе анализа аллельного дисбаланса; хромосомах 14, 17, 20 и 22 всех вовлеченных вся хромосома.
Для числа копий аберраций и аллельных дисбалансов, мы определили эксклюзивные по сравнению с общими событиями между первичной опухоли и метастазов. Единственная общая генетическая аберрация включал р плеча хромосомы 17. В целом, отсутствие перекрытия свидетельствует о значительной генетической дивергенции от первичной опухоли и метастазов, несмотря на общее происхождение, как обозначено общими мутаций в критических супрессоров опухолей.
Геномного интервалы LOH, число копий аберрацию и перегруппировки события по сравнению с положением валидированных мутаций гена. Такой комплексный анализ указал на ряд генов, которые имели биаллельных изменения, связанные как потерю дикого типа аллеля из большого интервала геномных аберраций и мутантный аллель. Были рассмотрены результаты для генов с биаллельных хитов, чтобы быть сильными кандидатами для участия с потерей функции при раке (Таблица 1).
Идентификация водителей рака общей для первичной опухоли и метастазов
И первичный и метастазирование содержали события драйвера рака, которые были, вероятно, будет критическим для онкогенеза в контексте первоначального CDH1
мутации (Таблица 1, Рисунок 2). В дополнение к зародышевой CDH1
интронной мутации, второй CDH1
аллель имел соматическое 77 н.п. геномную удаление части экзона 9, который влияет вниз по течению кодирующие области, а также. В CDH1
соматическая мутация была идентична в обоих первичных и метастатических желудочных геномов рака, демонстрируя общее генетическое происхождение, и обеспечение сильного генетические доказательства того, что этот водитель имел критическую роль в диффузной онкогенеза желудка. Мутации, влияющие на CDH1
экзон 9, которые приводят к потере экспрессии белка часто были обнаружены в диффузного рака желудка [18] - [20]. Последовательность этого экзона в аминокислоты представляет предполагаемый кальций-связывающий сайт, который, вероятно, важно для функции рецепторов
первичной и метастатической опухоли также совместно биаллельных сплайсинга донора сайта мутации. (c.559 + 1G ≫ А) пятого интрона TP53
и хромосома 17p LOH событие, охватывающая TP53
локус (дополнительный файл 1: Рисунок S1). TP53
мутации сплайсинга прерывает сплайсинг РНК [21] и является ранее сообщалось мутации рака [22], [23]. Анализы спорадических и наследственных видов рака желудка выявили TP53
мутации, которые происходят одновременно с CDH1
мутации [24], [25]. CDH1
инактивация в париетальных клеток желудка не вызывает рак желудка, предполагая, что потеря CDH1
недостаточна для инициации опухоли [26]. Тем не менее, двойной условный нокаут CDH1
и TP53
индуцирует развитие диффузной карциномы желудка [26]. Интересно отметить, что геномные интервал случае LOH, влияющего на ТР53
локус был больше в сравнении с метастазированием первичной опухоли. Это могло произойти из-за независимых геномной нестабильности событий, учитывая сильный отбор для биаллельной потери функции TP53.
FGFRis в действенную драйвер рака исключительно для первичной опухоли желудка
В первичной опухоли, был шестикратным геномная амплификации области хромосомы 10 ц руку и покрыли интервал 1,66 Mb. В рамках этого геномных областей был онкогенными FGFR2 водитель кандидат
также упоминается как фактор роста фибробластов рецептор 2 (рис 3в). Это было подтверждено с несколькими методами, включая секвенирование, анализ массива и проверки с помощью количественной ПЦР. FGFR2 представляет собой трансмембранный рецептор, который действует как часть ключевой сигнальной трансдукции регуляции и восстановления тканей эмбрионального развития среди множества других функций [26].
Для проверки распространенности Fgfr2
амплификации в диффузных по сравнению с кишечными рака желудка , мы проанализировали 37 диффузного и 27 кишечных подтипов первичных образцов желудочного опухоли с цифровой ПЦР [27]. Ранее мы показали, что этот метод является глубоко чувствительным для обнаружения число копий аберрацию даже в контексте нормальной ДНК опухолевого разбавление диплоидный ДНК. Наше исследование показало, Fgfr2
амплификации в четырех из 37 (11%) образцов диффузная опухоль, которая отсутствовала в кишечных пробах подтипа (рис 4а). Рисунок 4 Распространенность FGFR2 в опухолях желудка человека и его вклад в клеточной пролиферации. (А) спорадические желудка образцы рака оценивали с помощью количественной ПЦР цифровой для определения Fgfr2 количество геномной копии. Черные точки представляют собой диффузный рак желудка. Красные точки указывают на кишечную подтип рака желудка. (Б) Генетические характеристики AGS (Fgfr2
диплоидные) и KatoIII (FGFR2 усиливается) клетку рака желудка линии показаны. (С) выживания Процент для AGS линии клеток рака показана с ингибиторами FGFR2 различной специфичности. (Г) KatoIII диффузного желудочного линии раковых клеток обрабатывали ингибиторами FGFR2 различной специфичности. Y-ось изображает выживание процентов по сравнению с
Х-оси с концентрациями бревен. Во всех панелях, Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения. Разница в выживаемости процентов клеток между KatoIII и AGS клеток было статистически значимым (P &
л; 0,05). В трех самых высоких концентраций всех препаратов, за исключением Brivanib что было значительным только при самой высокой концентрации
в поддержку ее роль в качестве водителя кандидата, Fgfr2
амплификации присутствует в количестве желудочного линий раковых клеток [28], [29] и впоследствии сообщалось в различных желудочно-кишечных злокачественных опухолей, таких как аденокарциномы пищевода [30]. Кроме того, лечение линий раковых клеток с FGFR2 специфические низкомолекулярные ингибиторы или shRNAs приводит к мощному торможения роста [28], предлагающей функциональную роль Fgfr2
амплификации в диффузной подтипа.
Функциональный анализ водителя FGFR2 в сочетание с CDH1 и TP53
Мы определили два примера первичного диффузного рака желудка с совместной встречаемости известных и предполагаемых водителей рака, связанных с CDH1
, TP53
и FGFR2
как видно у пациента индекса , Первый пример включал диффузного желудочного образца рака, который был среди желудочных аденокарцином, проанализированных TCGA. Использование портала cBio TCGA [10], мы определили пациента (TCGA-BR-6803), который имел аналогичное дополнение генетических аберраций в CDH1
, TP53
и FGFR2
, все из которых были ранее описанный в раке, как показано в КОСМИК хранилище онкомутации. Это включало следующее: миссенс мутация в CDH1
(D254Y), которая была описана в трех других видов рака; миссенс мутации (L130F) в TP53
где мутации в этом кодона было зарегистрировано в 37 других видов рака; в Fgfr2
амплификации, которые мы и другие определили при диффузном раке желудка.
В качестве второго примера, мы идентифицировали человек диффузные клетку рака желудка линии, KatoIII, который имеет такой же состав генетических аберраций, влияющих на одни и те же гены рака в качестве первичной опухоли нашего индекса пациента. KatoIII имеет CDH1
мутации, приводящей к интронной вставки последовательности в мРНК [31], [32], а TP53
мутации, приводящей к полной делеции гена [33] и Fgfr2
усиления [29] (Рисунок 4b). Эта клеточная линия позволила нам оценить потенциальную онкогенного роли Fgfr2
усиления в специфической генетической контексте CDH1
и TP53
мутации, похожие на первичной опухоли Индекс пациента.
Для определения вклада от FGFR сигнализации к опухолевого роста, мы обрабатывали клетки KatoIII с несколькими FGFR2 малая молекула тирозин-киназа ингибиторов (ИТК), в том числе Brivanib, TKI258, Ponatinib и AZD4547 [34]. В качестве контроля мы использовали желудочный линии раковых клеток AGS, которая является дикого типа для FGFR2
, CDH1
и TP53
, но имеет мутации в KRAS
и PIK3CA
[35] ( Рисунок 4b). Все ингибиторы FGFR2 индуцированной гибели клеток в KatoIII но не AGS клетки (рис 4С и г). Наиболее мощным из этих ИТК, AZD4547, имеет IC <суб> 50 приблизительно 2 нМ в клетках KatoIII и 39,580 нМ в AGS клетках (рис 4в, г). Каждый из ингибиторов показали статистически значимое более низкое IC <суб> 50 в FGFR2-амплифицируют клеток KatoIII по сравнению с не FGFR2 амплифицировали клеток AGS при всех тестированных концентрациях (фиг.4С и г).
В отличие от этого, обработка KatoIII и AGS клетки с цитотоксическими химиотерапевтическими агентами, такими как паклитаксел, 5-фторурацила и карбоплатина не оказывает существенного влияния ни на KatoIII или AGS линий, с аналогичными IC <подразделам> 50 определены в каждом (дополнительный файл 1: Таблица S7). Для AZD4547, 20,000-кратное различие в чувствительности к FGFR ингибиторов предполагает, что передача сигналов FGF является важной движущей силой для CDH1
-initiated желудка клеточной пролиферации и это ИТК представляет собой потенциальную целевую терапию в диффузных подтипа рака укрывательство Fgfr2
уточнениями.
биаллельных инактивация TGFBRis исключительно для яичников метастазов
Генетическая дивергенция была очевидна; метастаз таил свое собственное уникальное подмножество мутаций и геномных аберраций.

• Токсин ботулизма в желудочном подслизистой уменьшает стимулируется производство HCl в rats
• Прогнозирование метахронных нескольких первичных раковых заболеваний после лечебной резекции желудка cancer