Metastatisk tumor evolution og organoide modellering implicerer TGFBR2as en kræft driver i diffus gastrisk cancer

metastatisk tumor evolution og organoide modellering implicerer TGFBR2
som kræft driver i diffus mavekræft
Abstract
Baggrund
mavekræft er den anden -fører årsag til globale kræftdødsfald, med metastatisk sygdom, der repræsenterer den primære årsag til dødelighed. For at identificere lokomotivføreraspiranter involveret i onkogenese og tumor udvikling, vi foretage en omfattende genom sekventering analyse af metastatisk progression i en diffus mavekræft. Dette indebærer en sammenligning mellem en primær tumor fra en arvelig diffus mavekræft syndrom proband og dens gentagelse som en æggestokkene metastaser.
Resultater
Både den primære tumor og æggestokkene metastaser har fælles biallele tab af funktion af både CDH1
og TP53
tumorsuppressorer, hvilket indikerer en fælles genetisk oprindelse. Mens den primære tumor udviser amplifikation af fibroblast vækstfaktor receptor 2 (FGFR2
) genet, metastase mangler især FGFR2
amplifikation men snarere besidder unikke biallele ændringer i transformerende vækstfaktor-beta receptor 2 (TGFBR2
) med angivelse af divergerende in vivo
evolution af en TGFBR2
-mutant metastatisk klonal population i denne patient. Som TGFBR2
mutationer er ikke tidligere blevet funktionelt valideret i gastrisk cancer, vi modelleret metastatiske potentiale TGFBR2 tab i en murin tredimensional primær gastrisk organoide kultur. Den Tgfbr2
shRNA knockdown inden CDH1
- /-
; TP53
- /-.
Organoids genererer invasion in vitro
og robust metastatisk tumorigenicitet in vivo
, bekræfter Tgfbr2
metastaser suppressor aktivitet
Konklusioner
Vi dokumenterer metastatisk differentiering og genetisk heterogenitet af diffus mavekræft og afslører den potentielle metastatisk rolle TGFBR2
tab af funktion. Til støtte for denne undersøgelse, anvender vi en muse primær organoide dyrkningsmetode i stand til den gentog in vivo
metastatisk mavekræft. Samlet set beskriver vi en integreret tilgang til at identificere og funktionelt validere formodede kræft bilister involveret i metastaser.
Baggrund
Worldwide, gastrisk adenocarcinom er den fjerde mest almindelige malignitet og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt mænd og kvinder. Baseret på karakteristiske histopatologiske træk, er gastrisk adenocarcinom kategoriseret i diffuse og tarm undertyper [1]. Med hensyn til histopatologi, diffuse gastriske kræftformer er generelt udifferentierede, ofte har signet celle ring funktioner og invasivt infiltrere normal mave væv. I modsætning hertil den intestinale subtype har epiteliale funktioner og danner diskrete tumormasser ligner tyktarmskræft. Diffus gastrisk cancer har en højere forekomst af metastatisk sygdom og en generelt dårligere prognose sammenlignet med den intestinale subtype [2], [3]. I øjeblikket har de genomiske analyser af diffus gastrisk kræft involveret et mindre antal prøver, herunder en nylig undersøgelse fra Kræftens Genome Atlas Project (TCGA) og en hel genom sekventering undersøgelse af et sæt af diffuse gastriske tumorer [4]. Der er imidlertid få, om nogen, undersøgelser, detaljeret metastatisk evolution af gastrisk cancer; metastatiske tumorer er typisk fraværende fra store genomiske undersøgelser kræft såsom TCGA. Samlet set lidt om den onkogene proces og tumor udvikling af metastatisk gastrisk kræft på trods af sin altoverskyggende klinisk betydning [5].
I arvelig diffus mavekræft (HDGC), germlinie mutationer i CDH1
(dvs. E- cadherin) giver en 70% levetid risiko for at udvikle diffus gastrisk kræft [6], [7]. Den CDH1
tumorsuppressorgen koder E-cadherin, et transmembrant glycoprotein, som medierer calcium-afhængig celle-celle adhæsion. Ændringer i CDH1 funktion påvirker epitel-mesenkymale overgang (EMT), som er blevet impliceret som spillende en rolle i tumorigenese. Undersøgelser af de ramte HDGC enkeltpersoners tumorer giver en unik mulighed for at bestemme de vigtigste drivkræfter for diffus mavekræft i forbindelse med CDH1
tab af funktion. Dokumentation af den rolle, CDH1
i sporadiske diffuse gastrisk kræft omfatter den observation, at 50% indeholder CDH1
mutationer eller hypermethylering af CDH1
promotor [8], [9]. En nylig hele genomet sekventering undersøgelse af diffus mavekræft identificeret også hyppige CDH1
mutationer som den mest almindelige driver begivenhed [4]. De TCGA mavekræft data viser også en høj frekvens af somatiske CDH1
mutationer [10]. Betydeligt mindre om identitet og rolle co-forekommende drivere, der bidrager til at sprede gastrisk metastaser.
Heri rapporterer vi en undersøgelse af metastatisk evolutionære proces i diffus gastrisk kræft. Vores mål var at identificere kendte og lokomotivføreraspiranter der afgrænse tumor progression under metastaser. Vi udførte en omfattende genom sekventering analyse af en primær gastrisk tumor og metastase fra et individ med en kimcellelinje CDH1
mutation (figur 1), som præsenteret med en gastrisk primær, efterfulgt efter 3 år ved metastase i venstre æggestok. I betragtning af den eksisterende kønscellelinie mutation i CDH1,
kræft genomet kun kræver en anden allel ramt via en somatisk genetisk afvigelse, som er påvist i tumoren fra denne person. Fordi den oprindelige kræft driver begivenhed er kendt, mendelske kræft genomer giver en sjælden og meget informative `eksperiment af naturen", der giver mulighed for at afgrænse somatiske genetik metastaser. Genom sekventering analyse af både tumorer afslørede tegn på en fælles oprindelse baseret på fælles mutationer, men større genomisk mangfoldighed set både på niveauet af mutationer samt omfattende allel ubalance og kopiere nummer aberration for metatasis. Figur 1 Familie og kliniske historie af et Mendelsk diffus mavekræft. Stamtavlen af ​​indekset patient 525 (III-1) er afbildet. Tumor typer er angivet med farve herunder grøn for kræft i bugspytkirtlen, rød for diffus mavekræft, og gul for brystkræft. Patienten præsenteret med hendes primære mavekræft i en alder af 37 år. Tre år senere præsenterede hun med en abdominal ubehag. Kontrast-forstærket CT-scanning af bækkenet identificerede en venstre æggestok masse (gul cirkel), der blev bekræftet på biopsi for at være en diffus mavekræft metastaser (dvs. Krukenberg tumor). I løbet af metastatisk tumor evolution, en række kendte og kandidat kræft driver begivenheder afgrænset tumoren evolution og genetiske divergens af metastaser fra den primære tumor.
Vi bestemmes hvis lokomotivføreraspiranter fra denne metastatisk progression var tilstrækkelige til at gengive diffuse gastrisk cancer. Vores kræft modellering metode, der anvendes in vitro
gastrisk organoids og tillader en at konstruere den genetiske driver rammerne af disse kræftformer og studere processen med metastatisk evolution og onkogen vej divergens. Integration genetisk analyse og biologisk modellering, bestemt vi den uafhængige rolle TGFBR2
(transformerende vækstfaktor-β receptor 2) i onkogenese af diffuse mavekræft. Vores eksperimentelle cancer modellering bygger på en luft-væske-grænseflade til primær muse intestinal kultur, der indeholder både epitel- og mesenchymale elementer, præcist rekapitulerer langsigtet proliferation, multilineage differentiation, Wnt /Notch-afhængig stamcelle niche, og peristaltik [11]. Vi rapporteret en tilsvarende primær gastrisk organoide kultur system, der præcist rekapitulerer multilineage epitheldifferentiering og stromale elementer [12]. For nylig opnåede vi solid in vitro
onkogen transformation af primær gastrisk, colon og pancreas organoids via mutationer i Kras
og Trp53
, der inducerer high-grade dysplasi og invasion in vitro
med adenocarcinom på subkutan transplantation i mus [13]. Vi viser den funktionelle validering af kandidat mavekræft metastase drivere fra kræft genomisk profilering undersøgelser, der fokuserer på modellering af TGFBR2
driveren som bevis for princippet.
Resultater
Diffus mavekræft og metastatisk progression
årig af 37 år, var indekset patienten (525) diagnosticeret med stadium III (T3N1M0) dårligt differentieret diffus gastrisk adenocarcinom (figur 1). Hendes 42-årige søster blev diagnosticeret med diffus gastrisk adenocarcinom 2 måneder tidligere. Baseret på familiens historie af gastrisk kræft og den usædvanligt ung alder for debut, gennemgik hun kønscellelinie CDH1
mutation test. Patienten og hendes søster viste sig at have en kimlinje splejsningsstedmutation i intron 10 (c.1565 + 2insT). Denne kimlinie mutation blev efterfølgende rapporteret i en anden familie med arvelig diffus gastrisk cancer (HDGC) [14]. Patienten gennemgik en total gastrektomi at fjerne hendes primære tumor og viste sig at have en enkelt lymfeknude metastaser. Hun modtog standard adjuverende behandling herunder kombineret kemoterapi (cisplatin og 5-fluorouracil) og strålebehandling. Tre år efter sin indledende præsentation, at patienten rapporterede progressive lavere oppustethed. En computertomografi (CT) scanning viste en stor bækken masse overensstemmelse med en venstre ovarie metastase (figur 1). Efterfølgende patienten gennemgik laparotomi med bilateral salpingo-ooforektomi og biopsi af bækken masse. Patologiske undersøgelser viste metastatisk adenokarcinom involverer æggestokkene, ligeledes benævnt en Krukenberg tumor, med den samme histologiske udseende som den primære tumor. En undersøgelse rapporteret, at blandt diffuse mavekræft med metastatisk spredning, æggestokkene var en metastatisk websted i 28,8% af tilfældene [15]. , Ovariet er således en fælles site for metastatisk sygdom.
Cancer genomsekvensering analyse
Både exome og hele genomet parret-ende-sekventering blev udført på den primære tumor, ovarie- metastase, og normalt væv, som omfattede blod og normal gastrisk væv (Yderligere fil 1: tabel S1). Væv fra lymfeknude metastaser var ikke tilgængelig til analyse. Multiple sekventering metoder blev anvendt til at kompensere for omfanget af normale stromal blanding, et direkte resultat af den infiltrativ invasivitet af den diffuse mavekræft subtype. Vi bestemt af omfanget af normal genom blandingen og korrigeret for optagelse af det normale DNA (Yderligere fil 1: Metoder). I betragtning af kompleksiteten af ​​de tumorprøver, gennemførte vi en ekstra runde af målrettet sekventering for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​mutationer og andre genetiske afvigelser, der fandt sted i exoner, nær exon grænser eller initiativtagere.
Samlet set opnåede vi mere end 100 × gennemsnitlig dækning for hver exome og generelt påberåbt exome data for opdagelsen af ​​kodende region mutationer. For hele genomet sekventering, havde vi mere end 60 × gennemsnitlig dækning for den primære kræft hele genomet prøve og 30 × til metastatisk genom. Hele genomet sekventering blev anvendt til at identificere større skala genetiske afvigelser såsom kopi nummer variation (CNVs), allele ubalancer, omlejringer, og andre klasser af strukturelle omlejringer. Efter justering, gennemførte vi variant ringer for at identificere somatiske mutationer og andre klasser af genetiske afvigelser. Dette omfattede somatiske mutationer, indsættelse-sletninger (indels), CNVs, tab-of-heterozygositet regioner (LOH) og kræft omrokeringer (Yderligere fil 1: Tabel S3 og tabel S4). Som en kontrol for enkelt nukleotid variant kald, vi genotype prøverne med Affymetrix 6.0 enkelt (SNP) arrays; vi sammenlignet genotyperne til de identificerede SNPs fra sekvensdata. Den konkordans af exome og hele genomet SNP data til array-data var 99%.
Kodende region mutationer og validering med dyb sekventering
Vi identificerede mutationer, der fandt sted i exoner og intron mutationer inden for 100 baser af exon grænsen og resultaterne er sammenfattet i supplerende fil 1: tabel S2. Som tidligere bemærket tumorprøverne havde komplekse sammensætning, der reducerede sekvensen dækning af nogle mutationer. Vi fortsatte med en ekstra runde af målrettet sekventering til at validere disse mutationer og bestemme deres tilstedeværelse i begge tumorer. Vi har designet en analyse for dyb målrettet resekventering der dækkede ca. 300 baser rundt om specifik mutation loci (Yderligere fil 1: Tabel S5). Den gennemsnitlige målrettet sekventering dækning for hver formodede mutation eller loci var 278 × for normale, 251 × for den primære tumor og 152 × for metastaser.
Mellem de to tumorer, vi uafhængigt valideret i alt 77 mutationer, der fandt sted inden for eller proksimalt for exons (Yderligere fil 1: Metoder og tabel S5). Validerede genetiske afvigelser omfattede: (1) ikke-synonyme mutationer, (2) synonyme mutationer, (3) insertioner eller (4) deletioner. Med en målrettet sekventering data, bestemte vi mutationen allel frekvens (MAF) mellem den primære tumor og metastase til hver mutation. Dette involverer bestemmelse den del af en sekvens læst med en mutation i sammenligning med referencesekvensen læser. Vi var i stand til at identificere, hvilke mutationer var almindelige eller eksklusivt til den primære tumor versus metastase. Blandt de 77 validerede mutationer, var fordelingen således at mutationer var generelt unik enten til den primære tumor eller metastatisk site. For eksempel vil den primære tumor havde otte mutationer, som ikke var til stede i metastase mens metastaser havde 37 mutationer der ikke forekommer i den primære tumor. Fælles for begge kræftformer var 32 mutationer.
Betragtning af interval på tre år forud for påvisning af metastaser, er der en mulighed for, at metastase-specifikke mutationer forekom uafhængigt af den primære tumor. Mutationer er specifikke for den primære tumor, som ikke var til stede i æggestokkene metastase kan være resultatet af tilfældige genetisk drift. De mutationer er fælles for begge indikerer en fælles oprindelse, men det nøjagtige tidspunkt for differentieringen mellem de to tumorer er mindre klar som bemærket af disse mutationer med lavere MAF. En undergruppe af disse gener havde høje MAF værdier, hvilket indikerer en højere sandsynlighed for at være til stede i alle klonale populationer i den primære tumor eller metastase. Som vi beskriver senere, blev disse gener prioriteret til yderligere eksperimentel afprøvning i gastrisk organoids.
Mutationer påvirker genfunktion
Blandt de mutationer, der var eksternt valideret, vi fokuseret på den delmængde af mutationer, der fører til aminosyresubstitutioner, for tidlig stop- kodoner og indels der ændrede den åbne læseramme. Efterfølgende har vi fastslået, om disse kodning mutationer var potentielt skadelige for gen-funktion ved hjælp af en række forudsigelse algoritmer såsom Polyphen [16] og finkæmme [17] blandt andre. Baseret på MAF oplysninger for hver mutation, bestemte vi, om disse mutationer med et muligt skadelig indvirkning på genprodukterne var almindelige eller eksklusivt til den primære tumor og metastase (figur 2). Figur 2 Sammenligning af de genetiske afvigelser i den primære tumor og metastase. Fælles versus
eksklusive genetiske afvigelser sammenlignes mellem de to tumor genomer. (A) Gener med kodning mutationer, der har en potentiel skadelig effekt er angivet. Disse gener er klassificeret baseret på, om de er eksklusiv (røde tegn) eller fælles (grønne tegn) til den primære tumor og metastase. Mutationerne alle føre til ændringer i aminosyresammensætning af genproduktet og blev identificeret til at have en væsentlig ændring med en høj sandsynlighed for at påvirke genproduktets funktion. (B) Et sammendrag af kromosomafvigelser er vist over hele cancer genomet af begge tumorer. Dette omfatter kopiantals variation (CNV) eller tab af heterozygositet (LOH). De røde blokke indikerer begivenheder eksklusive til den primære tumor eller metastase. De grønne blokke angiver hændelser er fælles for begge. Antallet af begivenheder pr kromosom er opført i hver blok. Pile angiver LOH begivenheder eller sletninger som omfatter p arm, q arm eller hele kromosom. Røde pile angiver kromosomafvigelser, som er eksklusive og grønne pile viser begivenheder, der er fælles. Til salg på den delmængde af skadelige mutationer, vi gennemførte yderligere biologisk vej analyse, litteratur gennemgang og sammenligning mod Kræft Genome Atlas data for diffus mavekræft. Denne identificeret en række kendte cancer gener og sandsynlige kræftrelaterede kandidater med mutationer, der sandsynligvis haft en indvirkning på protein funktion. Vi fokuserede på en række kandidat driver gener (tabel 1), der tidligere havde vist sig at have onkogene potentielle eller var kendt tumorsuppressorer med biallele ændringer stede i kræft genomes.Table 1 Kræft onkogener med amplifikationer eller kræft bilister med biallele begivenheder
Origin
kendt eller kandidat kræft driver
biallele begivenhed
Allelic ændring 1
Mutation eller genomisk aberration
Chr

Chr position eller interval
Allelic ændring 2
Unikt for den primære
FGFR2 *
Amplification
6 gange forstærkning
10
117820033 - 119748751
fælles for den primære tumor og metastase
CDH1
Ja
Sletning
Delvis sletning af exon 9
16
68.847.326-68.847.403
Kimcellelinje mutation i CDH1
TP53
Ja
5 'splejsningsstedmutationen
Afvigende splejsning
17
7.578.370
hemizygote tab af 17p arm
Unikt for metastaser
TGFBR2
Ja
læserammeforskydning Indel
Stop codon i exon 4
3
30.691.871
hemizygote sletning af vildtype TGFBR2
locus
PCDH7
Ja
missense
S87R
4
30.723.305
hemizygote sletning af vildtype 4 arm
FERMT1
loci
Ja
Tab af heterozygositet
FERMT
1 placeret i 20p12.3
20
FERMT
en mutation
BMP7
loci
Ja
Tab af heterozygositet
BMP7
placeret i 20q13.3
20
BMP7
mutation
Chr:. kromosom
Kopier nummer variationer og allele ubalancer adskiller den primære tumor fra metastaser
Vi bemærkede større skala genomiske afvigelser, der differentierede den primære fra metastaser (figur 2b og 3a). Dette omfattede kopi nummer ændringer og LOH arrangementer. Unikt for den primære tumor var to genomiske amplifikationer på kromosomerne 5 og 10, og to inversioner på kromosomerne 15 og 16 (Yderligere fil 1: Tabel S4). Den kromosom 10 amplifikation dækkede et 1,66 Mb interval. Når man overvejer sletninger eller allele ubalancer, den eneste større begivenhed, der blev noteret involveret et tab af p arm af kromosom 17. Figur 3 Genetisk afvigelser i æggestokkene metastaser fra den primære mavekræft til kritiske lokomotivføreraspiranter. Den genomiske position af mutationen, kopiere nummer variationer (CNV) regioner eller tab af heterozygositet (LOH) intervaller vises fra kræft genomer. For kromosom plots, Y-aksen betegner position med den respektive kromosom, dens længde i megabaser (MB) og ideogram betegnelse er vist til venstre for kopital profil. Skadelige mutationer er vist som boxed pile med genet symbol. (A) genom bred fordeling af kræft-specifikke CNVs og LOH intervaller er sammenfattet på tværs af alle kromosomer for den primære tumor og metastase. (B) på kromosom 3, metastaser havde unikke biallele begivenheder, der involverer en skadelig TGFBR2
mutation og en genomisk deletion påvirker den anden allel som tydeligst ses med LOH intervaller. Sekundært til genomiske deletioner, er LOH demonstreret som et skift i den mindre allel frekvens forholdsværdi af -1 og korrelerer med en genomisk deletion. (C) på kromosom 10 blev FGFR2
gen lokaliseret i en genomisk amplifikation region set kun i den primære og ikke metastase. Forstærkningen er noteret i en rød cirkel.
I modsætning til den primære tumor, metastatisk tumor havde talrige kromosomal skala LOH begivenheder og genomiske sletninger påvirker 12 forskellige kromosomer, hvoraf størstedelen var unikt for metastatisk tumor (figur 2) . Dette omfattede flere sletninger og kopiere neutrale LOH begivenheder, der er beskrevet i supplerende fil 1: Tabel S3. Der var en femdobbelt genomisk amplifikation i kromosom 2 men fandtes en særlig kendte gener i det berørte interval. Der var ingen påviselige inter-kromosomale translokationer i enten den primære tumor eller metastase genomer. Andre kræft omrokeringer blev identificeret, men ikke peger i retning af afvigelser i nogen kandidat driver gener (Yderligere fil 1: Tabel S4). Der var tegn på stor skala genomisk instabilitet baseret på allel ubalance analyse; kromosomer 14, 17, 20, og 22 alle involverede hele kromosom.
For kopital aberrationer og allele ubalancer, vi identificeret eksklusive versus fælles arrangementer mellem den primære tumor og metastase. Den eneste fælles genetisk afvigelse involverede p arm af kromosom 17. Samlet, manglen på overlapning tydede på signifikant genetisk afvigelse fra den primære tumor og metastase trods en fælles oprindelse som angivet ved delte mutationer i kritiske tumorsuppressorer.
Genomiske intervaller af LOH, kopiantal aberration og omlejring begivenheder blev sammenlignet med positionen af ​​validerede genmutationer. Denne integrerede analyse pegede på en række gener, der havde biallele ændringer involverer både et tab af vildtype-allel fra et stort interval genomisk aberration og en mutant allel. Resultaterne for gener med biallele hits blev anset for at være stærke kandidater til et tab af funktion involvering i kræft (tabel 1).
Identifikation af kræft bilister fælles for den primære tumor og metastase
Både den primære og den metastase indeholdt cancer driver begivenheder, som sandsynligvis ville være kritisk for tumorigenese i forbindelse med den oprindelige CDH1
mutation (tabel 1, figur 2). Ud over den kimcellelinje CDH1
intron mutation, den anden CDH1
allel havde en somatisk 77 bp genomisk deletion af en del af exon 9, der påvirker de nedstrøms kodende regioner. Den CDH1
somatiske mutation var identisk i både den primære og metastatisk gastrisk kræft genomer, viser en fælles genetisk oprindelse og giver stærke genetiske beviser for, at denne driver havde en afgørende rolle i diffus gastrisk tumorigenese. Mutationer, der påvirker CDH1
exon 9, der fører til tab af protein-ekspression er ofte blevet påvist i diffus gastrisk cancer [18] - [20]. Denne exon aminosyresekvens er en formodet calcium-bindende site, der sandsynligvis vigtig for receptorfunktion
primær og metastatisk tumor også delt biallel splejsningsdonorsite mutation. (C.559 + 1G > A), i femte intron af TP53
og et kromosom 17p LOH begivenhed der omfatter TP53
locus (Yderligere fil 1: Figur S1). Den TP53
splejsning mutation afbryder RNA-splejsning [21] og er en tidligere rapporteret cancer mutation [22], [23]. Analyserne af sporadiske og nedarvede gastrisk kræft har identificeret TP53
mutationer, der opstår i takt med CDH1
mutation [24], [25]. CDH1
inaktivering i gastriske parietalceller ikke inducerer gastrisk karcinom, tyder på, at tabet af CDH1
er utilstrækkelig til tumor initiering [26]. Men dobbelt betinget knockout af CDH1
og TP53
inducerer udvikling af diffus gastrisk karcinom [26]. Interessant nok genomiske interval af LOH begivenhed, der påvirker TP53
locus var større i metastase sammenlignet med den primære tumor. Dette kunne være sket på grund af uafhængige genomisk ustabilitet begivenheder givet den stærke valg for biallel tab af TP53 funktion.
FGFRis en handlingsrettet kræft driver eksklusivt til primære gastrisk tumor
I den primære tumor, der var en seks gange genomisk amplifikation af en region af kromosom 10 q arm og dækkede et interval på 1,66 Mb. Inden denne genomiske regioner var et onkogent lokomotivføreraspiranten FGFR2
også benævnt fibroblastvækstfaktorreceptor 2 (figur 3c). Dette blev bekræftet med flere metoder, herunder sekventering, array analyse og validering af kvantitativ PCR. FGFR2 er en transmembranreceptor, der fungerer som en del af en nøgle signaltransduktionsvej regulering vævsreparation og embryonale udvikling blandt en lang række andre funktioner [26].
At validere forekomsten af ​​FGFR2
amplifikation i diffundere versus intestinale gastriske cancere vi analyserede 37 diffus og 27 intestinal subtype primære gastrisk tumor prøver med digital PCR [27]. Tidligere påviste vi, at denne metode er dybt følsom til påvisning kopiantal aberration selv i forbindelse med normal diploid DNA fortynding tumor-DNA. Vores undersøgelse viste FGFR2
amplifikation i fire af 37 (11%) diffus tumorprøver, som var til stede i de intestinale undertype prøver (figur 4a). Figur 4 Udbredelsen af ​​FGFR2 i humane gastriske tumorer og dens bidrag til cellulær proliferation. (A) Sporadiske gastrisk cancer prøver blev vurderet ved kvantitativ digital PCR for at bestemme FGFR2 genomisk kopital. Sorte prikker repræsenterer diffuse gastriske cancere. Røde punkter angiver den intestinale undertype af mavekræft. (B) Genetiske egenskaber ved AGS (FGFR2
diploide) og KatoIII (FGFR2 forstærkes) gastrisk cancer cellelinjer vises. (C) Procent overlevelse for AGS cancercellelinie er vist med FGFR2 inhibitorer af varierende specificitet. (D) KatoIII diffus gastrisk cancercellelinie blev behandlet med FGFR2 inhibitorer af varierende specificitet. Y-aksen viser procent overlevelse versus
X-aksen med log koncentrationer. I alle paneler, Fejlbjælkerne viser standardafvigelsen på middelværdien. Forskellen i procent celle overlevelse mellem KatoIII og AGS celler var statistisk signifikant (P
< 0,05). På de tre højeste koncentrationer af alle stoffer, undtagen Brivanib som var kun signifikant ved den højeste koncentration
støtte for sin rolle som kandidat driver, FGFR2
amplifikation forekommer i en række af gastriske cancercellelinier [28], [29] og efterfølgende indberettet i forskellige gastrointestinale maligniteter såsom esophageal adenocarcinom [30]. Derudover behandling af cancer cellelinjer med FGFR2-specifikke småmolekylære inhibitorer eller shRNAs fører til kraftig vækstinhibering [28] antyder en funktionel rolle for FGFR2
amplifikation i den diffuse subtype.
Funktionel analyse af FGFR2 driveren i kombination med CDH1 og TP53
Vi identificerede to eksempler på en primær diffus mavekræft med samtidig forekomst af kendte og formodede kræft drivere involverer CDH1
, TP53
, og FGFR2
set i indekset patient . Det første eksempel indeholdt en diffus mavekræft prøve, der var blandt de gastriske adenokarcinomer analyseret af TCGA. Brug af cBio TCGA portalen [10], identificerede vi en patient (TCGA-BR-6803), som havde en lignende supplement af genetiske afvigelser i CDH1
, TP53
, og FGFR2
, som alle har været tidligere beskrevet i cancer, set i COSMIC cancer mutation repository. Dette omfattede følgende: en missense mutation i CDH1
(D254Y), der er blevet beskrevet i tre andre kræftformer; en missense mutation (L130F) i TP53
hvor mutationer i denne codon er blevet rapporteret i 37 andre kræftformer; den FGFR2
amplifikation som vi og andre har identificeret i diffus gastrisk cancer.
Som det andet eksempel, identificerede vi et menneske diffus gastrisk cancercellelinie, KatoIII, som har en lignende sammensætning af genetiske afvigelser, der påvirker de samme cancergener som den primære tumor fra indekset patient. KatoIII har en CDH1
mutation fører til en intronsekvens insertion i mRNA [31], [32], en TP53
mutation fører til en fuldstændig gendeletion [33] og FGFR2
amplifikation [29] (Figur 4b). Denne cellelinie tillod os at vurdere den potentielle onkogene rolle FGFR2
forstærkningen i specifikke genetiske sammenhæng CDH1
og TP53
mutationer, svarende til indekset patientens primære tumor.
At bestemme bidraget af FGFR signalering til neoplastisk vækst, behandlede vi KatoIII celler med flere FGFR2 lille molekyle tyrosin-kinase-inhibitorer (TKI'er), herunder Brivanib, TKI258, Ponatinib, og AZD4547 [34]. Som kontrol brugte vi den mavekræft cellelinje AGS, som er vildtype for FGFR2
, CDH1
, og TP53
, men har mutationer i KRAS
og PIK3CA
[35] ( Figur 4b). Alle FGFR2 hæmmere induceret celledød i KatoIII men ikke AGS celler (Figur 4c og d). Den mest potente af disse TKI'er, AZD4547, har en IC 50 på ca. 2 nM i KatoIII celler og 39.580 nM i AGS celler (figur 4C og D). Hver af inhibitorerne viste en statistisk signifikant lavere IC 50 i FGFR2-amplificeret KatoIII celler sammenlignet med ikke-FGFR2-amplificeret AGS celler ved alle testede koncentrationer (Figur 4c og d).
Derimod behandling af KatoIII og AGS celler med cytotoksiske kemoterapeutiske midler såsom paclitaxel, 5-fluorouracil og carboplatin ikke havde en signifikant effekt på enten KatoIII eller AGS linjer, med lignende IC 50 identificeret i hver (Yderligere fil 1: tabel S7). For AZD4547, den 20.000-fold forskel i følsomhed over for FGFR hæmmere tyder på, at FGF signalering er en kritisk chauffør til CDH1
-initiated gastrisk cellulær proliferation og denne TKI udgør en potentiel målrettet terapi i diffuse subtype kræftformer huser FGFR2
amplifikationer.
biallel inaktivering af TGFBRis eksklusivt til æggestokkene metastaser
Genetisk divergens var tydeligt; Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4. Tabel S5. Tabel S6. Tabel S7. Figur S1. Figur S3.

• Botulinumtoksin gastrisk submucosa reducerer stimuleret HCI produktion i rotter
• Forudsigelse af metachronous multiple tumorer efter kurativ resektion af mavekræft