l'évolution de la tumeur métastatique et organoide modélisation implicite TGFBR2as un pilote sur le cancer dans le cancer gastrique diffus

l'évolution de la tumeur métastatique et la modélisation organoide impliquent TGFBR2
comme chauffeur de cancer dans le cancer gastrique diffus
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est la deuxième cause principale de décès dans le monde du cancer, avec une maladie métastatique représentant la principale cause de mortalité. Pour identifier les candidats conducteurs impliqués dans l'oncogenèse et de l'évolution de la tumeur, nous procédons à une analyse approfondie de séquençage du génome de la progression métastatique dans un cancer gastrique diffus. Cela implique une comparaison entre une tumeur primaire à partir d'un héréditaire diffus gastrique proband syndrome du cancer et sa récurrence comme une métastase ovarienne
. Résultats
Tant la tumeur primaire et les métastases de l'ovaire ont une perte de fonction biallélique commune tant du CDH1
et les suppresseurs de tumeur de TP53, indiquant une origine génétique commune. Tandis que l'exposition de la tumeur primaire amplification du récepteur du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGFR2
) gène, en particulier la métastase n'a pas FGFR2
amplification mais possède plutôt des modifications uniques de bialléliques La transformation du récepteur du facteur de croissance bêta 2 (TGFBR2
) , indiquant la divergence in vivo
évolution de -mutant population clonale métastatique d'un TGFBR2 chez ce patient. Comme TGFBR2 de les mutations ont pas déjà été fonctionnellement validée dans le cancer gastrique, nous avons modélisé le potentiel métastatique de la perte TGFBR2 dans une culture primaire tridimensionnelle murin gastrique organoide. Le TGFBR2
shRNA knockdown au sein de Cdh1
- /-
; Tp53
- /-.
Organites génère l'invasion in vitro
et robuste tumorigénicité métastatique in vivo
, confirmant l'activité métastase suppresseur de TGFBR2 de Conclusions
Nous documentons la la différenciation métastatique et de l'hétérogénéité génétique du cancer gastrique diffus et de révéler le rôle potentiel métastatique de TGFBR2
perte de fonction. À l'appui de cette étude, nous appliquons une méthode organoide primaire murin de culture capable de récapituler le cancer gastrique métastatique vivo
à. Dans l'ensemble, nous décrivons une approche intégrée pour identifier et fonctionnellement valider les pilotes de cancer putatifs impliqués dans les métastases. Dans le monde entier, adénocarcinome gastrique
fond est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes. Basé sur des caractéristiques histopathologiques distinctifs, adénocarcinome gastrique est classé en sous-types diffus et intestinaux [1]. En termes de histopathologie, les cancers gastriques diffuses sont généralement indifférenciées, ont souvent des caractéristiques d'anneau cellulaire chevalière et effractive infiltrer les tissus de l'estomac normal. En revanche, le sous-type intestinal présente des caractéristiques épithéliales et forme des masses discrètes de tumeurs semblables à un cancer du côlon. Diffuse cancer gastrique a une incidence plus élevée de la maladie métastatique et un pronostic généralement pire par rapport au sous-type intestinal [2], [3]. Actuellement, les analyses génomiques de cancer gastrique diffus ont impliqué un petit nombre d'échantillons, y compris une étude récente par le Projet Atlas du génome du cancer (TCGA) et toute une enquête de séquençage du génome d'un ensemble de tumeurs gastriques diffuses [4]. Cependant, il y a peu, le cas échéant, des études qui détaillent l'évolution métastatique du cancer gastrique; les tumeurs métastatiques sont généralement absentes des enquêtes de cancer génomiques à grande échelle tels que TCGA. Dans l'ensemble, on sait peu sur le processus et la tumeur évolution oncogène du cancer gastrique métastatique, malgré son importance clinique primordiale [5].
Dans héréditaire cancer gastrique diffus (de HDGC), des mutations germinales dans CDH1
(qui est, E- cadhérine) confère un risque à vie de 70% de développer un cancer gastrique diffus [6], [7]. Le gène suppresseur de tumeur du CDH1 code pour la E-cadhérine, une glycoprotéine transmembranaire qui médie l'adhésion cellulaire de cellules dépendant du calcium. Changements dans la fonction CDH1 affectent la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) qui a été impliqué comme jouant un rôle dans la tumorigenèse. Les études sur les tumeurs des individus HDGC touchés de fournir une occasion unique de déterminer les facteurs essentiels de cancer gastrique diffus dans le contexte de CDH1 de la perte de la fonction. Preuves à l'appui du rôle de CDH1
dans les cancers gastriques diffus sporadiques comprend l'observation que 50% contiennent des mutations ou hyperméthylation du promoteur de la CDH1 CDH1 de [8], [9]. Une enquête de séquençage du génome entier récent de cancer gastrique diffus a également identifié des mutations CDH1
fréquentes comme événement pilote le plus commun [4]. Les données sur le cancer gastrique TCGA montrent également une fréquence élevée de CDH1
mutations somatiques [10]. Significativement moins d'informations sur l'identité et le rôle des conducteurs concomitants qui contribuent à diffuser la métastase gastrique.
Ici, nous rapportons une étude du processus d'évolution métastatique dans le cancer gastrique diffus. Notre objectif était d'identifier les conducteurs connus et candidats qui délimitent la progression de la tumeur lors de la métastase. Nous avons effectué une analyse approfondie de séquençage du génome d'une tumeur gastrique primaire et les métastases d'un individu à la mutation d'un CDH1 germinale (figure 1) qui a présenté avec un primaire gastrique, suivi après 3 ans par des métastases dans l'ovaire gauche. Compte tenu de la mutation germinale existante dans CDH1,
le génome du cancer nécessite seulement un second allélique frappé par une aberration génétique somatique, comme cela est démontré dans la tumeur de cet individu. Parce que l'événement initial du pilote sur le cancer est connu, le génome du cancer mendélienne fournissent une `expérience rare et très instructif de la nature» qui offre l'occasion de délimiter la génétique somatique des métastases. analyse de séquençage du génome des deux tumeurs a révélé la preuve d'une origine commune basée sur des mutations partagées, mais une plus grande diversité génomique considérée à la fois au niveau des mutations ainsi qu'une vaste déséquilibre allélique et le nombre de copies aberrations du metatasis. Figure 1 Famille et de l'histoire clinique d'un cancer gastrique diffus mendélienne. Le pedigree du patient de l'indice 525 (III-1) est représenté. types de tumeur sont indiqués par la couleur verte, y compris le cancer du pancréas, le rouge pour le cancer gastrique diffus et jaune pour le cancer du sein. Le patient a présenté avec son cancer gastrique primaire à l'âge de 37 ans. Trois ans plus tard, elle a présenté avec une gêne abdominale. tomodensitométrie contraste amélioré du bassin identifié une masse ovaire gauche (cercle jaune) qui a été confirmé à la biopsie d'être une métastase de cancer gastrique diffus (qui est, Krukenberg tumeur). Au cours de l'évolution de la tumeur métastatique, un certain nombre d'événements connus et cancer du candidat conducteur délimité l'évolution de la tumeur et la divergence génétique de la métastase de la tumeur primaire.
Nous avons déterminé si les pilotes candidats de cette progression métastatique étaient suffisantes pour reproduire diffuse cancer de l'estomac. Notre méthodologie de modélisation du cancer utilisé in vitro
organites gastriques et permet à l'ingénieur le contexte du pilote génétique de ces cancers et d'étudier le processus d'évolution métastatique et oncogénique divergence de la voie. L'intégration de l'analyse génétique et la modélisation biologique, nous avons déterminé le rôle indépendant du TGFBR2
(transformation du récepteur du facteur-β croissance 2) dans le oncogenèse du cancer gastrique diffus. Notre modélisation expérimentale sur le cancer repose sur une interface air-liquide pour la culture de l'intestin de souris primaire qui contient à la fois des éléments épithéliales et mésenchymateuses, récapitule précisément la prolifération à long terme, la différenciation multilignée, le /niche de cellules souches Notch dépendant Wnt, et le péristaltisme [11]. Nous avons rapporté un système gastrique primaire analogue organoide de culture qui récapitule précisément la différenciation épithéliale multilignée et éléments stromales [12]. Récemment, nous avons obtenu robuste vitro
transformation oncogénique dans des gastrique primaire, du côlon et du pancréas organites via des mutations dans Kras
et Trp53
, qui induisent une dysplasie de haut grade et l'invasion in vitro
avec adénocarcinome sur la transplantation sous-cutanée chez la souris [13]. Résultats de nous démontrons la validation fonctionnelle des conducteurs candidat gastrique de métastases du cancer provenant d'études cancer de profilage génomique, en mettant l'accent sur la modélisation du conducteur du TGFBR2 comme preuve de principe.
cancer gastrique diffus et métastatique progression
À l'âge de 37 ans, le patient d'index (525) a été diagnostiqué avec le stade III (T3N1M0) adénocarcinome gastrique diffus peu différencié (figure 1). Son 42-year-old soeur a été diagnostiqué avec adénocarcinome gastrique diffus 2 mois plus tôt. Basé sur l'histoire familiale de cancer gastrique et exceptionnellement jeune âge d'apparition, elle a subi les tests de mutation germinale CDH1 de. Le patient et sa sœur se sont révélés avoir une mutation germinale de site d'épissage dans l'intron 10 (c.1565 + 2insT). Cette mutation germinale a ensuite été rapporté dans une autre famille avec le cancer héréditaire diffus gastrique (HDGC) [14]. Le patient a subi une gastrectomie totale pour enlever sa tumeur primaire et a été trouvé pour avoir une seule métastase ganglionnaire. Elle a reçu un traitement adjuvant standard, y compris la chimiothérapie combinée (cisplatine et 5-fluorouracile) et le rayonnement. Trois ans après sa présentation initiale, le patient a rapporté progressive plénitude abdominale inférieure. Une tomodensitométrie (TDM) a démontré une grande masse pelvienne compatible avec une métastase ovarienne gauche (Figure 1). Par la suite, le patient a subi une laparotomie avec salpingo-ovariectomie et une biopsie de la masse pelvienne bilatérale. Des études ont démontré adénocarcinome métastatique pathologiques impliquant l'ovaire, autrement appelé une tumeur Krukenberg, avec la même apparence histologique que la tumeur primaire. Une étude a rapporté que, parmi le cancer gastrique diffus avec la dissémination métastatique, l'ovaire est un site métastatique dans 28,8% des cas [15]. Ainsi, l'ovaire est un site commun pour la maladie métastatique.
Analyse de séquençage du génome du cancer
deux exome et l'ensemble de séquençage du génome apparié-end ont été réalisées sur la tumeur primaire, les métastases de l'ovaire, et le tissu normal qui comprenait le sang et gastrique normale tissus (fichiers supplémentaires 1: Tableau S1). Tissu de la métastase des ganglions lymphatiques était pas disponible pour l'analyse. Plusieurs méthodes de séquençage ont été utilisées pour compenser le degré de mélange de stroma normal, un résultat direct de l'invasivité infiltrant du sous-type de cancer de l'estomac diffus. Nous avons déterminé l'étendue du mélange génome normal et corrigé pour l'inclusion de l'ADN normal (fichier supplémentaire 1: Méthodes). Compte tenu de la complexité des échantillons de tumeur, nous avons mené une série supplémentaire de séquençage ciblé pour confirmer la présence de mutations et d'autres aberrations génétiques qui se sont produits dans les exons, les limites des exons près ou promoteurs.
Dans l'ensemble, nous avons obtenu plus de 100 × couverture moyenne pour chaque exome et généralement fondée sur des données de exome pour la découverte de codage des mutations de la région. Pour le séquençage du génome entier, nous avons eu plus de 60 × couverture moyenne pour le cancer primaire échantillon de génome et 30 × pour le génome métastatique. Le séquençage du génome entier a été utilisé pour identifier les grandes aberrations génétiques à grande échelle tels que le nombre de copies variation (CNV), les déséquilibres alléliques, réarrangements, et d'autres classes de réarrangements structuraux. Après l'alignement, nous avons effectué la variante appelant à identifier des mutations somatiques et d'autres classes d'aberrations génétiques. Cela comprenait des mutations somatiques, insertion-délétions (indels), CNV, régions de perte d'hétérozygotie (LOH) et réarrangements du cancer (fichier supplémentaires 1: Tableau S3 et S4) Tableau. En tant que témoin pour seul nucléotide variante appel, nous génotypage des échantillons avec Affymetrix 6.0 single nucleotide polymorphism (SNP) des tableaux; nous avons comparé les génotypes aux SNPS identifiés à partir des données de séquence. La concordance des Exome et SNP du génome entier des données vers les données du tableau était de 99%.
Codage mutations de la région et la validation avec le séquençage profond
Nous avons identifié des mutations qui se sont produites dans les exons et les mutations introniques à moins de 100 bases de la limite exon et les résultats sont résumés dans le fichier supplémentaires 1: Tableau S2. Comme indiqué précédemment, les échantillons tumoraux ont la composition complexe qui réduit la portée de la séquence de certaines mutations. Nous avons procédé à une série supplémentaire de séquençage ciblé pour valider ces mutations et de déterminer leur présence dans les deux tumeurs. Nous avons conçu un essai pour reséquençage profonde qui couvrait environ 300 bases dans le locus de mutation spécifique (fichier supplémentaires 1: Tableau S5). La couverture moyenne de séquençage ciblé pour chaque mutation putative ou loci était de 278 × pour de la normale, 251 × pour la tumeur primaire et 152 × pour la métastase.
Entre les deux tumeurs, nous avons validé indépendamment un total de 77 mutations qui se sont produites au sein de ou à proximité de exons (fichier supplémentaire 1: Méthodes et Tableau S5). aberrations génétiques validées comprenaient: (1) des mutations non synonymes, (2) des mutations synonymes, (3) des insertions, ou (4) des suppressions. Avec les données de séquençage ciblé, nous avons déterminé la fréquence de mutation allélique (CRG) entre la tumeur primaire et les métastases pour chaque mutation. Ceci implique la détermination de la fraction d'une séquence de lecture avec une mutation par rapport à la séquence de référence se lit comme suit. Nous avons pu identifier les mutations étaient communs ou exclusif de la tumeur primaire par rapport à la métastase. Parmi les 77 mutations validées, la distribution était telle que les mutations étaient généralement unique soit à la tumeur primaire ou d'un site métastatique. Par exemple, la tumeur primaire a eu huit mutations qui ne sont pas présents dans la métastase tandis que la métastase avait 37 mutations non présentes dans la tumeur primaire. Commun aux deux cancers étaient 32 mutations.
Compte tenu de l'intervalle de trois ans avant la détection de la métastase, il y a une possibilité que les mutations spécifiques métastases se sont produites indépendamment de la tumeur primaire. Des mutations spécifiques à la tumeur primaire qui ne sont pas présents dans la métastase ovarienne peut avoir été le résultat de la dérive génétique aléatoire. Les mutations communes aux deux indiquent une origine commune mais le moment exact de la différenciation entre les deux tumeurs est moins claire comme indiqué par ces mutations avec CRG inférieure. Un sous-ensemble de ces gènes a eu MAF des valeurs élevées, ce qui indique une plus grande probabilité d'être présent dans toutes les populations clonales dans la tumeur primaire ou de métastases. Comme nous l'expliquons plus tard, ces gènes ont été priorisées pour d'autres essais expérimentaux en organites gastriques.
Mutations affectant la fonction du gène
Parmi les mutations qui ont été validées à l'extérieur, nous nous sommes concentrés sur le sous-ensemble de mutations conduisant à des substitutions d'acides aminés, arrêt prématuré codons et indels qui ont modifié le cadre de lecture ouvert. Par la suite, nous avons déterminé si ces mutations codantes sont potentiellement nuisibles pour la fonction du gène en utilisant un certain nombre d'algorithmes de prédiction tel que Polyphen [16] et SIFT [17], entre autres. D'après les renseignements du CRG pour chaque mutation, nous avons déterminé si ces mutations avec un éventuel effet délétère sur les produits de gènes sont communs ou exclusif de la tumeur primaire et les métastases (Figure 2). La Figure 2: Comparaison des aberrations génétiques dans la tumeur primaire et les métastases. Common contre
aberrations génétiques exclusifs sont comparés entre les deux génomes tumoraux. (A) Les gènes présentant des mutations de codage ayant un impact néfaste potentiel sont répertoriés. Ces gènes sont classés selon qu'ils sont (caractères rouges) exclusifs ou (caractères verts) communs à la tumeur primaire et les métastases. Toutes les mutations conduisent à des changements dans la composition des acides aminés du produit du gène et ont été identifiés pour avoir une altération significative avec une probabilité élevée d'affecter la fonction du produit génique. (B) Un résumé des aberrations chromosomiques est montré à travers le génome du cancer ensemble des deux tumeurs. Cela inclut le nombre de copies variation (CNV) ou de la perte d'hétérozygotie (LOH). Les blocs rouges indiquent des événements exclusifs à la tumeur primaire ou métastatique. Les blocs verts indiquent des événements communs aux deux. Le nombre d'événements par chromosome est listé dans chaque bloc. Les flèches indiquent des événements ou des suppressions qui englobent le bras p, bras q, ou chromosome entier LOH. Les flèches rouges indiquent des aberrations chromosomiques qui sont des flèches exclusives et vertes indiquent des événements qui sont communs.
Sur le sous-ensemble de mutations délétères, nous avons effectué une analyse supplémentaire biologique de la voie, revue de la littérature et la comparaison avec les données Cancer Genome Atlas disponibles pour le cancer gastrique diffus. Cela a identifié un ensemble de gènes du cancer connus et les candidats liés au cancer probables avec des mutations qui ont eu probablement un impact sur la fonction des protéines. Nous nous sommes concentrés sur un certain nombre de gènes du pilote candidat (tableau 1) qui avait été précédemment démontré que les suppresseurs de tumeurs ou potentiels ont été connus oncogènes avec des changements bialléliques présents dans les cancers genomes.Table 1 oncogènes Cancer avec amplifications ou des pilotes de cancer avec un événement bialléliques
origine
connue ou pilote de cancer du candidat
événement bialléliques
allélique altération Mutation 1
ou aberration génomique
Chr
Position
Chr ou
intervalle
allélique modification 2
unique au
primaire FGFR2 *
amplification
6 fois amplification
10
117820033 à 119748751
commune à la tumeur primaire et les métastases
CDH1
Oui
délétion
suppression partielle de l'exon 9
16
68.847.326 à 68.847.403
mutation germinale dans CDH1
TP53
Oui
5 'épissage site de mutation
épissage Aberrant
17
7578370
perte Hémizygote du bras 17p
unique à la métastase
TGFBR2
Oui
Frameshift indel
codon d'arrêt dans l'exon 4 3
30691871
suppression Hémizygote de type sauvage TGFBR2
locus
PCDH7
Oui

S87R faux-sens 4
30723305
suppression Hémizygote de type sauvage 4 bras
loci de
FERMT1 Oui
perte d'hétérozygotie
FERMT
1 situé dans 20
FERMT de 20p12.3
1 mutation
BMP7
loci
Oui
Perte de hétérozygotie
BMP7
situé dans 20
BMP7 de 20q13.3 Chr
mutation:. du nombre de copies des variations de chromosome et les déséquilibres alléliques distinguant la tumeur primaire de la métastase
Nous avons constaté une plus grande échelle des aberrations génomiques qui différencient le primaire à partir de la métastase (figures 2b et 3a). Cela comprenait nombre de copies changements et événements LOH. Unique à la tumeur primaire étaient deux amplifications génomiques sur les chromosomes 5 et 10, et deux inversions sur les chromosomes 15 et 16 (fichiers supplémentaires 1: Tableau S4). Le chromosome 10 l'amplification d'un intervalle couvert 1,66 Mb. Lors de l'examen des suppressions ou des déséquilibres alléliques, le seul événement majeur qui a été noté impliqué une perte du bras p du chromosome 17. La figure 3 divergence génétique des métastases de l'ovaire du cancer de l'estomac pour les conducteurs primaires candidats critiques. La position génomique de la mutation, copier variations du nombre (CNV) régions ou perte de l'hétérozygotie (LOH) intervalles sont présentés à partir des génomes du cancer. Pour les parcelles de chromosomes, l'axe Y désigne la position avec le chromosome respectif, sa longueur dans mégabases (MB) et la désignation idéogramme représentés à la gauche du profil du nombre de copies. mutations délétères sont présentés sous forme de flèches en boîte avec le symbole du gène. (A) Le génome large distribution des intervalles CNV et LOH spécifiques du cancer est le résumé dans tous les chromosomes de la tumeur primaire et les métastases. (B) sur le chromosome 3, les métastases ont présenté des événements uniques bialléliques impliquant une mutation délétère TGFBR2
et une délétion génomique affectant l'autre allele comme on le voit le plus clairement avec des intervalles LOH. Secondaire à des délétions génomiques, LOH est démontré comme un changement dans la valeur du rapport de fréquence allélique mineure de -1 et est en corrélation avec une délétion génomique. (C) Sur le chromosome 10, le gène de FGFR2 a été localisé dans une région d'amplification génomique vu que dans le primaire et non pas de métastases. L'amplification est notée dans un cercle rouge.
A la différence de la tumeur primaire, la tumeur métastatique ont présenté des événements de LOH nombreuses à l'échelle chromosomique et délétions affectant les 12 chromosomes différents, dont la plupart étaient propres à la tumeur métastatique (figure 2) . Cela comprenait plusieurs suppressions et copier les événements de LOH neutres qui sont détaillées dans le fichier supplémentaires 1: Tableau S3. Il y avait une amplification génomique cinq fois dans le chromosome 2, mais pas de gènes connus spécifiques existait dans l'intervalle concerné. Il n'y avait pas translocations inter-chromosomiques détectables soit dans la tumeur primaire ou génomes de métastases. D'autres réarrangements de cancer ont été identifiés, mais ne pointent vers des aberrations dans tous les gènes du pilote candidat (fichier supplémentaires 1: Tableau S4). Il y avait des indications de grande instabilité génomique à grande échelle basée sur l'analyse de déséquilibre allélique; les chromosomes 14, 17, 20, et 22 toutes les parties concernées l'ensemble du chromosome.
Pour copie aberrations numériques et les déséquilibres alléliques, nous avons identifié exclusive par rapport à des événements communs entre la tumeur primaire et les métastases. La seule aberration génétique commune implique le bras p du chromosome 17. Dans l'ensemble, l'absence de chevauchement était indicative de divergence génétique significative de la tumeur primaire et les métastases en dépit d'une origine commune comme notée par des mutations communes dans les suppresseurs de tumeurs critiques.
La génomique intervalles de Loh, le nombre de copies d'aberration et des événements de réarrangement ont été comparés avec la position des mutations du gène validées. Cette analyse intégrée a un certain nombre de gènes qui ont des altérations bialléliques impliquant à la fois une perte de l'allèle de type sauvage d'une grande aberration génomique intervalle et un allèle mutant. Les résultats pour les gènes avec succès bialléliques ont été considérés comme de bons candidats pour une participation de perte de fonction dans le cancer (tableau 1).
Identification des conducteurs de cancer commun à la tumeur primaire et les métastases
Tant le primaire et le métastase contenait des événements du pilote de cancer qui étaient susceptibles d'être critique pour la tumorigenèse dans le contexte de la mutation de la première CDH1 (tableau 1, figure 2). En plus de la mutation de la lignée germinale intronique CDH1, l'allèle du deuxième CDH1 avait un 77 bp deletion génomique somatique d'une partie de l'exon 9 qui affecte les régions codantes en aval. La CDH1 de mutation somatique était identique dans les deux génomes de cancer gastrique primaires et métastatiques, ce qui démontre une origine génétique commune et de fournir des preuves génétiques forte que ce conducteur avait un rôle crucial dans la tumorigenèse gastrique diffus. Les mutations affectant CDH1 de l'exon 9 qui conduisent à la perte d'expression de la protéine ont été fréquemment détecté dans le cancer gastrique diffus [18] - [20]. La séquence d'acides aminés de ce exon est un site de fixation du calcium putatif qui est susceptible important pour la fonction du récepteur
La tumeur primaire et métastatique épissage biallélique site donneur mutation a également partagé. (de c.559 + 1G > A) de la cinquième intron TP53
et un événement de LOH chromosome 17p englobant locus du TP53 (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Le TP53
mutation d'épissage interrompt épissage de l'ARN [21] et est une mutation précédemment sur le cancer [22], [23]. Les analyses des cancers gastriques sporadiques et héréditaires ont identifié TP53 de les mutations qui se produisent en même temps CDH1 de la mutation [24], [25]. CDH1 de l'inactivation dans les cellules pariétales gastriques ne provoque pas de cancer de l'estomac, ce qui suggère que la perte de CDH1
est insuffisante pour l'initiation des tumeurs [26]. Cependant, double knock-out conditionnel de CDH1
et TP53
induit le développement du carcinome gastrique diffus [26]. Fait intéressant, l'intervalle génomique de l'événement affectant la LOH TP53
locus était plus grande dans les métastases par rapport à la tumeur primaire. Cela aurait pu se produire en raison d'événements d'instabilité génomique indépendants compte tenu de la forte sélection pour la perte de la fonction biallélique TP53.
FGFRis un pilote de cancer action exclusif à la
de tumeur gastrique primaire Dans la tumeur primaire, il y avait une génomique six fois l'amplification d'une région du chromosome 10 bras q et recouvert d'un intervalle de 1,66 Mb. Au sein de cette région génomique est un oncogène FGFR2 du candidat conducteur
également appelé le facteur de croissance fibroblastique récepteur 2 (figure 3c). Cela a été confirmé par plusieurs méthodes, y compris le séquençage, l'analyse de réseau, et la validation par PCR quantitative. FGFR2 est un récepteur transmembranaire qui agit dans le cadre d'une voie clé de transduction du signal de régulation la réparation des tissus et le développement embryonnaire parmi une foule d'autres fonctions [26].
Pour valider la prévalence de FGFR2 de l'amplification diffuse contre les cancers gastriques intestinaux , nous avons analysé 37 diffus et 27 échantillons de tumeurs du sous-type intestinal primaire gastrique avec PCR numérique [27]. Précédemment, nous avons montré que cette méthode est profondément sensible pour la détection du nombre de copies d'aberration même dans le contexte de l'ADN de la tumeur de dilution d'ADN diploïde normale. Notre étude a démontré FGFR2 de l'amplification dans quatre des 37 (11%) des échantillons de tumeurs diffuses, qui était absente dans les échantillons de sous-type intestinal (figure 4a). Figure 4 Prévalence de FGFR2 dans les tumeurs gastriques humaines et sa contribution à la prolifération cellulaire. (A) des échantillons de cancer gastrique sporadiques ont été évalués par PCR quantitative numérique pour déterminer FGFR2 nombre de copies génomique. Les points noirs représentent les cancers gastriques diffus. Les points rouges indiquent le sous-type intestinal du cancer gastrique. (B) Les caractéristiques génétiques de l'AGS (FGFR2 de la diploïdes) et KatoIII (FGFR2 amplifié) des lignées cellulaires de cancer gastrique sont présentés. (C) Le pourcentage de survie de la lignée cellulaire de cancer de l'AGS est représenté avec des inhibiteurs FGFR2 de spécificité variable. (D) Le KatoIII diffuse lignée cellulaire de cancer de l'estomac a été traité avec des inhibiteurs FGFR2 de spécificité variable. L'axe des Y représente pour cent par rapport à la survie
l'axe X avec des concentrations de journal. Dans tous les panneaux, les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. La différence dans la survie cellulaire pour cent entre les cellules KatoIII et AGS était statistiquement significative (P
< 0,05). Les trois concentrations les plus élevées de tous les médicaments, à l'exception brivanib qui était seulement significatif à la plus forte concentration
l'appui de sa rôle en tant que candidat conducteur, FGFR2 de l'amplification est présente dans un certain nombre de lignées cellulaires de cancer gastrique [28], [29] et par la suite rapportées dans diverses tumeurs malignes gastro-intestinales telles que les adénocarcinomes œsophagiens [30]. En outre, le traitement des lignées de cellules cancéreuses avec des inhibiteurs de petites molécules spécifiques à FGFR2 ou shRNA conduit à une inhibition de croissance puissant [28], ce qui suggère un rôle fonctionnel pour FGFR2 de l'amplification du sous-type diffus. Analyse
fonctionnelle du conducteur FGFR2 dans combinaison avec CDH1 et TP53
Nous avons identifié deux exemples d'un cancer gastrique diffus primaire avec co-occurrence des conducteurs connus et putatifs cancer impliquant CDH1
, TP53
et FGFR2
comme on le voit dans le patient index . Le premier exemple comprenait un échantillon de cancer gastrique diffus qui a été parmi les adénocarcinomes gastriques analysés par TCGA. Utilisation du portail CBio TCGA [10], nous avons identifié un patient (TCGA-BR-6803) qui avait un effectif semblable des aberrations génétiques dans CDH1
, TP53
et FGFR2
, qui ont tous été décrit précédemment dans le cancer comme on le voit dans la Cosmique dépôt de la mutation du cancer. Cela comprenait les éléments suivants: une mutation faux-sens (la D254Y) de CDH1 qui a été décrite dans trois autres cancers; une mutation faux-sens (L130F) en TP53
où des mutations dans ce codon ont été signalés dans 37 autres cancers; L'amplification de la FGFR2 que nous et d'autres ont identifié dans le cancer gastrique diffus.
Comme le deuxième exemple, nous avons identifié un humain diffuse lignée cellulaire de cancer gastrique, KatoIII, qui a une composition similaire d'aberrations génétiques affectant les mêmes gènes du cancer que la tumeur primitive de notre patient index. KatoIII présente la mutation de la CDH1 conduisant à une insertion de la séquence intronique dans l'ARNm [31], [32], un TP53
mutation conduisant à une suppression complète du gène [33] et l'amplification du FGFR2 [29] (figure 4b). Cette lignée cellulaire nous a permis d'évaluer le rôle oncogène potentiel de l'amplification du FGFR2 dans le contexte génétique spécifique de CDH1
et TP53 de les mutations, semblable à la tumeur primitive du patient index. Comment faire pour déterminer la contribution des FGFR de signalisation à la croissance néoplasique, nous avons traité des cellules KatoIII avec plusieurs inhibiteurs FGFR2 petites molécules de tyrosine-kinase (ITK), y compris brivanib, TKI258, Ponatinib et AZD4547 [34]. En tant que témoin, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS qui est de type sauvage pour FGFR2
, CDH1
et TP53
, mais a des mutations dans KRAS
et PIK3CA
[35] ( La figure 4b). Tous les inhibiteurs de FGFR2 la mort cellulaire induites dans KatoIII mais pas les cellules AGS (figure 4C et D). Le plus puissant de ces EGFR, AZD4547, a une CI 50 d'environ 2 nM dans les cellules et KatoIII 39580 nM dans les cellules AGS (figure 4C et D). Chacun des inhibiteurs ont montré une CI significativement plus faible 50 dans des cellules KatoIII FGFR2 amplifié par rapport aux cellules AGS FGFR2 non-amplifiés à toutes les concentrations testées (figure 4C et D).
En revanche, le traitement des KatoIII et les cellules AGS avec des agents chimiothérapeutiques cytotoxiques tels que le paclitaxel, le 5-fluorouracile et le carboplatine n'ont un effet significatif sur KatoIII ou lignes AGS, avec IC similaires 50 identifiés dans chaque (fichier supplémentaire 1: Tableau S7). Pour AZD4547, la différence de 20.000 fois dans la sensibilité aux inhibiteurs de FGFR suggère que la signalisation FGF est un moteur essentiel à la prolifération cellulaire gastrique -initiated de CDH1 et ce TKI représente une thérapie potentielle ciblée dans les cancers du sous-type diffus hébergeant FGFR2
amplifications.
bialléliques inactivation du TGFBRis exclusif de la métastase ovarienne
divergence génétique était évidente; la métastase nourrissait son propre sous-ensemble unique de mutations et aberrations génomiques.

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