la evolución del tumor metastásico y el modelado implicado organoid TGFBR2as un conductor de cáncer en el cáncer gástrico difuso

la evolución del tumor metastásico y modelado organoid implican TGFBR2
como conductor de cáncer en el cáncer gástrico difuso
Resumen Antecedentes

El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muertes por cáncer a nivel mundial, con enfermedad metastásica que representa la primera causa de la mortalidad. Para identificar a los conductores candidatos involucrados en la oncogénesis y la evolución del tumor, llevamos a cabo un extenso análisis de la secuenciación del genoma de la progresión metastásica en un cáncer gástrico difuso. Esto implica una comparación entre un tumor primario de una hereditario difuso gástrico probando síndrome de cáncer y su recurrencia como una metástasis de ovario.
Resultados
tanto del tumor primario y la metástasis de ovario tienen pérdida de función bialélico común tanto de la CDH1 Opiniones y TP53
supresores de tumores, lo que indica un origen genético común. Mientras que la exposiciones tumorales primaria amplificación del gen del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2
), la metástasis carece notablemente FGFR2
amplificación sino más bien posee alteraciones bialélicos únicas de transformación de receptor del factor de crecimiento beta 2 (TGFBR2
) , indicando la in vivo
evolución divergente de -mutant un TGFBR2
población clonal metastásico en este paciente. Como TGFBR2
mutaciones no han sido previamente validado funcionalmente en el cáncer gástrico, modelamos el potencial metastásico de pérdida TGFBR2 en una cultura primaria organoid gástrico murino tridimensional. El Tgfbr2
shRNA desmontables dentro Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoides genera la invasión in vitro
y robusto tumorigenicidad metastásico in vivo
, confirmando Tgfbr2
actividad supresora de la metástasis
Conclusiones
Documentamos la la diferenciación metastásico y la heterogeneidad genética de cáncer gástrico difuso y revelar el papel potencial metastásico de TGFBR2
pérdida de función. En apoyo de este estudio, aplicamos un método de cultivo organoid primaria murino capaz de recapitular en el cáncer gástrico metastásico vivo
. En general, se describe un enfoque integrado para identificar y validar funcionalmente conductores cáncer supuestos implicados en la metástasis.
Antecedentes
A nivel mundial, el adenocarcinoma gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres y las mujeres. Sobre la base de las características histopatológicas distintivas, adenocarcinoma gástrico se clasifica en subtipos difusos e intestinales [1]. En términos de histopatología, cánceres gástricos difusos son por lo general no diferenciado, con frecuencia tienen características del anillo de sello y celular invasiva infiltrado en el tejido normal del estómago. En contraste, el subtipo intestinal tiene características epiteliales y forma masas tumorales discretas similares con el cáncer de colon. Diffuse cáncer gástrico tiene una mayor incidencia de enfermedad metastásica y un peor pronóstico en general en comparación con el subtipo intestinal [2], [3]. Actualmente, los análisis genómicos de cáncer gástrico difuso han implicado un pequeño número de muestras que incluye un estudio reciente realizado por el Proyecto Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y toda una encuesta de la secuenciación del genoma de un conjunto de tumores gástricos difusos [4]. Sin embargo, hay pocos, si alguno, los estudios que detallan la evolución metastásica del cáncer gástrico; tumores metastásicos son generalmente ausentes de las encuestas de cáncer genómicos a gran escala, tales como TCGA. En general, se sabe poco sobre el proceso y la evolución del tumor oncogénico de cáncer gástrico metastásico a pesar de su importancia clínica de suma importancia [5]. Hoteles en cáncer gástrico difuso hereditario (CGDH), las mutaciones en la línea germinal CDH1 gratis (es decir, E- cadherina) confieren un riesgo de por vida 70% de desarrollar cáncer gástrico difuso [6], [7]. El CDH1
gen supresor de tumor codifica E-cadherina, una glicoproteína transmembrana que media la adhesión célula-célula dependiente de calcio. Cambios en la función CDH1 afectan a la transición epitelial-mesenquimal (EMT) que ha sido implicado como jugando un papel en la tumorigénesis. Los estudios de tumores individuos afectados CGDH 'proporcionan una oportunidad única para determinar los controladores esenciales de cáncer gástrico difuso en el contexto de CDH1
pérdida de la función. La evidencia que apoya el papel de CDH1
en los cánceres gástricos difusos esporádicos incluye la observación de que el 50% contienen CDH1
mutaciones o hipermetilación del promotor CDH1
[8], [9]. Toda una encuesta reciente secuenciación del genoma de cáncer gástrico difuso también identificó frecuentes mutaciones CDH1
como el evento conductor más común [4]. Los datos sobre el cáncer gástrico TCGA también muestran una alta frecuencia de CDH1
mutaciones somáticas [10]. se sabe acerca de la identidad y el papel de los conductores concurrentes que contribuyen a difundir la metástasis gástrica significativamente menor.
Aquí, se presenta un estudio del proceso evolutivo metástasis en el cáncer gástrico difuso. Nuestro objetivo era identificar a los conductores conocidos y candidatos que delinean la progresión tumoral durante la metástasis. Se realizó un extenso análisis de secuenciación del genoma de un tumor gástrico primario y la metástasis de un individuo con una mutación CDH1 línea germinal
(Figura 1) que se presentó con un primario gástrico, seguido después de 3 años de la metástasis en el ovario izquierdo. Dada la mutación germinal existente en CDH1, Francia El genoma del cáncer sólo se requiere una segunda alélica golpear a través de una aberración genética somática, como se demuestra en el tumor de este individuo. Debido a que el evento inicial conductor del cáncer se conoce, los genomas del cáncer mendelianos proporcionan un `experimento raro y altamente informativo de la naturaleza" que proporciona una oportunidad para delinear la genética somáticas de la metástasis. análisis de secuenciación del genoma de los tumores reveló evidencia de un origen común sobre la base de las mutaciones compartidas pero mayor diversidad genómica visto tanto a nivel de mutaciones, así como una amplia alélica desequilibrio y copia aberraciones numéricas para la metatasis. Figura 1 Familia y la historia clínica de un cáncer gástrico difuso mendeliana. El árbol genealógico de la paciente índice 525 (III-1) se representa. Los tipos de tumores son indicados por el color verde incluyendo el cáncer de páncreas, rojo para el cáncer gástrico difuso, y amarillo para el cáncer de mama. El paciente presentó con su cáncer gástrico primario a la edad de 37 años. Tres años más tarde se presentó con un malestar abdominal. TC con contraste de la pelvis identificado una masa ovario izquierdo (círculo amarillo) que se confirmó en la biopsia a ser un difuso metástasis del cáncer gástrico (es decir, tumores de Krukenberg). Durante el curso de la evolución del tumor metastásico, una serie de eventos de controlador conocidas y cáncer candidato delineó la evolución del tumor y la divergencia genética de la metástasis del tumor primario.
Se determinó si los controladores de candidatos de esta progresión metastásica fueron suficientes para reproducir difusa cáncer gástrico. Nuestra metodología de modelado cáncer utilizado in vitro
organoides gástricas y permite al ingeniero el contexto conductor genética de estos tipos de cáncer y estudiar el proceso de la evolución metastásica y divergencia vía oncogénica. Integración de análisis genético y el modelado biológico, se determinó el papel independiente de TGFBR2
(transformación del factor de crecimiento-β receptor 2) en la oncogénesis de cáncer gástrico difuso. Nuestro modelo experimental de cáncer se basa en una interfaz aire-líquido para el cultivo intestinal del ratón primario que contiene ambos elementos epiteliales y mesenquimales, recapitula con precisión la proliferación a largo plazo, la diferenciación multilinaje, el /nicho de células madre Notch dependientes de Wnt, y el peristaltismo [11]. Reportamos un sistema gástrico primario análoga organoid cultura que recapitula con precisión la diferenciación del epitelio multilinaje y los elementos del estroma [12]. Recientemente, hemos logrado robusta in vitro
transformación oncogénica de gástrico primario, de colon, de páncreas y de organoides a través de mutaciones en Kras Opiniones y Trp53
, que inducen la displasia de alto grado y la invasión in vitro
con adenocarcinoma tras trasplante subcutáneo en ratones [13]. Se demuestra la validación funcional de los conductores candidato metástasis del cáncer gástrico de los estudios de genómica del cáncer de perfilado, se centra en el modelado de la TGFBR2
conductor como prueba de principio.
: Resultados de la difusa cáncer gástrico y la progresión metastásica
A la edad de 37 años, el índice de pacientes (525) fue diagnosticado con la etapa III (T3N1M0) pobremente diferenciado adenocarcinoma gástrico difuso (Figura 1). Su hermana de 42 años de edad fue diagnosticado con adenocarcinoma gástrico difuso 2 meses antes. Sobre la base de la historia familiar de cáncer gástrico y el inusualmente temprana edad de inicio, se sometió a la línea germinal CDH1
pruebas de mutación. El paciente y su hermana se encontró que tenían una mutación de línea germinal del sitio de empalme en el intrón 10 (c.1565 + 2insT). Esta mutación germinal se informó posteriormente en otra familia con cáncer gástrico difuso hereditario (CGDH) [14]. El paciente fue sometido a una gastrectomía total para eliminar el tumor primario y se encontró que tenía una sola metástasis de los ganglios linfáticos. Ella recibió tratamiento adyuvante estándar incluyendo la quimioterapia combinada (cisplatino y 5-fluorouracilo) y la radiación. Tres años después de su presentación inicial, el paciente informó de plenitud abdominal inferior progresiva. Una tomografía computarizada (TC) demostró una gran masa pélvica consistente con una metástasis ovárica izquierda (Figura 1). Posteriormente, el paciente fue sometido a laparotomía con salpingooforectomía y biopsia de la masa pélvica bilateral. Estudios patológicos demostraron adenocarcinoma metastásico implica el ovario, denominado también como un tumor de Krukenberg, con la misma apariencia histológica que el tumor primario. Un estudio informó que entre el cáncer gástrico difuso con diseminación metastásica, el ovario era un lugar de la metástasis en el 28,8% de los casos [15]. Por lo tanto, el ovario es un sitio común para la enfermedad metastásica.
Análisis de secuenciación del genoma del cáncer
Tanto exoma y la secuenciación del genoma de extremo emparejado entera se realizaron en el tumor primario, metástasis de ovario, y el tejido normal que incluía sangre y gástrica normal tejidos (archivo adicional 1: Tabla S1). El tejido de la metástasis de los ganglios linfáticos no estaba disponible para el análisis. Se emplearon métodos de secuenciación múltiples para compensar el grado de mezcla del estroma normal, una consecuencia directa de la invasividad infiltrante del subtipo de cáncer gástrico difuso. Se determinó el grado de mezcla normal de genoma y corregido para la inclusión del ADN normal (archivo adicional 1: Métodos). Dada la complejidad de las muestras de tumor, se realizó una nueva ronda de secuenciación específico para confirmar la presencia de mutaciones y otras aberraciones genéticas que se produjo en los exones, el exón fronteras cerca o promotores.
En general, hemos obtenido más de 100 × cobertura media para cada exoma y generalmente se basó en los datos exoma para el descubrimiento de codificación región mutaciones. Para la secuenciación de todo el genoma, hemos tenido más de un 60 × cobertura promedio para el cáncer de toda la muestra genoma primaria y 30 × para el genoma metastásico. La secuenciación del genoma completo se utilizó para identificar aberraciones genéticas de mayor escala como la variación del número de copias (CNV), desequilibrios alélicos, reordenamientos, y otras clases de reajustes estructurales. Después de la alineación, se realizó variante de llamadas para identificar mutaciones somáticas y otras clases de aberraciones genéticas. Esto incluyó mutaciones somáticas, inserción-deleciones (indeles), VNC, regiones de pérdida de heterocigosidad (LOH), y reordenamientos de cáncer (archivo adicional 1: Tabla S3 y S4 Tabla). Como control para un solo nucleótido variante llamada, genotipo las muestras con Affymetrix 6,0 polimorfismo de nucleótido único (SNP) arrays; se compararon los genotipos de los SNPs identificados a partir de los datos de la secuencia. La concordancia de los datos exoma y toda SNP del genoma a la matriz de datos fue del 99%.
Codificación región mutaciones y la validación de secuenciación profunda
Se identificaron mutaciones que se produjeron en los exones y mutaciones intrónicas dentro de 100 bases del exón frontera y la Los resultados se resumen en el archivo adicional 1: Tabla S2. Como se señaló anteriormente, las muestras tumorales tenían compleja composición que reduce la cobertura de secuencia de algunas mutaciones. Se procedió con una ronda adicional de secuenciación dirigida a validar estas mutaciones y determinar su presencia en ambos tumores. Hemos diseñado un ensayo para la resecuenciación dirigida profundo que cubría aproximadamente 300 bases en todo el loci mutación específica (archivo adicional 1: Cuadro S5). La cobertura de la secuencia específica promedio para cada mutación putativa o loci fue de 278 × para la normalidad, 251 × para el tumor primario y 152 × para la metástasis.
Entre los dos tumores, hemos validado de forma independiente un total de 77 mutaciones que ocurrieron dentro de o próximo a los exones (archivo adicional 1: Métodos y Tabla S5). aberraciones genéticas validados incluyen: (1) no es sinónimo mutaciones, (2) las mutaciones sinónimas, (3) inserciones, o (4) supresiones. Con los datos de secuenciación específica, se determinó la frecuencia de mutación alélica (MAF) entre el tumor primario y la metástasis para cada mutación. Esto implica la determinación de la fracción de secuencia de lectura con una mutación en comparación con la secuencia de referencia se lee. Hemos sido capaces de identificar qué mutaciones eran comunes o exclusiva al tumor primario frente a la metástasis. Entre las 77 mutaciones validadas, la distribución era tal que las mutaciones eran generalmente único, ya sea en el tumor primario o en el sitio metastásico. Por ejemplo, el tumor primario tenía ocho mutaciones que no estaban presentes en la metástasis, mientras que la metástasis tenía 37 mutaciones que no están presentes en el tumor primario. Común a ambos tipos de cáncer eran 32 mutaciones.
Dado el intervalo de tres años antes de la detección de la metástasis, existe la posibilidad de que las mutaciones-metástasis específica ocurrieron independientemente del tumor primario. Las mutaciones específicas del tumor primario que no estaban presentes en la metástasis de ovario pueden haber sido el resultado de deriva genética aleatoria. Las mutaciones comunes a ambos indican un origen común pero el momento exacto de la diferenciación entre los dos tumores es menos claro según lo observado por esas mutaciones con menor MAF. Un subconjunto de estos genes tenían valores altos de MAF, lo que indica una mayor probabilidad de estar presentes en todas las poblaciones clonales en el tumor primario o la metástasis. Como se describe más adelante, estos genes fueron priorizados para la prueba experimental más en organoides gástricos.
Las mutaciones que afectan a la función del gen Estar entre las mutaciones que fueron validados externamente, nos hemos centrado en el subconjunto de mutaciones que conducen a sustituciones de aminoácidos, de parada prematura codones y indeles que alteraron el marco de lectura abierta. Posteriormente, se determinó si estas mutaciones codifican eran potencialmente perjudicial para la función del gen utilizando una serie de algoritmos de predicción tales como Polyphen [16] y filtrar [17] entre otros. Basándose en la información MAF para cada mutación, se determinó si estas mutaciones con un posible impacto perjudicial sobre los productos de los genes eran comunes o exclusivo al tumor primario y la metástasis (Figura 2). Figura 2 Comparación de las aberraciones genéticas en el tumor primario y la metástasis. Común frente
aberraciones genéticas exclusivos son comparados entre los dos genomas tumorales. (A) se enumeran los genes con mutaciones de codificación tiene un potencial impacto nocivo. Estos genes se clasifican en función de si son exclusivas (caracteres rojos) o (caracteres verdes) comunes con el tumor primario y la metástasis. Las mutaciones conducen a cambios en la composición de aminoácidos del producto del gen y se han identificado a una alteración significativa con una alta probabilidad de afectar a la función del producto génico. (B) Un resumen de las aberraciones cromosómicas se muestra a través de todo el genoma del cáncer de ambos tumores. Esto incluye la variación del número de copias (CNV) o pérdida de heterocigosidad (LOH). Los bloques de color rojo indica eventos exclusivos para el tumor primario o metástasis. Los bloques verdes indican eventos comunes a ambos. El número de eventos por el cromosoma aparece en cada bloque. Las flechas indican LOH eventos o eliminaciones que abarcan el brazo p, q brazo, o todo el cromosoma. Las flechas rojas indican las aberraciones cromosómicas que son exclusivos y flechas verdes indican eventos que son comunes.
en el subconjunto de mutaciones deletéreas, se realizó un análisis adicional vía biológica, revisión de la literatura y la comparación con los datos del Atlas del Genoma del Cáncer disponibles para el cáncer gástrico difuso. Esto identificó un conjunto de genes conocidos de cáncer y candidatos probables relacionadas con el cáncer con mutaciones que probablemente tuvieron un impacto en la función de las proteínas. Nos hemos centrado en una serie de genes candidato conductor (Tabla 1) que previamente se había demostrado tener potenciales supresores de tumores o fueron conocidos oncogénicos con cambios bialélicos presentes en los oncogenes Cáncer cáncer genomes.Table 1 con amplificaciones o controladores de cáncer con eventos bialélicos
origen
Conocido o el controlador de cáncer candidato
caso bialélicos
alélica alteración 1
mutación o aberración genómico
Chr
posición
Chr o intervalo
alélica alteración 2
la única de la Red primaria FGFR2 *
amplificación página 6 veces la amplificación
10
117820033 - 119748751
común con el tumor primario y la metástasis
CDH1
Sí
supresión
eliminación parcial del exón 9
16
68.847.326-68.847.403
mutación germinal en CDH1
TP53
Sí página 5 'empalme sitio de la mutación
empalme aberrante
17
7578370
pérdida hemizygous del brazo 17p
único a la metástasis
TGFBR2
Sí
Frameshift indel: detengamos codón en el exón 4 página 3
30691871
eliminación hemizygous de tipo salvaje TGFBR2
locus
PCDH7
Sí
sentido erróneo
S87R
4 de 30.723.305
eliminación hemizygous de tipo salvaje 4 brazo
loci FERMT1
Sí
La pérdida de heterocigosidad
FERMT
1 localizado en 20p12.3
20
FERMT
1 mutación
BMP-7
loci
Sí
La pérdida de heterocigosidad
BMP-7
situado en 20q13.3
20
BMP-7
mutación
Chr: el cromosoma.
variaciones del número de copias y los desequilibrios alélicos que distinguen el tumor primario de la metástasis
Hemos observado aberraciones genómicas de mayor escala que diferenciaban a la primaria de la metástasis (Figuras 2b y 3a). Esto incluye cambios de número de copias y LOH eventos. Único en el tumor primario eran dos amplificaciones genómicas en los cromosomas 5 y 10, y dos inversiones en los cromosomas 15 y 16 (archivo adicional 1: Tabla S4). La amplificación del cromosoma 10 cubrió un intervalo de 1,66 Mb. Al considerar deleciones o desequilibrios alélicos, el único evento importante que se observó implicado una pérdida del brazo p del cromosoma 17. Figura 3 divergencia genética de la metástasis de ovario del cáncer gástrico primario para los conductores críticos candidatos. La genómica posición de la mutación, variaciones del número de copia (CNV) regiones o pérdida de heterocigosidad (LOH) se muestran los intervalos de los genomas del cáncer. Para las parcelas de cromosomas, el eje Y designa la posición con el cromosoma respectivo, su longitud en megabases (MB) y la designación ideograma que se muestran a la izquierda del perfil de número de copias. mutaciones deletéreas se muestran como flechas en caja con el símbolo de genes. (A) El genoma amplia distribución de los intervalos de CNV y LOH específicos de cáncer se ha resumido en todos los cromosomas para el tumor primario y la metástasis. (B) en el cromosoma 3, la metástasis tenía bialélicos eventos únicos que implican una deletérea TGFBR2
mutación y una deleción genómica afectar al otro alelo como se ve con mayor claridad con intervalos de LOH. Secundaria a deleciones genómicas, LOH se demuestra como un cambio en el valor de la relación de frecuencia alélica minoritaria de -1 y se correlaciona con una deleción genómica. (C) en el cromosoma 10, el FGFR2
gen se localiza en una región amplificación genómica visto sólo en el principal y no la metástasis. La amplificación se observó en un círculo rojo.
En contraste con el tumor primario, el tumor metastásico tenía LOH acontecimientos numerosos escala cromosómica y genómica supresiones que afectan a 12 cromosomas diferentes, la mayoría de los cuales eran únicos al tumor metastásico (Figura 2) . Esto incluyó múltiples deleciones y copia LOH eventos neutros que se detallan en el archivo adicional 1: Tabla S3. Había una amplificación genómica de cinco veces en el cromosoma 2, pero no hay genes específicos conocidos existía en el intervalo afectado. No hubo translocaciones cromosómicas detectables entre, ya sea en el tumor primario o metástasis genomas. Se identificaron otros reordenamientos de cáncer, pero no apuntan a aberraciones en ningún gen candidato conductor (archivo adicional 1: Tabla S4). No hubo indicios de gran inestabilidad genómica escala basada en el análisis de desequilibrio alélica; los cromosomas 14, 17, 20, 22 y todos los involucrados todo el cromosoma. Opiniones de número de copias aberraciones y los desequilibrios alélicos, identificamos exclusiva frente a eventos comunes entre el tumor primario y la metástasis. La única aberración genética común implicado el brazo p del cromosoma 17. En general, la falta de solapamiento era indicativa de divergencia genética significativa del tumor primario y la metástasis a pesar de un origen común como se indica mediante mutaciones compartidas en supresores de tumores críticos.
El genómico intervalos de la LOH, número de copias y la aberración eventos de reordenamiento se compararon con la posición de las mutaciones del gen validados. Este análisis integrado señaló un número de genes que tenían alteraciones bialélicos que implican tanto una pérdida del alelo de tipo salvaje de una gran aberración genómico intervalo y un alelo mutante. Los resultados para los genes con los accesos bialélicos se consideran fuertes candidatos para una participación de pérdida de función en el cáncer (Tabla 1).
Identificación de los conductores comunes de cáncer en el tumor primario y la metástasis
Tanto el primario y el metástasis contenía eventos del controlador de cáncer que eran probable que sea crítico para la tumorigénesis en el contexto de la inicial CDH1
mutación (Tabla 1, Figura 2). Además de la línea germinal CDH1
mutación intrónica, la segunda CDH1
alelo tuvo un somática 77 pb genómica supresión de una porción del exón 9 que afecta a las regiones de codificación aguas abajo también. El CDH1
mutación somática fue idéntica en ambos los genomas de cáncer gástrico primarios y metastásicos, lo que demuestra un origen genético común y proporcionando una fuerte evidencia genética de que este conductor tenía un papel crítico en la tumorigénesis gástrico difuso. Las mutaciones que afectan CDH1
exón 9 que conducen a la pérdida de expresión de la proteína con frecuencia se han detectado en el cáncer gástrico difuso [18] - [20]. secuencia de aminoácidos de este exón es un sitio de unión a calcio putativo que es probable importante para la función del receptor comentario El tumor primario y metastásico también compartida empalme bialélico sitio donante mutación. (c.559 + 1G > A) de la quinta intrón de TP53
y un evento LOH del cromosoma 17p que abarca el locus TP53 gratis (archivo adicional 1: Figura S1). El TP53
mutación de empalme interrumpe el empalme de ARN [21] y es una mutación del cáncer ya se ha informado [22], [23]. Los análisis de los cánceres gástricos esporádicos y heredados han identificado mutaciones TP53
que ocurren simultáneamente con CDH1
mutación [24], [25]. CDH1
inactivación en células parietales gástricas no induce carcinoma gástrico, lo que sugiere que la pérdida de CDH1
es insuficiente para la iniciación del tumor [26]. Sin embargo, doble knockout condicional de CDH1 Opiniones y TP53
induce el desarrollo del carcinoma gástrico difuso [26]. Curiosamente, el intervalo genómico del evento que afecta a la LOH TP53
locus era más grande en la metástasis en comparación con el tumor primario. Esto podría haber ocurrido debido a eventos independientes inestabilidad genómica dada la fuerte selección para la pérdida de la función bialélico TP53.
FGFRis un conductor accionable cáncer exclusivo de la primaria
tumor gástrico en el tumor primario, hubo una genómico de seis veces la amplificación de una región del cromosoma 10 del brazo q y se cubre un intervalo de 1,66 Mb. Dentro de estas regiones genómicas era un FGFR2 conductor candidato oncogénico
también se conoce como el factor de crecimiento de fibroblastos receptor 2 (Figura 3c). Esto se confirmó con varios métodos, incluyendo la secuenciación, análisis de matriz, y la validación mediante PCR cuantitativa. FGFR2 es un receptor transmembrana que actúa como parte de una vía clave de transducción de señales que regula la reparación de tejidos y el desarrollo embrionario entre una multitud de otras funciones [26].
Para validar la prevalencia de FGFR2
amplificación en difundirse contra cánceres gástricos intestinales , se analizaron 37 difusa y 27 primarios muestras de tumores gástricos subtipo intestinal con PCR digital [27]. Anteriormente, hemos demostrado que este método es profundamente sensible para la detección de número de copia aberración incluso en el contexto de ADN tumoral de dilución de ADN diploide normal. Nuestro estudio demostró FGFR2
amplificación en cuatro de 37 (11%) muestras de tumor difuso, que estaba ausente en las muestras de subtipo intestinal (Figura 4a). Figura 4 Prevalencia de FGFR2 en tumores gástricos humanos y su contribución a la proliferación celular. (A) esporádicas muestras de cáncer gástrico se evaluaron mediante PCR cuantitativa para determinar digitales FGFR2 genómica número de copias. Los puntos negros representan los cánceres gástricos difusos. Los puntos rojos indican el subtipo intestinal de cáncer gástrico. (B) Las características genéticas de los AGS (FGFR2
diploides) y KATOIII (FGFR2 amplificado) se muestran las líneas celulares de cáncer gástrico. (C) El porcentaje de supervivencia de la línea celular de cáncer AGS se muestra con inhibidores de FGFR2 de diferente especificidad. (D) El KATOIII línea celular de cáncer gástrico difuso fue tratada con inhibidores de FGFR2 de diferente especificidad. El eje Y representa el porcentaje de supervivencia frente
el eje X con concentraciones logarítmicas. En todos los paneles, barras de error representan el error estándar de la media. La diferencia en la supervivencia celular por ciento entre las células KATOIII y AGS fue estadísticamente significativa (P Hotel < 0,05). En las tres concentraciones más altas de todas las drogas, excepto Brivanib que sólo fue significativa en la concentración más alta
En apoyo de su papel como un conductor candidato, FGFR2
amplificación está presente en un número de líneas celulares de cáncer gástrico [28], [29] y, posteriormente, reportados en diversos tumores malignos gastrointestinales tales como adenocarcinoma de esófago [30]. Además, el tratamiento de líneas celulares de cáncer con inhibidores de moléculas pequeñas-FGFR2 específica o shRNAs conduce a la inhibición del crecimiento potente [28] lo que sugiere un papel funcional para FGFR2
amplificación en el subtipo difusa.
Análisis funcional del controlador de FGFR2 en combinación con CDH1 y TP53
Se identificaron dos ejemplos de un cáncer gástrico difuso primario con la co-ocurrencia de los conductores de cáncer conocidos y supuestos que implican CDH1
, TP53
, y FGFR2
como se ve en el paciente índice . El primer ejemplo incluyó una muestra de cáncer gástrico difuso que fue uno de los adenocarcinomas gástricos analizados por TCGA. La utilización del Portal CBio TCGA [10], hemos identificado un paciente (TCGA-BR-6803) que tenía un complemento similar de aberraciones genéticas en CDH1
, TP53
, y FGFR2
, todos los cuales han sido se ha descrito anteriormente en el cáncer como se ve en el repositorio de mutación cáncer cósmico. Esto incluye lo siguiente: una mutación sin sentido en CDH1 gratis (D254Y) que se ha descrito en otros tres tipos de cáncer; una mutación sin sentido (L130F) en TP53
donde las mutaciones en este codón se han reportado en otros 37 tipos de cáncer; FGFR2
de amplificación que nosotros y otros han identificado en el cáncer gástrico difuso.
Como segundo ejemplo, hemos identificado un ser humano difusa línea celular de cáncer gástrico, KATOIII, que tiene una composición similar de aberraciones genéticas que afectan a los mismos genes del cáncer que el tumor primario de nuestra paciente índice. KATOIII tiene una CDH1
mutación que conduce a una inserción secuencia intrónica en el ARNm [31], [32], un TP53
mutación que conduce a una eliminación completa de genes [33] y el FGFR2
amplificación [29] (Figura 4b). Esta línea celular nos permitió evaluar el potencial papel oncogénico del FGFR2
amplificación genética en el contexto específico de CDH1 Opiniones y TP53
mutaciones, similar al tumor primario del paciente índice.
Para determinar la contribución de FGFR señalización de crecimiento neoplásico, se trataron células KATOIII con varios inhibidores de molécula pequeña de tirosina FGFR2-quinasa (TKIs), incluyendo Brivanib, TKI258, Ponatinib, y AZD4547 [34]. Como control, se utilizó la línea celular de cáncer gástrico AGS, que es de tipo salvaje para FGFR2
, CDH1
y TP53
, pero tiene mutaciones en KRAS Opiniones y PIK3CA
[35] ( Figura 4b). Todos los inhibidores de FGFR2 la muerte celular inducida en KATOIII pero no las células AGS (Figura 4C y D). El más potente de estos TKIs, AZD4547, tiene un IC 50 de aproximadamente 2 nM en células KATOIII y 39.580 nM en células AGS (Figura 4C y D). Cada uno de los inhibidores demostró una IC inferior estadísticamente significativa 50 en las células KATOIII FGFR2-amplificado en comparación con células AGS no FGFR2-amplificado en todas las concentraciones ensayadas (Figura 4C y D).
En contraste, el tratamiento de KATOIII y células AGS con agentes quimioterapéuticos citotóxicos tales como paclitaxel, 5-fluorouracilo y carboplatino no tuvieron un efecto significativo en cualquiera de las líneas KATOIII o AGS, con similares IC 50 identificados en cada uno (archivo adicional 1: Cuadro S7). Para AZD4547, la diferencia de 20.000 veces en la sensibilidad a los inhibidores de FGFR sugiere que la señalización de FGF es un factor crítico para CDH1
proliferación celular gástrica -initiated y esto TKI representa una terapia potencial específica en los cánceres de subtipo difusas que albergan FGFR2
amplificaciones.
bialélicos inactivación de TGFBRis exclusiva a la metástasis ováricas
divergencia genética era evidente; la metástasis albergaba su propio subconjunto único de mutaciones y aberraciones genómicas. Tabla S1. Tabla S2. Tabla S3. Tabla S4. Tabla S5. Tabla S6. Tabla S7. Figura S1. Figura S2. Figura S3.

• La toxina botulínica en la submucosa gástrica reduce estimuló la producción de HCl en rats
• La predicción de múltiples cánceres primarios metacrónicos tras la resección curativa de predicción cancer