Metastatskega razvoj tumorja in organoidno modeliranje implicirajo TGFBR2as voznik raka pri difuzni rakom želodca

Metastatskega razvoj tumorja in organoidno modeliranje implicirajo TGFBR2
kot voznik raka pri difuzni raka želodca
Abstract
Ozadje
raka želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka globalnih, z metastazami predstavlja primarni vzrok smrtnosti. Za identifikacijo voznikov kandidatke, ki se onkogenezo in razvoja tumorja, izvajamo obsežno analizo zaporedja nukleotidov v genomu metastatsko napredovanje v razpršeno rakom želodca. To vključuje primerjavo med primarnega tumorja od dedne razpršeno želodčni sindrom raka proband in njegove ponovitve kot metastaze na jajčnikih.
Rezultati
Oba primarnega tumorja in metastaz jajčnikov imajo skupno biallelic za izgubo funkcije tako CDH1
in TP53
tumor valov, kar kaže na skupni genetski izvor. Medtem ko je primarni tumor eksponatov ojačanje 2 (FGFR2
) gena fibroblastni rastni faktor receptorja, metastaze zlasti nima FGFR2
ojačanja ampak ima edinstvene biallelic adaptacije Preoblikovanje rastni faktor-beta receptorja 2 (TGFBR2
) , kar kaže na drugačno vivo
razvoj neke TGFBR2
-mutant metastatskega klonske prebivalstva v tem bolniku. Kot TGFBR2
mutacije še niso bile funkcionalno potrjena pri raku želodca, smo modelirali metastatskega potenciala izgube TGFBR2 v mišje tridimenzionalni primarnega želodca organoidnega kulture. Tgfbr2
shRNA rasklapanje v Cdh1
- /-
; Tp53
- /-.
Organoids ustvarja zasedbi leta vitro
in robusten metastatskega tumorjev in vivo
, ki potrjuje, Tgfbr2
metastaze dušenje dejavnost
Sklepi
smo dokumentirate metastatskega diferenciacija in genetsko heterogenost razpršenega rakom želodca in razkrivajo potencialno metastatskega vlogo TGFBR2
za izgubo funkcije. V podporo tej študiji, smo se v mišje primarni organoidnega metodo kulture, ki lahko povzema vivo
metastatskega raka želodca. Na splošno smo opisali celovit pristop za določitev in funkcionalno potrjevanje domnevna voznikov raka, ki sodelujejo pri metastaz.
Ozadju
sveta, Adenokarcinom želodca je četrti najpogostejši malignom, in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka med moškimi in ženskami. Na podlagi značilnih histopatološke značilnosti, se želodčni adenokarcinom kategorizirane v razpršenih in črevesnih podtipov [1]. V smislu histopatologijo, difuzni želodčni rak na splošno nediferencirani, pogosto imajo pečat celic melodije značilnosti in invazivno infiltrirati normalno želodčno tkivo. V nasprotju s tem, črevesna podtip ima epitelno lastnosti in tvori diskretne tumorske mase podobne rak debelega črevesa. Difuzna ima želodčni rak večjo pojavnost metastaz in na splošno slabšo prognozo v primerjavi s črevesno podtip [2] [3]. Trenutno so genomske analize razpršenega raka želodca izbral majhno število vzorcev, vključno nedavne raziskave raka genoma Atlas Project (TCGA) in celo raziskave genoma niza razpršenih želodčnih tumorjev [4]. Vendar pa obstaja nekaj, če sploh, študije, ki Podatek o metastatskega razvoj raka želodca; metastatskih tumorjev, so običajno odsotne iz velikih genomskih raziskav raka, kot TCGA. Na splošno je malo znanega o onkogenih procesa in tumorja razvoja metastatskega raka želodca kljub izredno kliničnega pomena [5].
V dedne razpršeno raka želodca (HDGC), zarodne mutacije CDH1
(to je, E- kadherina) daje 70% doživljenjsko tveganje za nastanek razpršenega raka želodca [6], [7]. V CDH1
tumor supresorski gen kodira E-kadherina, transmembranski glikoprotein, ki posreduje adhezijo kalcija odvisne celične celic. Spremembe v delovanju CDH1 vplivajo na prehod epitelne-mezenhimskih (EMT), ki je bila vpletena kot igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze. Študije tumorjev prizadetih HDGC posameznikov zagotavlja edinstveno priložnost za določitev bistvenih vzrokov za razpršeno raka želodca v okviru CDH1
izgubo funkcije. Dokazila o vlogi CDH1
v občasnih razpršenih želodčnega raka med drugim ugotovitev, da 50% vsebuje CDH1
mutacije ali hypermethylation v tem CDH1
promotor [8], [9]. Nedavna celotna raziskava genom zaporedja razpršenega raka želodca ugotovili tudi pogoste CDH1
mutacije kot najpogostejšo voznika dogodka [4]. Podatki o raku želodca TCGA tudi visoko frekvenco somatskih CDH1
mutacij [10]. je znanega o identiteti in vlogi sočasno pojavljajo vozniki, ki prispevajo k razpršeno želodčne metastaze bistveno manj.
tukaj, poročamo študijo metastatskega evolucijski proces v difuzni rakom želodca. Naš cilj je bil ugotoviti, znanih in kandidatk vozniki, ki so opredeljene tudi napredovanje tumorja med metastaz. Opravili smo obsežno analizo genoma primarnega tumorja želodca in metastaz od posameznika z zarodne CDH1
mutacije (slika 1), ki je predstavil z želodčno primarno, nato po 3 letih z metastazami v levem jajčniku. Glede na obstoječe zarodne imunoglobulinske proge mutacijo v CDH1
genom raka potrebuje le še eno alelov sprašuje preko somatske genske aberacije, kot je prikazano v tumorju iz tega posameznika. Ker je začetna voznik rak dogodek znano, Kvalitativna rak genomi zagotavljajo redko in zelo informativen `poskus narave", ki zagotavlja možnost, razmejiti somatskih genetiko metastaz. analiza genoma zaporedja obeh tumorjev pokazala dokaz skupnega izvora, ki temelji na skupnih mutacij, vendar večja genomsko raznolikost videti tako na ravni mutacij tudi obširno alelov neravnovesja in kopiranje število aberacij za metatasis. Slika 1 družino in klinična anamneza iz Mendelian razpršenega rakom želodca. Rodovniško indeksno bolnika 525 (III-1) je upodobljen. vrste tumorja so označeni z barvo, vključno z zeleno za rakom trebušne slinavke, rdeča za difuzno raka želodca in rumena za raka dojke. Bolnik je predstavil s svojim primarnim rakom želodca v starosti 37 let. Tri leta kasneje se je predstavila s trebušno nelagodje. Izboljšanim kontrastom CT medenice ugotovili, da ima levi jajčnik mase (rumeni krog), ki je bila potrjena na biopsijo, da je razpršeno želodčne metastaze raka (ki je, Krukenberg tumor). Tekom evolucije metastatskega tumorja, število znanih in rakom kandidat dogodkov voznike razmejeno razvoj tumorjev in genetske razlike v metastaze iz primarnega tumorja.
Ugotovili smo, če so vozniki kandidatke tega metastatskega napredovanje zadošča za reprodukcijo razpršenih rak želodca. Naša metodologija modeliranja raka uporabljajo in vitro
želodčnih organoids in omogoča, da inženir genetsko kontekst voznik teh rakov in študij proces metastatskega evolucije in onkogenih poti, v razhajanj. Povezovanje genetske analize in biološko modeliranje, smo določili neodvisno vlogo TGFBR2
(preoblikovanje rastni faktor-β receptorjev 2) v onkogenezo razpršenih rakom želodca. Naše eksperimentalno modeliranje raka je odvisna od klimatskih tekoče vmesnik za primarno miške črevesnih kulture na, ki vsebuje tako elemente epitelijskih in mezenhimskih, natančno povzema dolgoročno orožja, razlikovanja med večimi je NT /Notch odvisne od matičnih celic nišo in peristaltiko [11]. smo poročali, analognega primarnega želodca organoidnega sistem kulture, ki natančno povzema večimi epitelne diferenciacijo in stromalne elemente [12]. V zadnjem času smo dosegli trden in vitro
onkogenega preoblikovanje primarnega želodca, debelega črevesa in trebušne slinavke organoids preko mutacij v Kraškem
in Trp53
, ki inducirajo visoke stopnje displazije in invazijo in vitro
z adenokarcinomom na podkožna presaditev v miši [13]. Mi dokazujejo funkcionalno potrditev kandidata želodčni rak metastazami voznikov iz študij rak genomske profiliranje, ki se osredotoča na modeliranje na TGFBR2
voznika kot dokaz načela.
Rezultati
difuzna raka želodca in metastatskega napredovanja
Pri starosti 37 let, je bil indeks bolnik (525) z diagnozo stadija III (T3N1M0) slabo diferencirane razpršeni adenokarcinomom želodca (slika 1). Njena 42-letna sestra je bila diagnosticirana z difuzno adenokarcinomom želodca 2 meseca prej. Na podlagi družinsko anamnezo raka želodca in nenavadno mladosti nastopa, je doživel reproduktivnih CDH1
testiranje mutacije. Bolnik in njena sestra je bilo ugotovljeno, da imajo zarodne imunoglobulinske proge spoj mutacijo v intron 10 (c.1565 + 2insT). To reproduktivnih mutacija je bila pozneje poročali v drugi družini z dednim razpršeni raka želodca (HDGC) [14]. Bolnik je doživel celotnega želodca, da se odstranijo svoj primarni tumor in je bilo ugotovljeno, da imajo en sam limfnega vozla metastaz. Je prejela standardno adjuvantno zdravljenje vključno s kombinirano kemoterapijo (cisplatinum in 5-fluorouracilom) in sevanja. Tri leta po svojem prvem pojavu bolnik poročal postopno spodnjem predelu trebuha polnost. Izračunani tomografija (CT) je pokazala veliko medenici maso skladno z levim metastaz jajčnikov (slika 1). Nato je bolnik doživel laparotomijo z dvostranskim salpingo-in biopsijo medeničnega mase. Patološke študije so pokazale metastatskega adenokarcinom vključuje jajčnikov, drugače navedeno kot Krukenberg tumor z enakim histološko videzom kot primarnega tumorja. Neka študija je poročala, da je bil med razpršeno raka želodca z metastatskim razširjanje jajčnikov z zasevki v 28,8% primerov [15]. Tako jajčnikov je skupna spletna stran za metastatsko bolezen.
Rak genomsko analizo zaporedja
Tako exome in cel genom paru-end zaporedja so bile izvedene na primarnega tumorja, metastaze jajčnikov in normalnega tkiva, ki je vključevala kri in normalno želodca tkiva (Dodatni datoteka 1: Tabela S1). Tkivo bezgavk metastaz je ni bilo na voljo za analizo. Več metode zaporedja smo uporabili za kompenzacijo v obsegu običajne mešanice stromalni, ki je neposredna posledica infiltracijski invazivnosti difuznega želodca podtipa raka. Smo določili obseg običajnega genoma zmesi in popravljena za vključitev normalne DNK (Dodatni datotek 1: Metode). Glede na kompleksnost vzorcev tumorjev, smo opravili dodaten krog ciljnega sekvenciranje za potrditev prisotnosti mutacij in drugih genetskih aberacij ki se je zgodila v eksonov, blizu meje EXON ali predlagateljev.
Splošno, smo pridobili več kot 100 × povprečna pokritost za vsako exome in na splošno sklicuje na podatke exome za odkritje kodiranja regija mutacije. Za celotno zaporedja nukleotidov v genomu, smo imeli več kot 60 × povprečna pokritost za primarnega raka celotnega genoma vzorca in 30 × za metastatskega genoma. Celoten genom zaporedja smo uporabili za ugotavljanje večjem obsegu genetskih aberacije kot števila kopij variacije (CNVs), alelne neravnovesja, prerazporeditve, in druge vrste strukturnih prerazporeditve. Po poravnavi, smo opravili varianta, ki poziva, da prepoznajo somatskih mutacij in drugih razredov genetskih aberacije. To je vključevalo somatskih mutacij, vstavljanje-izbrisi (indels), CNVs, izpadu heterozigotnosti regije (Loh) in raka preureditve (Dodatni datotek 1: Tabela S3 in preglednica S4). Kot kontrola za single nukleotidov varianta kliče, smo genotipizacijo vzorcev z Affymetrix 6,0 polimorfizma posameznih nukleotidov (SNP) polja; smo primerjali genotipe na ugotovljenih SNP iz podatkov zaporedja. Mora biti skladnost exome in celoten genom SNP podatkov podatkov array je bila 99%.
Kodirni regiji mutacije in potrditev z globokim sekvenciranje
Identificirali smo mutacije, ki so nastali v eksonov in intronskih mutacije v 100 podlag EXON meje in Rezultati so povzeti v dodatni datoteki 1: Tabela S2. Kakor je bilo prej, so imeli vzorci tumorske kompleksno sestavo, da je zmanjšano kritje zaporedno nekaterih mutacij. Nadaljevali smo z dodatnim krogom ciljnega sekvenciranje za potrditev te mutacije in določili njihovo prisotnost v obeh tumorjev. Smo oblikovali testa, za globoko ciljno resequencing, ki pokriva približno 300 baz okoli specifične mutacije lokusov (Dodatni datotek 1: Tabela S5). Povprečna ciljno zaporedja pokritost za vsako domnevno mutacijo ali lokusov je 278 × za normalno, 251 × za primarnega tumorja in 152 × za metastaz.
Med obema tumorjev, smo neodvisno potrjena skupaj 77 mutacij, ki so se zgodile v ali proksimalno eksonov (Dodatni datotek 1: Metode in tabela S5). Potrjeni genetske aberacije vključuje: (1) brez sinonima mutacije, (2) sinonima mutacije, (3) insercije ali (4) delecije. Z usmerjenim podatkov zaporedja, smo določili frekvenco mutacije alelov (MAF) med primarnega tumorja in metastaz za vsako mutacijo. To vključuje določitev del sekvence bere z mutacijo v primerjavi z referenčno sekvenco prebere. Nismo mogli ugotoviti, katere mutacije so bili pogosti ali izključno za primarnega tumorja v primerjavi s metastaz. Med 77 preverjenih mutacij, je razporeditev taka, da so mutacije v glavnem edinstvene bodisi primarnega tumorja ali metastatskega mestu. Na primer, je imela primarni tumor osem mutacije, ki niso bile prisotne v metastaz, medtem ko metastaze imela 37 mutacij niso prisotne v primarnega tumorja. Skupen obema raka bilo 32 mutacije.
Glede interval treh let pred detekcijo metastaz, obstaja možnost, da je prišlo do metastaz specifične mutacije neodvisno od primarnega tumorja. Mutacije, značilni za primarnega tumorja, ki niso bili prisotni v metastaz jajčnikov bi lahko bila posledica naključnega genskega drifta. Mutacije, ki so skupne tako kažejo na skupen izvor, vendar natančen časovni okvir za razlikovanje med obema tumorjev je manj jasno, kot je navedeno v teh mutacij z nižjo MAF. Podniz teh genov so imeli visoke vrednosti MAF, kar kaže na večjo verjetnost, da so prisotni v vseh klonskih prebivalstva v primarnega tumorja in metastaz. Kot smo opisali kasneje, so bili ti geni prednost za nadaljnje eksperimentalno testiranje v želodcu organoids.
Mutacije, ki vplivajo na delovanje genov
Med mutacij, ki so zunaj potrdili, smo se osredotočili na podskupini mutacij, ki vodijo do amino substitucije kislin, prezgodnje STOP kodoni in indels ki spremenjeni odprt bralni okvir. Kasneje smo ugotovili, če so bili ti kodiranje mutacije potencialno škodljiv za delovanje genov z uporabo številnih napoved algoritmov kot Polyphen [16] in PRESEJANJE [17] med drugim. Na osnovi informacij MAF za vsako mutacijo smo ugotovili ali je bila ta mutacije z morebitno škodljiv vpliv na genskih produktov skupno ali izključno za primarnega tumorja in metastaz (slika 2). Slika 2 Primerjava genetskih aberacij v primarnega tumorja in metastaz. Skupna primerjavi
ekskluzivnih genskih odstopanj smo primerjali med obema tumorskih genomov. (A) Geni z kodiranje mutacije, ki imajo potencialno škodljiv vpliv na seznamu. Ti geni so razvrščene glede na to, ali so izključno (rdeče znakov) ali pogosto (zeleni znaki) v primarnega tumorja in metastaz. Mutacije vse povzroči spremembe v sestavi aminokislinskega genskega produkta in so bile ugotovljene za znatno spremembo z visoko verjetnostjo vplivajo na funkcije gena izdelka. (B) povzetek kromosomskih je prikazana na celotnem genoma raka obeh tumorjev. To vključuje spremembo številko kopija (CNV) ali izgube heterozigotnosti (LOH). Rdeče bloki označuje dogodke izključno s primarnega tumorja ali metastaz. Zelene enote označujejo dogodke, ki so skupni obema. Število dogodkov na kromosom je naveden v vsakem bloku. Puščice kažejo loh dogodke ali izbrisi, ki obsegajo p roko, q roko, ali celoten kromosom. Rdeče puščice označujejo kromosomske aberacije, ki so izključno in zelene puščice označujejo dogodke, ki so skupne.
Na podskupini škodljive mutacije, smo izvedli dodatno biološko analizo izločajo, pregled literature in primerjavo z podatki Cancer Genome Atlas voljo za razpršeno raka želodca. To je določila znanih rakavih genov in verjetnih kandidatov, povezanih z rakom, z mutacijami, ki bi lahko imele vpliv na funkcijo beljakovin. Osredotočili smo se na številne voznike kandidat genov (tabela 1), ki je bilo prej pokazalo, da so imeli onkogenega potenciala ali pa so bile znane tumorske valov z biallelic sprememb, ki so prisotne v rak genomes.Table 1 raka onkogeni na dopolni ali vozniki z rakom, pri biallelic dogodkov
Izvor
znano ali voznik rak kandidat
Biallelic dogodek
alelov sprememba 1
mutacijo ali genomske aberacije
Chr
položaj
Chr ali interval
alelov spremembe 2
Unique na primarni
FGFR2 *
Amplification
6-kratno ojačanje
10.
117820033-119748751
Skupno s primarnega tumorja in metastaz
CDH1
da
brisanja
Delno brisanje eksonu 9
16
68.847.326-68847403
zarodne mutacije v CDH1
TP53
Da
5 'spoj stran mutacija
Aberrant spajanje
17
7578370
hemizigotnih izguba 17p roko
Unique do metastaz
TGFBR2
da
premika bralnega okvira INDEL
kodon v eksonu 4
3
30691871
hemizigotnih izbris divjega tipa TGFBR2
locus
PCDH7
Da
Missense
S87R
4
30723305
hemizigotnih izbris divjega tipa 4 roko
FERMT1
loci
Da
Izguba heterozigotnosti
FERMT
1 nahaja v 20p12.3
20
FERMT
1 mutacijo
BMP-7
loci
Da
Izguba heterozigotnost
BMP-7
nahaja v 20q13.3
20
BMP-7
mutacija
Chr. kromosom
variacij število kopij in alelne neravnovesij razlikuje primarni tumor iz metastaz
Opazili smo večjem obsegu genomske aberacije, ki se razlikujejo primarni od metastaz (sliki 2b in 3a). To je vključevalo kopiranja spremembe številko in loh dogodkov. Edinstvena primarnega tumorja sta bili dve genomske ojačitve na kromosomih 5 in 10, in dve inverzije na kromosomih 15 in 16 (Dodatna datoteka 1: Tabela S4). Kromosom 10 pomnoževanje obsegal 1,66 Mb interval. Pri odločanju izbris ali alelov neravnovesja, edini večji dogodek, ki je ugotovil, vključenih izgubo p kraku kromosoma 17. Slika 3 genetskega razhajanja v metastaz jajčnikov s primarnim rakom želodca za kritične voznike kandidatke. Genomsko položaj mutacije, kopiranje različic številka (CNV) regije ali za izgubo heterozigotnosti (LOH) intervali so prikazani iz genomov rakom. Za kromosomskih ploskvah, os Y označuje položaj s posameznim kromosom, njene dolžine v megabaz (MB) in določitve ideogramom prikazane na levi strani profila števila kopij. Škodljive mutacije so prikazane kot okvirčkih puščic s simbolom gena. (A) genom široka distribucija rakavih specifične CNVs in LOH intervalih so povzeti v vseh kromosomov za primarnega tumorja in metastaz. (B) na kromosomu 3 je imela metastaze edinstvene biallelic dogodke, ki vključujejo škodljivo TGFBR2
mutacijo in genomske izbris vpliva na druge alel kot najbolj jasno videti s loh intervalih. Sekundarna za genomske izbrise, se LOH dokazali kot premik v manjših alelov razmerje frekvenca vrednosti -1 in korelira z genomske izbris. (C) na kromosomu 10, je bil na FGFR2
gen nahaja v genomske pomnoževanja regiji videli le v primarnem in ne na metastaz. Amplifikacije je navedeno v rdečem krogu.
Za razliko od primarnega tumorja, je imela metastatski tumor številne kromosomske obsega loh dogodke in genomske izbris, ki vplivajo na 12 različnih kromosome, večina, ki so bili edinstveni na metastatskim tumor (slika 2) . To je vključevalo več črtanja in kopiranje nevtralne loh dogodke, ki so podrobno opisane v dodatni datoteki 1: Tabela S3. Prišlo je do petkratno genomske pomnoževanje v kromosomu 2, vendar ne obstajajo posebni znan genov v prizadetem intervalu. Ni bilo zaznati med kromosomske prenosi v bodisi primarnega tumorja ali metastaz genomov. so bile ugotovljene druge preureditve raka, vendar niso kazali na aberacije v vseh voznika kandidat genov (Dodatni datotek 1: Tabela S4). So obstajali znaki obsežno genomske nestabilnosti, ki temelji na alelne analizo neravnovesjem; kromosomi 14, 17, 20 in 22, vse sodelujejo celoten kromosom.
Za kopiranje število aberacij in alelne neravnovesij, smo ugotovili ekskluzivni primerjavi skupnih dogodkov med primarnega tumorja in metastaz. Edini skupni genetski aberacija izbral p roko kromosom 17. Na splošno je bilo pomanjkanje prekrivanja kaže na veliko genetskega odstopanja od primarnega tumorja in metastaz, kljub skupnega izvora, kot je označena z skupnimi mutacij v kritičnih tumorjev razbijal.
Genomsko intervali za LOH, številko kopije aberacije in preureditvene dogodki so se v primerjavi s položajem potrjenih genskih mutacij. Ta celovita analiza pokazala na številnih genov, ki so imele biallelic spremembe, ki vključujejo tako izgubo alela divjega tipa iz velikega intervala genomske aberacije in mutiran alel. Rezultati za genov s biallelic zadetkov so bili obravnavani kot močni kandidati za udeležbo za izgubo funkcije v raka (tabela 1).
Identifikacija voznikov z rakom, ki je skupna primarnega tumorja in metastaz
Tako primarni in metastaze vsebuje voznik raka dogodke, ki so bili verjetno ključnega pomena za tumorigeneze v okviru začetnega CDH1
mutacije (preglednica 1, slika 2). Poleg zarodne linije CDH1
intronskih mutacijo, da drugi CDH1
alel za somatsko 77 bp genomske črtanje dela eksonu 9, ki vpliva kodirajo regije na nižji stopnji, kot tudi. V CDH1
somatska mutacija je bil v obeh osnovnih in metastatskih želodčne genomov za rakom, kar kaže na skupni genetski izvor in zagotavlja močne genetske dokaze, da je imel ta voznik ključno vlogo pri difuzni želodca tumorigeneze. Mutacije, ki vplivajo na CDH1
eksonu 9, ki vodijo do izgube izražanja proteinov so bili pogosto odkriti v difuzni rakom želodca [18] - [20]. Zaporedje tega ekson je aminokislina je domnevni kalcij veže na mesto, ki je verjetno pomembni za funkcije receptorja
primarni in metastatskega tumorja prav tako deljena biallelic izrezovalno mesto darovalec mutacij. (c.559 + 1G > A) petega introna TP53
in LOH dogodek kromosom 17p zajema v TP53
procesno (Dodatne datoteke 1: Slika S1). TP53
spajanje mutacija prekine RNA spleti [21] in je že poročali rak mutacija [22], [23]. Analize občasna in podedovanih želodčnega raka so ugotovili TP53
mutacije, ki se pojavljajo hkrati s CDH1
mutacijo [24], [25]. CDH1
inaktivacijo v celicah želodčne stene ne povzroča raka želodca, kar kaže, da izguba CDH1
je premalo za tumorja začetku [26]. Vendar pa dvojna pogojno knockout za CDH1
in TP53
inducira razvoj difuzno želodčnega raka [26]. Zanimivo je, genomsko interval dogodka LOH vpliva na TP53
locus večja v metastaz v primerjavi z primarnega tumorja. To bi lahko prišlo zaradi neodvisnih genomske nestabilnosti dogodkov danih močan selekcijski za biallelic izgubo funkcije TP53.
FGFRis izpodbojni raka voznik izključno na primarno želodca tumorja
V primarnega tumorja, je bil šest-krat genomske ojačanje regije kromosoma 10 kraku q in prekrita interval 1,66 Mb. Znotraj tega genomskih regij bila onkogeni voznik kandidat FGFR2
imenovan tudi kot fibroblastnega rastnega faktorja receptorja 2 (slika 3c). To je bilo potrjeno s številnimi metodami, vključno z zaporedjem, analize matrike in potrditve s kvantitativno PCR. FGFR2 je transmembranski receptor, ki deluje v okviru ključnega signalov poti ureja obnovo tkiv in embrionalni razvoj med množico drugih funkcij [26].
Za potrditev razširjenosti FGFR2
ojačanje v razpršeno primerjavi črevesnih želodca raka smo analizirali 37 razpršenih in 27 črevesne podtipa primarnih tumorja želodca vzorce z digitalnim PCR [27]. Prej smo dokazali, da je ta metoda močno občutljiva za detekcijo kopija številke aberacije celo v okviru normalne diploidna DNA redčenje tumorja DNK. Naša študija je pokazala, FGFR2
ojačanja v štirih od 37 (11%) vzorcev difuzna tumorja, ki je bil odsoten v črevesni vzorcih podtip (slika 4a). Slika 4 Razširjenost FGFR2 v človeških želodčnih tumorjev in njen prispevek k celično proliferacijo. (A) Posamična želodca vzorcev raka smo ovrednotili s kvantitativno digitalni PCR za določanje FGFR2 število genomskih kopiranja. Črne pike predstavljajo razpršene želodca raka. Rdeče pike kažejo na črevesno podvrsto raka želodca. (B) Genetske značilnosti AGS (FGFR2
diploidnih) in KatoIII (FGFR2 dopolnjena) želodca rakave celične linije so prikazani. (C) Odstotek preživetja za raka celične linije AGS je prikazana z zaviralci FGFR2 različno specifičnost. (D) KatoIII difuzni rak celične linije želodčne smo obdelali z zaviralci FGFR2 različno specifičnost. Y os prikazuje odstotno preživetje v primerjavi
X-osi s koncentracijami log. V vseh plošč, napake palice predstavljajo standardno napako povprečja. Razlika v preživetju odstotkov celic med KatoIII in AGS celicami je bila statistično značilna (P
< 0,05). Na treh najvišjih koncentracijah vseh drog, razen Brivanib kar je bilo pomembno le pri najvišji koncentraciji
v podporo svoji vloga kot voznik kandidatka FGFR2
pomnoževanje prisoten v številnih želodčnega raka celičnih linij [28], [29] in potem poročali v različnih malignostmi prebavil, npr požiralnika adenokarcinom [30]. Poleg tega je zdravljenje raka celičnih linij z FGFR2 specifične majhne inhibitorjev molekul ali shRNAs vodi do močnega zaviranja rasti [28], ki kažejo funkcionalno vlogo FGFR2
ojačanja v razpršeni podtipa.
Funkcionalno analizo voznika FGFR2 v kombinacija z CDH1 in TP53
Identificirali smo dva primera primarnega razpršenega rakom želodca z sopojavnosti znanih in domnevnih voznike z rakom, ki vključujejo CDH1
, TP53
in FGFR2
kot je razvidno iz indeksa bolniku . Prvi primer je vključevala difuzno želodčne vzorec raka, ki je bil med želodčnega adenokarcinoma analiziral TCGA. Uporaba portala cBio TCGA [10], smo identificirali bolnika (TCGA-BR-6803), ki je imel podobno dopolnilo genetskih aberacij v CDH1
, TP53
in FGFR2
, vsi, ki so bili prej opisano v raka, kot je razvidno iz COSMIC raka mutacije skladišča. To je vključevalo naslednje: a missense mutacija v CDH1
(D254Y), ki je bila opisana v treh drugih rakavih obolenj; missense mutacija (L130F) v TP53
kjer so mutacije v tem kodon poročali v 37 drugih vrst raka; v FGFR2
pomnoževanje, ki smo jih in drugi opredeljena v razpršeni rak želodca.
Kot drugi primer, smo identificirali človeška difuzni rakava celica linija želodca, KatoIII, ki ima podobno sestavo genetskih aberacije vplivajo enake rakave gene kot primarnega tumorja našega indeksa pacienta. KatoIII ima CDH1
mutacijo, ki vodi do intronskih vstavitvijo zaporedja v mRNA [31], [32], je TP53
mutacijo, ki vodi k popolni genski izbris [33] in FGFR2
ojačanje [29] (slika 4b). Ta celična linija nam je omogočilo, da ocenijo morebitne onkogenega vlogo FGFR2
ojačanja v specifične genske okviru CDH1
in TP53
mutacije, ki je podoben indeksu bolnikovo primarnega tumorja.
Za določitev prispevka od FGFR signaliziranje neoplastične rasti, smo obdelamo KatoIII celice z več FGFR2 majhna molekula tirozin-kinaza inhibitorji (TKI), vključno Brivanib, TKI258, Ponatinib in AZD4547 [34]. Kot kontrolo smo uporabili želodčni rak celične linije AGS, ki je divji tip za FGFR2
, CDH1
in TP53
, vendar ima mutacije v KRAS
in PIK3CA
[35] ( slika 4b). Vsi zaviralci FGFR2 inducirane celične smrti v KatoIII vendar ne AGS celice (Slika 4c in d). Najmočnejši teh TKI, AZD4547, ima IC 50 približno 2 nm v KatoIII celic in 39,580 nM v AGS celic (Slika 4c in d). Vsak od zaviralcev pokazala statistično značilno nižji IC 50 in-FGFR2 ojačan KatoIII celic v primerjavi z ne-FGFR2-ojačan AGS celic na vseh testiranih koncentracijah (slika 4c in d).
Nasprotno, zdravljenje KatoIII in AGS celice z citotoksičnih kemoterapevtikov kot paklitaksela, 5-fluorouracilom in karboplatin ni imela pomemben vpliv na obeh KatoIII ali AGS linij, s podobno IC 50, opredeljenega v vsaki (Dodatni datoteka 1: Tabela S7). Za AZD4547 je 20.000-kratna razlika v občutljivosti na FGFR inhibitorje kaže, da je FGF signalizacijo kritičen voznik CDH1
-initiated želodca celično proliferacijo in to TKI predstavlja potencialno ciljno zdravljenje v razpršenih podtip raka zasidrana FGFR2
ojačitve.
Biallelic inaktivacijo TGFBRis izključno na metastaz jajčnikov
je razvidno Genetsko razlike; metastaze gojil svojo edinstveno podskupino mutacij in genomskih aberacije.

• Botulinum toksin v želodčnem submucosa zmanjšuje spodbudila proizvodnjo HCl v rats
• Napoved metachronous več primarnega raka po kurativno resekcijo želodca cancer