Uitgezaaide tumor evolutie en organoïde modellering impliceren TGFBR2as een kanker bestuurder in diffuse maag cancer

uitgezaaide tumor evolutie en organoïde modellering impliceren TGFBR2
als een kanker bestuurder in diffuse maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de tweede s wereld voornaamste oorzaak van de opwarming van de sterfgevallen door kanker, met metastasen die de belangrijkste oorzaak van sterfte. Om kandidaat-bestuurders die betrokken zijn bij oncogenese en tumor evolutie te identificeren, voeren wij een uitgebreide genoom analyse van metastatische progressie in een diffuse maagkanker. Dit een vergelijking tussen een primaire tumor van een erfelijke diffuse maagkanker syndroom proefpersoon en de herhaling als ovarium metastase.
Resultaten
Zowel de primaire tumor en eierstokkanker metastase hebben gemeenschappelijke biallele verlies-van-functie van zowel de CDH1 Kopen en TP53
tumor suppressors, wat wijst op een gemeenschappelijke genetische oorsprong. Terwijl de primaire tumor vertoont amplificatie van de fibroblast groeifactor receptor 2 (FGFR2
) gen, de metastase name mist FGFR2
amplificatie maar bezit unieke biallele veranderingen van transformerende groeifactor-bèta receptor 2 (TGFBR2
) , met vermelding van de uiteenlopende in vivo
evolutie van een TGFBR2
-mutant uitgezaaide klonale bevolking in deze patiënt. Zoals TGFBR2
mutaties niet eerder functioneel gevalideerd bij maagkanker, we gemodelleerd het metastatisch potentieel van TGFBR2 verlies in een murine driedimensionale primaire maag organoïde cultuur. De TGFBR2
shRNA knock-down binnen Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoids genereert invasie in vitro
en robuuste metastatische tumorvorming in vivo
bevestigt TGFBR2
metastase suppressor activiteit
Conclusies
Wij documenteren metastatische differentiatie en genetische heterogeniteit van diffuse maagkanker en zichtbaar maken van het metastatische rol van TGFBR2
verlies van functie. Ter ondersteuning van deze studie, passen we een muizen primaire organoïde kweekmethode staat indient in vivo
uitgezaaide maagkanker. Over het algemeen beschrijven we een geïntegreerde aanpak voor het identificeren en functioneel te valideren vermeende kanker bestuurders die betrokken zijn bij metastase. Achtergrond
Worldwide, adenocarcinoom van de maag is de vierde meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij mannen en vrouwen. Gebaseerd op kenmerkende histopathologische kenmerken wordt maagdarmkanker onderverdeeld in diffuus en intestinale subtypen [1]. In termen van histopathologie, diffuse maagkanker zijn over het algemeen ongedifferentieerde, hebben vaak zegelring cel ring functies en invasief infiltreren normale maag weefsel. In tegenstelling, de intestinale epitheliale subtype eigenschappen en vormt aparte tumormassa's vergelijkbaar met colonkanker. Diffuse maagkanker heeft een hogere incidentie van metastasen en een algemeen slechtere prognose in vergelijking met de intestinale subtype [2], [3]. Op dit moment hebben de genomische analyses van diffuse maagkanker een klein aantal monsters, waaronder een recente studie van het Cancer Genome Atlas Project (TCGA) en een whole genome sequencing onderzoek van een reeks diffuse maag tumoren [4] die betrokken zijn. Er zijn echter weinig of geen studies die detail metastatische ontwikkeling van maagkanker; uitgezaaide tumoren zijn meestal afwezig zijn van grootschalige genomische kanker onderzoeken zoals TCGA. Over het algemeen is er weinig bekend over het oncogene proces en de tumor evolutie van uitgezaaide maagkanker ondanks het allergrootste klinisch belang [5].
In erfelijke diffuse maagkanker (HDGC), kiemlijn mutaties in CDH1
(dat wil zeggen, E- cadherine) kent een 70% levensduur risico op diffuse maagkanker [6], [7]. De CDH1
tumorsuppressorgen codeert E-cadherine, een transmembraan glycoproteïne dat calcium afhankelijke cel-cel adhesie medieert. Veranderingen in CDH1 functie beïnvloeden de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) die is geïmpliceerd als een rol spelen bij tumorgenese. Studies van tumoren aangetaste HDGC individuen 'bieden een unieke gelegenheid om de chauffeurs van essentieel belang van diffuse maagkanker vast te stellen in het kader van CDH1
verlies van functie. Bewijsmateriaal van de rol van CDH1
in sporadische diffuse maagkanker omvat de waarneming dat 50% bevatten CDH1
mutaties of hypermethylatie van de CDH1
promoter [8], [9]. Een recente whole genome sequencing overzicht van diffuse maagkanker ook geïdentificeerd frequente CDH1
mutaties als de meest voorkomende bestuurder gebeurtenis [4]. De TCGA maagkanker data een hoge frequentie van somatische mutaties CDH1
[10] tonen ook. Significant minder bekend over de identiteit en functie van gelijktijdig optredende bestuurders die bijdragen aan maag metastase diffunderen.
Hierin beschrijven we een studie van de metastatische evolutieproces diffuse maagkanker. Ons doel was om bekende en kandidaat bestuurders de tumorprogressie bakenen tijdens metastase identificeren. We voerden een uitgebreide genoom sequentie-analyse van een primaire maag tumor en metastase van een individu met een kiemlijn mutatie CDH1
(figuur 1) die met een primaire maag gepresenteerd, gevolgd na 3 jaar van metastase in de linker eierstok. Gezien de bestaande kiembaanmutatie in CDH1
de kanker genoom vereist slechts een tweede allel raakte via een somatische genetische afwijking, zoals wordt aangetoond in de tumor van deze persoon. Omdat de initiële kanker bestuurder evenement bekend is, Mendeliaanse kankergenomen bieden een zeldzame en zeer informatieve `experiment van de natuur ', die een kans om somatische genetica van metastase af te bakenen biedt. Genoom sequentie analyse van zowel tumoren bleek bewijs van een gemeenschappelijke oorsprong op basis van gedeelde mutaties maar een grotere genomische diversiteit gezien zowel op het niveau van mutaties evenals uitgebreide allelische onbalans en aantal kopieën afwijkingen voor de metatasis. Figuur 1 Familie en klinische geschiedenis van een Mendeliaanse diffuse maagkanker. De stamboom van de index patiënt 525 (III-1) wordt afgebeeld. tumorsoorten zijn aangegeven met kleur zoals groen voor pancreaskanker, rood voor diffuse maagkanker en geel voor borstkanker. De patiënt presenteerde met haar primaire maagkanker op de leeftijd van 37 jaar. Drie jaar later presenteerde ze met buikklachten. Contrast-versterkte CT-scan van het bekken die een linker eierstok massa (gele cirkel) dat werd bevestigd biopsie een diffuse maagkanker metastase (dwz Krukenberg tumor). In de loop van metastatische tumor evolutie, een aantal bekende en kandidaat kanker driver gebeurtenissen afgebakend de tumor evolutie en genetische divergentie van de metastase van de primaire tumor.
We bepaald of de kandidaat bestuurders van deze metastatische progressie voldoende diffuus reproduceren waren maagkanker. Onze kanker modelleringsmethode gebruikt in vitro
maag organoids en maakt het mogelijk om de genetische bestuurder context van deze kankers ingenieur en bestuderen het proces van metastatische evolutie en oncogene pathway divergentie. Integratie genetische analyse en biologische modellen, hebben we de onafhankelijke rol TGFBR2
(transforming growth factor-β receptor 2) in de oncogenese diffuse maagkanker. Onze experimentele kanker modellen gebaseerd op een lucht-vloeistof interface voor primaire muis intestinale cultuur die zowel epitheliale en mesenchymale elementen bevat, nauwkeurig recapituleert langdurige proliferatie, multilineage differentiatie, het Wnt /Notch-afhankelijke stamcelniche en peristaltiek [11]. We meldden een analoge primaire maag organoïde cultuur systeem dat nauwkeurig recapituleert multilineage epitheliale differentiatie en stromale elementen [12]. Onlangs bereikten we robuuste in vitro
oncogene transformatie van primaire maag-, darm en alvleesklier organoids via mutaties in Kras
en Trp53
, die high-grade dysplasie en de invasie induceren in vitro hotels met adenocarcinoom op subcutane transplantatie in muizen [13]. We tonen de functionele validatie van kandidaat maagkanker metastase bestuurders van kanker genomic profiling studies, gericht op het modelleren van de TGFBR2
bestuurder als proof of principle.
Resultaten
Zend maagkanker en metastatische progressie
Op de leeftijd van 37 jaar, de index patiënt (525) werd gediagnosticeerd met stadium III (T3N1M0) slecht gedifferentieerde diffuse adenocarcinoom van de maag (figuur 1). Haar 42-jarige zus werd gediagnosticeerd met diffuse adenocarcinoom 2 maanden eerder. Op basis van de familiegeschiedenis van maagkanker en de ongewoon jonge leeftijd bij het begin, onderging ze kiembaan CDH1
mutatie testen. De patiënt en haar zus bleken een kiemlijn splicingplaats mutatie in intron 10 (c.1565 + 2insT) hebben. Dit kiembaanmutatie werd vervolgens gemeld in een andere familie met erfelijke diffuse maagkanker (HDGC) [14]. De patiënt onderging een totale gastrectomie haar primaire tumor en bleek een lymfeklier metastase. Zij ontving standaard adjuvante behandeling inclusief combinatie chemotherapie (cisplatinum en 5-fluorouracil) en straling. Drie jaar na haar eerste presentatie, de patiënt gerapporteerde progressieve onderbuik volheid. Een computertomografie (CT) scan toonde een grote bekkenmassa overeenstemming met een linker ovarium metastase (figuur 1). Vervolgens heeft de patiënt onderging een laparotomie met bilaterale salpingo-oophorectomy en biopsie van het bekken massa. Pathologische studies aangetoond metastatische adenocarcinoom waarbij de eierstokken, anders aangeduid als een Krukenberg tumor met dezelfde histologische uiterlijk als de primaire tumor. Eén studie rapporteerde dat bij diffuse maagkanker met metastatische disseminatie, de eierstok was een metastatische lokalisatie in 28,8% van de gevallen [15]. Zo is de eierstok is een gemeenschappelijke plaats voor gemetastaseerde ziekte.
Genoom Cancer sequencing analyse
Zowel exome en hele genoom gepaarde-end sequencing werden uitgevoerd op de primaire tumor, eierstokkanker metastase, en normaal weefsel, die het bloed en de normale maag opgenomen weefsel (Extra file 1: Tabel S1). Weefsel van de lymfeknoop metastase was niet beschikbaar voor analyse. Meerdere sequencing methoden werden toegepast ter compensatie van de mate van normale stromale mengsel, een direct gevolg van de infiltratieve invasiviteit van de diffuse maagkanker subtype. We bepaalden de mate van de normale genoom mengsel en gecorrigeerd voor de opname van de normale DNA (Extra file 1: Methoden). Gezien de complexiteit van de tumormonsters, we extra lang gerichte sequencing uitgevoerd om de aanwezigheid van mutaties en andere genetische afwijkingen die zich in exonen, exon grenzen of nabij promoters bevestigen.
Algemeen verkregen we meer dan 100 x gemiddelde dekking per exome en algemeen gebruikt exome gegevens voor de ontdekking van mutaties coderende gebied. Voor whole genome sequencing, hadden we meer dan 60 × gemiddelde dekking voor de primaire kanker hele genoom monster en 30 × voor de metastatische genoom. The whole genome sequencing werd gebruikt voor het identificeren van grotere schaal genetische afwijkingen, zoals copy number variation (CNV), allelische onevenwichtigheden, herschikkingen en andere klassen van de structurele herschikkingen. Na afstemming, voerden we variant bellen naar somatische mutaties en andere klassen van genetische afwijkingen te identificeren. Dit was inclusief somatische mutaties, insertie-deleties (indels), CNV, verlies-of-heterozygosity gebieden (LOH), en kanker herschikkingen (Extra file 1: Tabel S3 en Tabel S4). Als controle voor enkele nucleotide variant bellen, we gegenotypeerd de monsters met Affymetrix 6,0 single nucleotide polymorfisme (SNP) arrays; vergeleken we de genotypen om de geïdentificeerde SNPS uit de reeks data. De concordantie van exome en hele genoom SNP gegevens aan de array gegevens was 99%.
Coding regio mutaties en validatie met diepe sequencing
We identificeerden mutaties die zich in exons en intronic mutaties binnen 100 bases van de exon grens en de resultaten zijn samengevat in Extra file 1: Tabel S2. Zoals eerder opgemerkt, de tumormonsters complexe samenstelling had de sequentie reikwijdte van bepaalde mutaties verminderd. We gingen met een extra ronde van gerichte sequentie van deze mutaties te valideren en bepalen hun aanwezigheid in beide tumoren. We ontwierpen een test voor diepe gerichte herschikken dat ongeveer 300 bases rond de specifieke mutatie loci bedekt (Extra file 1: Tabel S5). De gemiddelde gerichte sequentie dekking per putatieve mutatie of loci is 278 x het normale, 251 × de primaire tumor en 152 x voor metastase.
Tussen de twee tumoren we onafhankelijk gevalideerd in totaal 77 mutaties die optrad binnen of proximale naar exons (Extra file 1: methoden en Tabel S5). Gevalideerde genetische afwijkingen omvatten: (1) niet-synonieme mutaties, (2) synoniem mutaties, (3) inserties, of (4) deleties. Met de beoogde sequentiedata, bepaalden we de mutatie allelische frequentie (MAF) tussen de primaire tumor en metastasen per mutatie. Zij bepaalt de fractie van een sequentie gelezen met een mutatie in vergelijking met de referentiesequentie leest. We waren in staat om te bepalen welke mutaties gemeenschappelijke of exclusief voor de primaire tumor versus de metastase waren. Onder de 77 gevalideerde mutaties, de verdeling was zodanig dat mutaties waren meestal uniek hetzij de primaire tumor of de metastatische plaats. Bijvoorbeeld, de primaire tumor had acht mutaties die niet in de metastase waren terwijl de metastase hadden 37 mutaties niet in de primaire tumor. Voor beide kankers waren 32 mutaties.
Gezien het interval van drie jaar voorafgaand aan de detectie van de metastase, bestaat de mogelijkheid dat de metastase-specifieke mutaties bij onafhankelijk van de primaire tumor. Mutaties specifiek voor de primaire tumor die niet in de eierstokken waren metastase mogelijk veroorzaakt door willekeurige genetische drift zijn. De voor beide mutaties wijzen op een gemeenschappelijke oorsprong, maar de exacte timing van het onderscheid tussen de twee tumoren minder duidelijk zoals opgemerkt door die mutaties met lagere MAF. Een subgroep van deze genen had hoge MAF waarden, wat wijst op een hogere waarschijnlijkheid dat in alle klonale populaties in de primaire tumor of metastase. Zoals we later te beschrijven, werden deze genen prioriteit voor verdere experimentele testen in de maag organoids.
Mutaties die genfunctie
Onder de mutaties die extern zijn gevalideerd, hebben we ons gericht op de subset van mutaties die leiden tot aminozuursubstituties, voortijdige stop codons en indels dat het open leesraam gewijzigd. Vervolgens bepaalden wij of deze coderende mutaties waren potentieel schadelijk voor genfunctie met een aantal voorspelling algoritmen zoals Polyphen [16] en zeef [17] onder andere. Op basis van de MAF voor elke mutatie, bepaalden we of deze mutaties met mogelijke schadelijke gevolgen voor de genproducten voorkwamen of exclusief voor de primaire tumor en metastase (figuur 2). Figuur 2 Vergelijking van de genetische afwijkingen in de primaire tumor en metastase. Vaak versus
exclusieve genetische afwijkingen worden vergeleken tussen de twee tumor genomen. (A) genen met coderende mutaties die een potentiële schadelijke effecten staan. Deze genen zijn ingedeeld op basis van of ze exclusief (rode letters) of vaak (groene letters) aan de primaire tumor en metastase. Alle mutaties leiden tot veranderingen in de aminozuursamenstelling van het genproduct en werden geïdentificeerd die een significante verandering met een hoge waarschijnlijkheid beïnvloeden het genproduct functie. (B) Een samenvatting van de chromosoomafwijkingen weergegeven over het gehele genoom van kanker beide tumoren. Dit geldt ook voor copy number variation (CNV) of verlies van heterozygositeit (LOH). De rode blokken geeft evenementen exclusief voor de primaire tumor of metastase. De groene blokjes geven evenementen om zowel de gemeenschappelijke. Het aantal events per chromosoom is opgenomen in elk blok. Pijlen geven LOH gebeurtenissen of weglatingen dat de p arm, q arm, of hele chromosoom omvatten. Rode pijlen geven chromosomale afwijkingen die exclusieve en groene pijlen zijn geven aan gebeurtenissen die gemeenschappelijk zijn.
Op de subset van schadelijke mutaties, voerden we bijkomende biologische pathway-analyse, literatuuronderzoek en vergelijking tegen de Cancer Genome Atlas gegevens beschikbaar voor diffuse maagkanker. Dit identificeerde een aantal bekende kankergenen en waarschijnlijk kanker-gerelateerde kandidaten met mutaties die waarschijnlijk een impact hebben op eiwit functie gehad. We gericht op een aantal kandidaat driver genen (Tabel 1) die eerder was aangetoond dat oncogeen potentieel of zijn bekende tumor suppressors met biallele veranderingen in de kanker genomes.Table 1 oncogenen Kanker met amplificaties of kanker drivers met biallele gebeurtenissen
Origin
bekend of kandidaat kanker bestuurder
biallele evenement
allelen wijziging 1
Mutatie of genomische aberratie
Chr

Chr positie of interval
allelen wijziging 2
Uniek aan de primaire
FGFR2 *
Amplification
6-voudige versterking
10
117820033-119748751
gemeenschappelijk voor de primaire tumor en metastase
CDH1
Ja
schrapping
Gedeeltelijke deletie van exon 9
16
68.847.326-68.847.403
kiembaanmutatie in CDH1
TP53
Yes
5 'splice plaats mutatie
Afwijkende splicing
17
7.578.370
hemizygoot verlies van 17p arm
Uniek aan de metastase
TGFBR2
Ja
Frameshift indel
stopcodon in exon 4
3
30.691.871
hemizygoot schrapping van wild-type TGFBR2
locus
PCDH7
Ja
Missense
S87R
4
30.723.305
hemizygoot schrapping van wild-type 4 arm
FERMT1
loci
Ja
Verlies van heterozygositeit
FERMT
1 gelegen in 20p12.3
20
FERMT
1 mutatie
BMP7
loci
Ja
Verlies van heterozygosity
BMP7
gelegen in 20q13.3
20
BMP7
mutatie
Chr. chromosoom
Copy aantal variaties en allelische onevenwichtigheden onderscheiden van de primaire tumor van de metastase
We merkten grotere schaal genomische afwijkingen dat de primaire onderscheiden van de metastase (figuren 2b en 3a). Dit omvatte copy number veranderingen en LOH events. Uniek aan de primaire tumor waren twee genomische amplificaties op chromosomen 5 en 10, en twee inversies op chromosomen 15 en 16 (aanvullende bestandsinformatie 1: Tabel S4). De chromosoom 10 amplificatie omvatte een 1,66 Mb interval. Bij het overwegen deleties of allelische onevenwichten, de enige belangrijke gebeurtenis die werd opgemerkt betrokken verlies van de p arm van chromosoom 17. Figuur 3 genetische divergentie van de ovariële metastase van de primaire maagkanker kritische kandidaat chauffeurs. De genomische positie van de mutatie, copy number variations (CNV) regio's of loss-of-heterozygositeit (LOH) intervallen worden blijkt uit de kankergenomen. Voor het chromosoom percelen, de Y-as duidt de respectieve positie chromosoom, zijn lengte in megabasen (MB) en ideogram aanduiding getoond links van het kopieaantal profiel. Schadelijke mutaties worden getoond als pijlen doos met het gen symbool. (A) Het genoom brede verspreiding van kankerspecifieke CNVs en LOH intervallen worden samengevat in alle chromosomen van de primaire tumor en metastase. (B) op chromosoom 3, de metastase had unieke biallele gebeurtenissen waarbij een schadelijke TGFBR2
mutatie en een genomische deletie die de andere allel zoals het duidelijkst gezien met LOH intervallen. Secundair aan genomische deleties, LOH blijkt een verschuiving in de minor allele frequentieverhouding waarde van -1 en correleert met een genomisch deletie. (C) op chromosoom 10, de FGFR2
gen in een genomisch gebied amplificatie wel alleen in de primaire en geen metastase. De amplificatie wordt genoteerd in een rode cirkel.
In tegenstelling tot de primaire tumor, de metastatische tumor had talrijke chromosomale schaal LOH evenementen en genomische deleties beïnvloeden 12 verschillende chromosomen, waarvan de meeste uniek zijn voor de metastatische tumor waren (figuur 2) . Dit omvatte meerdere verwijderingen en kopie neutrale LOH events die worden beschreven in Extra file 1: Tabel S3. Er werd een vijfvoudige genoomamplificatie in chromosoom 2, maar geen specifieke bekende genen bestonden in de getroffen interval. Er bevonden zich geen meetbare inter-chromosomale translocaties in de primaire tumor of metastase genomen. Andere kanker herschikkingen werden geïdentificeerd, maar niet wijzen op afwijkingen in elke kandidaat-bestuurder-genen (Extra file 1: Tabel S4). Er waren aanwijzingen van grootschalige genomische instabiliteit op basis van de onbalans in allelen analyse; chromosomen 14, 17, 20, en 22 alle betrokkenen het hele chromosoom.
Voor copy number afwijkingen en allelische onevenwichtigheden, identificeerden we exclusieve versus gemeenschappelijke gebeurtenissen tussen de primaire tumor en metastase. Het enige gemeenschappelijke genetische afwijking betrof de p-arm van chromosoom 17. Kortom, het ontbreken van overlap was indicatief voor significante genetische verschillen ten opzichte van de primaire tumor en metastase ondanks een gemeenschappelijke oorsprong zoals aangegeven met gedeelde mutaties in kritische tumor suppressors. Ondernemingen De genomische intervallen van LOH, aantal kopieën aberratie en herschikking gebeurtenissen werden vergeleken met de positie van gevalideerde genmutaties. Deze geïntegreerde analyse wees op een aantal genen die biallelische veranderingen die zowel verlies van het wildtype allel van een groot interval genomische aberratie en een mutant allel. De resultaten van genen met biallele treffers werden beschouwd dringende behoefte aan een loss-of-function betrokkenheid bij kanker (tabel 1) zijn.
Identificatie van kanker bestuurders gemeen de primaire tumor en metastase
Zowel de primaire als de metastase die kanker driver gebeurtenissen die waarschijnlijk essentieel voor tumorgenese in het kader van de initiële CDH1
mutatie (Tabel 1, Figuur 2) te zijn. Naast de kiemlijn CDH1
intronic mutatie, de tweede CDH1
allel hadden een somatische 77 bp genomisch deletie van een gedeelte van exon 9 dat het stroomafwaartse coderende gebieden beïnvloedt ook. De CDH1
somatische mutatie was identiek in zowel de primaire en uitgezaaide maagkanker genomen, blijk van een gemeenschappelijke genetische oorsprong en het verstrekken van sterke genetische bewijs dat deze bestuurder een cruciale rol in het ontstaan ​​van tumoren diffuse maag had. Mutaties die CDH1
exon 9 die verlies van eiwitexpressie zijn vaak waargenomen in diffuse maagkanker [18] - [20]. Deze exon aminozuursequentie van een vermoedelijk calcium bindingsplaats die waarschijnlijk belangrijk voor receptorfunctie Ondernemingen De primaire en metastatische tumor gedeeld biallele splitsingsdonorplaats mutatie. (C.559 +1 G > A) van de vijfde intron van TP53 Kopen en een chromosoom 17p LOH evenement omvat de TP53
locus (Extra file 1: figuur S1). De TP53
splicing mutatie onderbreekt RNA [21] en is een eerder gemeld kanker mutatie [22], [23]. De analyses van sporadische en erfelijke maagkanker hebben TP53
mutaties die gelijktijdig optreden met CDH1
mutatie [24], [25] vastgesteld. CDH1
inactivatie pariëtale cellen niet maagcarcinoom induceert, suggereert dat het verlies van CDH1
onvoldoende voor tumorinitiatie [26]. Echter, dubbele voorwaardelijke knock-out van CDH1 Kopen en TP53
induceert ontwikkeling van diffuse maagcarcinoom [26]. Interessant is dat de genomische interval van de LOH gebeurtenis die de TP53
locus was groter in de metastase opzichte van de primaire tumor. Dit zou hebben plaatsgevonden als gevolg van onafhankelijke genomische instabiliteit gebeurtenissen gezien de sterke selectie voor biallele verlies van TP53 functie.
FGFRis een voor beroep kanker bestuurder exclusief voor de primaire maagtumor
In de primaire tumor, was er een zesvoudige genomische amplificatie van een gebied van chromosoom 10 q arm en onder een interval van 1,66 Mb. Binnen deze genomische gebieden was een oncogeen kandidaat bestuurder FGFR2
ook wel de fibroblast groeifactor receptor 2 (figuur 3c). Dit werd bevestigd door meerdere methoden, waaronder sequentiebepaling, array-analyse, en de validatie door middel van kwantitatieve PCR. FGFR2 is een transmembraan receptor dat als onderdeel van een sleutel signaaltransductieroute reguleren weefselherstel en embryonale ontwikkeling bij een groot aantal andere functies [26].
De prevalentie van FGFR2
amplificatie valideren diffuse versus intestinale maagkanker , analyseerden we 37 diffuse en 27 intestinale subtype primaire maag tumor samples met digitale PCR [27]. Eerder hebben we aangetoond dat deze werkwijze diep gevoelig voor het detecteren kopieaantal aberratie zelfs in het kader van normale diploïde DNA verdunnen tumor DNA. Onze studie toonde FGFR2
amplificatie in vier van 37 (11%) diffuse tumormonsters, die afwezig zijn in de intestinale subtype monsters (figuur 4a) was. Figuur 4 Prevalentie van FGFR2 in menselijke maag-tumoren en haar bijdrage aan cellulaire proliferatie. (A) Sporadische maagkanker monsters werden onderzocht met kwantitatieve PCR digitale FGFR2 genomische kopij bepalen. Zwarte stippen stellen diffuse maagkanker. Rode stippen geven de intestinale subtype van maagkanker. (B) De genetische eigenschappen van de AGS (FGFR2
diploïde) en KatoIII (FGFR2 versterkte) maagkanker cellijnen worden getoond. (C) Procent overleving voor de AGS kanker cellijn wordt getoond met FGFR2 remmers van verschillende specificiteit. (D) De KatoIII diffuse maagkanker cellijn werd behandeld met FGFR2 remmers van verschillende specificiteit. De Y-as toont procent overleving versus of the X-as log concentraties. In alle panelen, foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde. Het verschil in percentage overleving van de cel tussen KatoIII en AGS cellen was statistisch significant (P Restaurant < 0,05). Op de drie hoogste concentraties van alle drugs, behalve Brivanib die alleen significant bij de hoogste concentratie was
Ter ondersteuning van haar rol als kandidaat bestuurder, FGFR2
amplificatie is aanwezig in een aantal maagkanker cellijnen [28], [29] en vervolgens gerapporteerd in verschillende gastrointestinale maligniteiten zoals slokdarm adenocarcinoom [30]. Bovendien behandelen van kankercellijnen met FGFR2 specifieke kleinmoleculige remmers of shRNAs leidt tot sterke groeiremming [28] suggereert een functionele rol voor FGFR2
amplificatie in de diffuse subtype.
Functionele analyse van de FGFR2 bestuurder combinatie met CDH1 en TP53
We identificeerden twee voorbeelden van primaire diffuse maagkanker met comorbiditeit van bekende en vermeende kanker drivers met CDH1
, TP53
en FGFR2
gezien in de index patiënt . Het eerste voorbeeld bevatte een diffuse maagkanker monster dat was een van de maag adenocarcinomen door TCGA geanalyseerd. Met de cBio TCGA portaal [10] identificeerden we een patiënt (TCGA-BR-6803) die eenzelfde complement van genetische afwijkingen in CDH1
, TP53
en FGFR2
had, die zijn eerder in kanker gezien in de COSMIC kanker mutatie repository. Dit omvatte het volgende: een missense mutatie in CDH1
(D254Y) die in drie andere vormen van kanker is beschreven; een missense mutatie (L130F) in TP53
wanneer deze mutaties in codon gemeld in 37 andere kankers; de FGFR2
amplificatie die wij en anderen hebben geïdentificeerd diffuse maagkanker.
Als tweede voorbeeld identificeerden we een menselijke diffuse maagkanker cellijn KatoIII, die een vergelijkbare samenstelling van genetische afwijkingen heeft op dezelfde kankergenen heeft als de primaire tumor van onze index patiënt. KatoIII een CDH1
mutatie leidt tot een intronsequentie insertie in het mRNA [31], [32], een TP53
mutatie leidt tot een volledige gen deletie [33] en de FGFR2
amplificatie [29] (Figuur 4b). Deze cellijn liet ons toe om het potentieel oncogene rol van de FGFR2
versterking in de specifieke genetische context van CDH1 Kopen en TP53
mutaties, vergelijkbaar met de primaire tumor van de index patiënt te beoordelen.
Om de bijdrage te bepalen van FGFR signalering neoplastische groei, behandelden wij KatoIII cellen met verschillende FGFR2 kleine molecule tyrosine kinase inhibitors (TKI), waaronder Brivanib, TKI258, Ponatinib en AZD4547 [34]. Als een controle, gebruikten we de maagkanker cellijn AGS die wild-type voor FGFR2
, CDH1
en TP53
, maar heeft mutaties in KRAS Kopen en PIK3CA
[35] ( figuur 4b). Alle FGFR2 remmers geïnduceerde celdood in KatoIII maar niet AGS cellen (figuur 4c en d). De meest krachtige van deze TKI's, AZD4547, heeft een IC 50 ongeveer 2 nM in KatoIII cellen en 39.580 nM in AGS cellen (figuur 4c en d). Elk van de remmers werd een statistisch significant lagere IC 50 in FGFR2 geamplificeerde KatoIII cellen vergeleken met niet- geamplificeerde FGFR2 AGS cellen op alle geteste concentraties (figuur 4c en d).
Daarentegen behandeling van KatoIII en AGS cellen met cytotoxische chemotherapeutische middelen zoals paclitaxel, 5-fluoruracil en carboplatin had geen significant effect op KatoIII of AGS lijnen hebben, met gelijke IC 50 van elk der (aanvullende bestandsinformatie 1: Tabel S7). Voor AZD4547, de 20.000-voudig verschil in gevoeligheid voor remmers FGFR suggereert dat FGF-signalering is een kritische bestuurder CDH1
geïnitieerde maag cellulaire proliferatie en dit TKI vertegenwoordigt een potentiële gerichte therapie in diffuse subtype kankers herbergen FGFR2
versterkingen.
biallele inactivatie van TGFBRis exclusief voor de ovariële metastase
genetische divergentie was duidelijk; Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4. Tabel S5. Tabel S6. Tabel S7. Figuur S1. Figuur S2. Figuur S3.

• Botulinum toxine in de maag vermindert submucosa gestimuleerde productie HCl bij ratten
• Voorspelling van metachrone meerdere primaire kanker na de curatieve resectie van maagkanker