l'evoluzione del tumore metastatico e modellazione organoide implicano TGFBR2as un driver cancro nel diffuso cancer

gastrica evoluzione del tumore metastatico e modellazione organoide implicano TGFBR2
come un driver di cancro nel cancro gastrico diffuso
Abstract
sfondo
cancro gastrico è la seconda -leading causa di decessi per cancro a livello mondiale, con malattia metastatica che rappresentano la prima causa di mortalità. Per identificare i conducenti candidati coinvolti nella oncogenesi e l'evoluzione del tumore, conduciamo una vasta analisi di sequenziamento del genoma della progressione metastatica in un tumore gastrico diffuso. Si tratta di un confronto tra un tumore primario da un ereditaria diffusa gastrica probandi sindrome di cancro e la sua ricorrenza come metastasi ovarica
. I risultati
Sia il tumore primario e delle metastasi ovarico hanno comune biallelica perdita-di-funzione sia del CDH1
e TP53
soppressori tumorali, indicando un'origine genetica comune. Mentre la mostra tumore primario amplificazione del 2 (FGFR2
) gene del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti, le metastasi manca in particolare FGFR2
amplificazione ma piuttosto possiede alterazioni bialleliche uniche del fattore di crescita trasformante-beta recettore 2 (TGFBR2
) , indicando il divergenti in vivo
evoluzione di un TGFBR2
-mutant popolazione clonale metastatico in questo paziente. Come TGFBR2
mutazioni non sono state precedentemente funzionalmente convalidati nel carcinoma gastrico, abbiamo modellato il potenziale metastatico di perdita TGFBR2 in un primario cultura organoide gastrica murino tridimensionale. Il TGFBR2
shRNA atterramento entro CDH1
- /-
; TP53
- /-.
Organoidi genera invasione in vitro
e robusto tumorigenicità metastatica in vivo
, confermando TGFBR2
attività soppressore delle metastasi
Conclusioni
Documentiamo la differenziazione metastatico e eterogeneità genetica del cancro gastrico diffuso e rivelare il potenziale ruolo metastatico del TGFBR2 perdita-di-funzione
. A sostegno di questo studio, applichiamo un metodo murino primario organoide cultura capace di ricapitolare in vivo
carcinoma gastrico metastatico. Nel complesso, si descrive un approccio integrato per identificare e validare funzionalmente driver cancro putativi coinvolti nella metastasi.
Sfondo
In tutto il mondo, l'adenocarcinoma gastrico è la quarta neoplasia più comune e la seconda causa di decessi per cancro tra gli uomini e le donne. Sulla base di caratteristiche istopatologiche peculiari, adenocarcinoma gastrico è classificato in sottotipi diffuse e intestinali [1]. In termini di istopatologia, diffusi tumori gastrici sono generalmente indifferenziata, hanno spesso anello caratteristiche delle cellule con sigillo e invasivo infiltrarsi normale tessuto dello stomaco. Al contrario, il sottotipo intestinale ha caratteristiche epiteliali e forma masse tumorali discreti simili al cancro del colon. Diffuse cancro gastrico ha una maggiore incidenza di malattia metastatica e una prognosi generalmente peggiore rispetto al sottotipo intestinale [2], [3]. Attualmente, le analisi genomiche di cancro gastrico diffuso hanno coinvolto un piccolo numero di campioni tra cui un recente studio condotto dal Genome Atlas Progetto Cancro (TCGA) e un intero sondaggio sequenziamento del genoma di una serie di tumori gastrici diffusi [4]. Tuttavia, ci sono pochi, se del caso, gli studi che dettaglio l'evoluzione del cancro gastrico metastatico; tumori metastatici sono in genere assenti dalle indagini cancro genomica su larga scala come TCGA. Nel complesso, poco si sa circa il processo e tumorale oncogeno evoluzione del carcinoma gastrico metastatico, nonostante la sua fondamentale importanza clinica [5].
In ereditaria diffusa cancro gastrico (HDGC), mutazioni germinali in CDH1
(vale a dire, E- caderina) conferisce un rischio di vita il 70% di sviluppare il cancro gastrico diffuso [6], [7]. Il CDH1
gene soppressore del tumore codifica E-caderina, una glicoproteina transmembrana che media l'adesione cellula-cellula calcio-dipendente. Cambiamenti nella funzione CDH1 influenzano la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) che è stato implicato come giocare un ruolo nella tumorigenesi. Studi di tumori individui hdgc 'colpiti forniscono una opportunità unica per determinare i driver essenziali di cancro gastrico diffuso nel contesto CDH1
perdita di funzione. prove a sostegno del ruolo della CDH1
in sporadici tumori gastrici diffuse comprende l'osservazione che il 50% contiene CDH1
mutazioni o ipermetilazione del CDH1
promotore [8], [9]. Un recente sondaggio intero sequenziamento del genoma del cancro gastrico diffuso anche identificato frequenti CDH1
mutazioni come l'evento più comune conducente [4]. I dati di cancro gastrico TCGA mostrano anche un'elevata frequenza di CDH1
mutazioni somatiche [10]. Significativamente meno si sa circa l'identità e il ruolo di driver concomitanti che contribuiscono a diffondere la metastasi gastrica.
Qui, riportiamo uno studio del processo evolutivo metastatico nel cancro gastrico diffuso. Il nostro obiettivo era quello di individuare noti e candidati piloti che delineano la progressione del tumore durante la metastasi. Abbiamo effettuato un'analisi approfondita sequenziamento del genoma di un tumore gastrico primario e delle metastasi da un individuo con una linea germinale CDH1
mutazione (Figura 1) che ha presentato con una primaria gastrica, seguita dopo 3 anni di metastasi nell'ovaio di sinistra. Data la mutazione germinale esistente in CDH1,
il genoma del cancro richiede solo un secondo allelica colpire tramite una aberrazione genetica somatica, come è dimostrato nel tumore da questa persona. Poiché l'evento iniziale conducente cancro è noto, genomi del cancro mendeliana forniscono una rara e altamente informativo `esperimento della natura 'che offre l'opportunità di delineare genetica somatica di metastasi. analisi di sequenziamento del genoma di entrambi i tumori rivelato evidenza di origine comune si basa sulle mutazioni condivise ma maggiore diversità genomica visto sia a livello di mutazioni e vasta sbilanciamento allelico e copia aberrazioni numero per il metatasis. Figura 1 famiglia e la storia clinica di un cancro gastrico mendeliana diffusa. Il pedigree del paziente indice 525 (III-1) è raffigurato. tipi di tumore sono indicati da colori tra cui verde per il cancro al pancreas, rosso per il cancro gastrico diffuso, e giallo per il cancro al seno. Il paziente ha presentato con il suo cancro gastrico primaria all'età di 37 anni. Tre anni dopo ha presentato con un disagio addominale. TC con mdc del bacino individuato una massa ovaio sinistro (cerchio giallo), che è stato confermato il biopsia per essere una diffusa metastasi del cancro gastrico (cioè, Krukenberg tumore). Nel corso dell'evoluzione tumorale metastatica, un certo numero di eventi di driver cancro candidato noti e delinea l'evoluzione del tumore e divergenza genetica delle metastasi del tumore primario.
Abbiamo determinato se i driver candidati questa progressione metastatica erano sufficienti a riprodurre diffusa tumore gastrico. La nostra metodologia di modellazione cancro utilizzato in vitro
organoidi gastriche e permette di ingegnerizzare il contesto conducente genetica di questi tumori e studiare il processo di evoluzione metastatica e oncogeno divergenza percorso. L'integrazione di analisi genetica e la modellazione biologica, abbiamo determinato il ruolo indipendente della TGFBR2
(fattore di crescita trasformante-β receptor 2) nella oncogenesi del cancro gastrico diffuso. La nostra modellazione cancro sperimentale si basa su una interfaccia aria-liquido per la cultura intestinale principale del mouse che contiene sia gli elementi epiteliali e mesenchimali, ricapitola in modo accurato la proliferazione di lungo periodo, la differenziazione multilineare, l'/Notch-dipendente nicchia delle cellule staminali Wnt, e la peristalsi [11]. Abbiamo riportato un sistema analogo primario gastrica organoide cultura che riassume con precisione multilineare differenziazione epiteliale e elementi stromali [12]. Recentemente, abbiamo raggiunto robusta in vitro
oncogeno trasformazione di gastrica primaria, del colon, del pancreas e organoidi tramite mutazioni in Kras
e Trp53
, che inducono displasia di alto grado e l'invasione in vitro
con adenocarcinoma su Il trapianto sottocutaneo in topi [13]. Dimostriamo la validazione funzionale dei driver candidato cancro gastrico metastasi da cancro studi genomici profilatura, concentrandosi sulla modellazione della TGFBR2
driver come prova di principio.
Risultati
diffuso carcinoma gastrico metastatico e progressione
All'età di 37 anni, il paziente indice (525) è stato diagnosticato in stadio III (T3N1M0) scarsamente differenziato adenocarcinoma gastrico diffuso (Figura 1). Il suo 42-year-old sorella è stato diagnosticato un adenocarcinoma gastrico diffusa 2 mesi prima. Basato sulla storia familiare di cancro gastrico e il insolitamente giovane età di esordio, si è sottoposta a linea germinale CDH1
test di mutazione. Il paziente e sua sorella sono stati trovati ad avere una linea germinale sito di splice mutazione in introne 10 (c.1565 + 2insT). Questa mutazione germinale è stato successivamente riportato in un'altra famiglia con il cancro ereditario diffuso gastrica (HDGC) [14]. Il paziente è stato sottoposto a gastrectomia totale per rimuovere il tumore primario ed è stato trovato per avere un unico metastasi linfonodali. Ha ricevuto il trattamento adiuvante standard con la chemioterapia combinata (cisplatino e 5-fluorouracile) e le radiazioni. Tre anni dopo la sua presentazione iniziale, il paziente ha riferito progressiva pienezza addominale inferiore. Una tomografia computerizzata (TC) ha dimostrato una grande massa pelvica coerente con metastasi ovarica sinistra (Figura 1). Successivamente, il paziente è stato sottoposto laparotomia con annessiectomia bilaterale e la biopsia della massa pelvica. studi patologici hanno dimostrato adenocarcinoma metastatico coinvolge dell'ovaio, altrimenti denominato un tumore Krukenberg, con lo stesso aspetto istologico del tumore primario. Uno studio ha riportato che tra cancro gastrico diffuso con diffusione metastatica, l'ovaio era un sito metastatico nel 28,8% dei casi [15]. Così, l'ovaio è un luogo comune per la malattia metastatica.
Cancer Genome analisi di sequenziamento
Sia dell'esoma e tutto il sequenziamento del genoma abbinato-end sono state eseguite sul tumore primario, metastasi alle ovaie, e il tessuto normale che comprendeva sangue e gastrico normale tessuti (sui file 1: Tabella S1). Tissue dalla metastasi linfonodali non era disponibile per l'analisi. metodi di sequenziamento multipli sono stati impiegati per compensare la misura di normale miscela stromale, un risultato diretto della invasività infiltrante della diffusa sottotipo cancro gastrico. Abbiamo determinato l'entità del normale miscela genoma e corretta per l'inserimento del DNA normale (sui file 1: Metodi). Data la complessità dei campioni di tumore, abbiamo condotto una serie supplementare di sequenziamento mirato per confermare la presenza di mutazioni e altre aberrazioni genetiche che si sono verificati negli esoni, confini esone vicino o promotori.
Nel complesso, abbiamo ottenuto superiore a 100 × copertura media per ogni exome e generalmente fatto affidamento sui dati dell'esoma per la scoperta di codifica mutazioni regione. Per tutto il sequenziamento del genoma, abbiamo avuto maggiore di 60 × copertura media per il campione del genoma intero tumore primario e 30 × per il genoma metastatico. L'intero sequenziamento del genoma è stato utilizzato per l'identificazione su scala aberrazioni genetiche più grandi come variazione del numero di copie (CNV), squilibri alleliche, riarrangiamenti, e altre classi di riarrangiamenti strutturali. Dopo l'allineamento, abbiamo condotto variante chiamata per identificare mutazioni somatiche e altre classi di aberrazioni genetiche. Ciò ha incluso mutazioni somatiche, inserimento-delezioni (indels), CNV, con perdita di eterozigosi (LOH regioni), e riarrangiamenti di cancro (file aggiuntivo 1: Tabella S3 e S4 Tabella). Come controllo per singolo nucleotide variante chiamata, abbiamo genotipizzati i campioni con Affymetrix 6.0 polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) array; abbiamo confrontato i genotipi di SNPs identificati dai dati di sequenza. La concordanza di exome e l'intero genoma SNP dati ai dati di matrice è stata del 99%.
Coding mutazioni regione e validazione con sequenziamento profondo
Abbiamo identificato le mutazioni che si sono verificati negli esoni e le mutazioni introniche a meno di 100 basi del confine esone e risultati sono riassunti nel file aggiuntive 1: Tabella S2. Come notato in precedenza, i campioni di tumore avevano composizione complessa che ha ridotto la copertura sequenza di alcune mutazioni. Si è proceduto con una serie supplementare di sequenziamento mirato per convalidare queste mutazioni e determinare la loro presenza in entrambi i tumori. Abbiamo progettato un test per una profonda resequencing mirata che ha coperto circa 300 basi in tutto il specifici loci mutazione (sui file 1: Tabella S5). La copertura media sequenziamento mirato per ciascuna mutazione putativa o loci era 278 × per la normale, 251 × per il tumore primario e 152 × per la metastasi.
Tra i due tumori, abbiamo convalidato indipendentemente un totale di 77 mutazioni che si sono verificati all'interno o prossimale esoni (file aggiuntivo 1: Metodi e Tabella S5). aberrazioni genetiche convalidati inclusi: (1) le mutazioni non-sinonime, (2) mutazioni sinonimi, (3) inserimenti, o (4) eliminazioni. Con i dati di sequenziamento mirato, abbiamo determinato la frequenza di mutazione allelica (MAF) tra il tumore primario e delle metastasi per ogni mutazione. Questo comporta la determinazione della frazione di una sequenza letto con una mutazione in confronto alla sequenza di riferimento legge. Siamo stati in grado di identificare quali mutazioni erano comuni o esclusivo per il tumore primario contro la metastasi. Tra le 77 mutazioni convalidati, la distribuzione era tale che le mutazioni erano generalmente unica sia per il tumore primario o metastatico sito. Ad esempio, il tumore primario aveva otto mutazioni che non erano presenti in metastasi, mentre la metastasi aveva 37 mutazioni non presenti nel tumore primario. Comune a entrambi i tumori erano 32 mutazioni.
Data l'intervallo di tre anni prima della rilevazione delle metastasi, vi è la possibilità che le mutazioni specifiche metastasi verificati indipendentemente dal tumore primario. Le mutazioni specifiche per il tumore primario che non erano presenti nella metastasi ovarico potrebbe essere stato il risultato di una deriva genetica casuale. Le mutazioni comuni ad entrambi indicano una origine comune, ma la tempistica esatta della differenziazione tra i due tumori è meno chiaro da questi riscontrate mutazioni con minore MAF. Un sottoinsieme di questi geni avevano valori elevati MAF, indicando una maggiore probabilità di essere presente in tutte le popolazioni clonali nel tumore primario o metastasi. Come descriveremo in seguito, questi geni sono stati una priorità per i test più sperimentale organoidi gastrici.
Mutazioni che interessano la funzione del gene
Tra le mutazioni che sono stati convalidati all'esterno, ci siamo concentrati sulla sottoinsieme di mutazioni che portano alla amino acidi sostituzioni, stop prematuro codoni e indels che hanno alterato la griglia di lettura aperta. Successivamente, abbiamo determinato se queste mutazioni codificanti erano potenzialmente deleteri per la funzione del gene utilizzando una serie di algoritmi di predizione come Polyphen [16] e SIFT [17], tra gli altri. Sulla base delle informazioni MAF per ciascuna mutazione, abbiamo determinato se queste mutazioni con un possibile impatto deleterio sui prodotti genici erano comuni o esclusivo al tumore primario e delle metastasi (Figura 2). Figura 2 Confronto delle aberrazioni genetiche nel tumore primario e delle metastasi. Comune contro
esclusivi aberrazioni genetiche vengono confrontati tra i due genomi tumorali. (A) sono elencati geni con mutazioni codificanti avere un potenziale impatto deleterio. Questi geni sono classificati in base al fatto che siano esclusivi (caratteri rossi) o comuni (caratteri verdi) per il tumore primario e delle metastasi. Le mutazioni tutto portare a cambiamenti nella composizione aminoacidica del prodotto del gene e sono stati identificati per avere un'alterazione significativa con un'alta probabilità di influenzare la funzione del prodotto del gene. (B) Una sintesi delle aberrazioni cromosomiche è mostrato in tutto l'intero genoma del cancro di entrambi i tumori. Questo include variazione del numero di copie (CNV) o la perdita di eterozigosi (LOH). I blocchi rossi indicano eventi esclusivi al tumore primario o metastasi. I blocchi verdi indicano eventi comuni ad entrambi. Il numero di eventi per cromosoma è presente in ogni blocco. Le frecce indicano eventi LOH o soppressioni che comprendono il braccio p, q il braccio, o un intero cromosoma. Le frecce rosse indicano le aberrazioni cromosomiche che sono le frecce esclusivi e verdi indicano gli eventi che sono comuni. recensioni sul sottoinsieme di mutazioni deleterie, abbiamo condotto ulteriore analisi percorso biologico, revisione della letteratura e confronto con i dati di Cancer Genome Atlas disponibili per il cancro gastrico diffuso. Questo ha identificato una serie di geni del cancro conosciuti e probabili candidati correlati al cancro, con mutazioni che probabilmente hanno avuto un impatto sulla funzione della proteina. Ci siamo concentrati su una serie di geni macchinista (Tabella 1) che era stato precedentemente dimostrato di avere potenziali o erano noti soppressori tumorali oncogeni con variazioni biallelici presenti nelle cancro genomes.Table 1 oncogeni cancro con amplificazioni o driver cancro con eventi biallelici
origine
nota o driver di cancro candidato
evento biallelica
allelica alterazione 1
mutazione o aberrazioni genomiche
Chr
posizione
Chr o intervallo
allelica alterazione 2
unico alla
FGFR2 primaria *
amplificazione
6 volte l'amplificazione
10
117820033 - 119748751
comune per il tumore primario e delle metastasi
CDH1
Sì
soppressione
delezione parziale dell'esone 9
16
68.847.326-68.847.403
Linea germinale mutazione in CDH1
TP53
Sì
5 'splicing sito di mutazione
Aberrant splicing
17
7.578.370
emizigote perdita del braccio 17p
unico per le metastasi
TGFBR2
Sì
Frameshift indel
stop codone nell'esone 4 3
30.691.871
eliminazione emizigote di wild-type TGFBR2
locus
PCDH7
Sì
Missenso
S87R 4
30.723.305
eliminazione emizigote di wild-type 4 braccio
FERMT1
loci
Sì
perdita di eterozigosi
FERMT
1 trova nel 20p12.3
20
FERMT
1 mutazione
BMP7
loci
Sì
Perdita di eterozigosi
BMP7
situato in 20q13.3
20
BMP7
mutazione
Chr. cromosoma
variazioni del numero di copie e gli squilibri alleliche che contraddistinguono il tumore primario dal metastasi
Abbiamo notato aberrazioni genomiche scala più grande che differenziano il primario dal metastasi (figure 2b e 3a). Ciò ha incluso copia cambiamenti numerici ed eventi LOH. Unico per il tumore primario erano due amplificazioni genomiche sui cromosomi 5 e 10, e due inversioni sui cromosomi 15 e 16 (sui file 1: Tabella S4). L'amplificazione cromosoma 10 ha coperto un intervallo di Mb 1,66. Quando si considera delezioni o squilibri alleliche, l'unico evento che è stato notato comportato una perdita del braccio p del cromosoma 17. Figura 3 divergenza genetica delle metastasi ovarica dal cancro gastrico primaria per i conducenti di candidati critiche. La posizione genomica della mutazione, copia variazioni del numero (CNV) regioni o perdita di eterozigosi intervalli (LOH) sono indicati dai genomi del cancro. Per le trame cromosomiche, l'asse Y designa posizione con la rispettiva cromosoma, la sua lunghezza in megabasi (MB) e denominazione ideogramma mostrate a sinistra del profilo numero di copie. mutazioni deleterie sono mostrate come frecce in scatola con il simbolo del gene. (A) L'ampia distribuzione genoma di intervalli CNV e LOH cancro-specifica sono riassunti in tutti i cromosomi per il tumore primario e delle metastasi. (B) sul cromosoma 3, la metastasi ha avuto eventi bialleliche unici che coinvolgono un deleterio TGFBR2
mutazione e una delezione genomica che colpisce l'altro allele come si è visto più chiaramente con intervalli di LOH. Secondario per delezioni genomiche, LOH è dimostrato come un cambiamento in minore allelica valore del rapporto di frequenza di -1 e correla con una delezione genomica. (C) nel cromosoma 10, il FGFR2
gene era situata in una regione di amplificazione genomica visto solo nel primario e non la metastasi. L'amplificazione viene rilevato in un cerchio rosso.
In contrasto con il tumore primario, il tumore metastatico aveva eventi LOH numerosi scala cromosomico e delezioni genomiche incidono 12 diversi cromosomi, la maggioranza dei quali erano unici al tumore metastatico (Figura 2) . Ciò ha incluso delezioni multiple e copiare eventi LOH neutri che sono dettagliate nel file aggiuntive 1: Tabella S3. C'era un cinque volte l'amplificazione genomica nel cromosoma 2, ma non specifici geni noti esisteva nell'intervallo interessata. Non ci sono stati traslocazioni cromosomiche inter-rilevabili in entrambe le tumore primario o genomi metastasi. Altri riarrangiamenti di cancro sono stati identificati, ma non puntano verso le aberrazioni in qualsiasi geni macchinista (file aggiuntivo 1: Tabella S4). Ci sono state indicazioni di larga scala instabilità genomica basata su analisi squilibrio allelica; cromosomi 14, 17, 20, 22 e tutti i soggetti coinvolti l'intero cromosoma.
per la copia aberrazioni numero e gli squilibri alleliche, abbiamo identificato esclusivo rispetto a eventi comuni tra il tumore primario e delle metastasi. L'unica aberrazione genetica comune coinvolto il braccio p del cromosoma 17. In generale, la mancanza di sovrapposizione è stata indicativa di una significativa divergenza genetica dal tumore primario e delle metastasi, nonostante una comune origine, come indicato da mutazioni condivise in soppressori tumorali critici.
Il genomico intervalli della LOH, numero della copia aberrazione ed eventi riassestamento sono stati confrontati con la posizione di mutazioni geniche validate. Questa analisi integrata indicò una serie di geni che avevano alterazioni bialleliche che coinvolgono sia una perdita di allele wild-type da una grande aberrazione genomica intervallo e un allele mutante. I risultati per geni con colpi bialleliche sono stati considerati come forti candidati per un coinvolgimento perdita-di-funzione nel cancro (Tabella 1).
Identificazione di driver di cancro comune per il tumore primario e delle metastasi
Sia il primario e il metastasi conteneva eventi conducente cancro che avrebbero potuto essere critica per tumorigenesi nel contesto iniziale CDH1
mutazione (Tabella 1, Figura 2). Oltre alla linea germinale CDH1
intronico mutazione, la seconda CDH1
allele aveva una somatica 77 bp delezione genomica di una porzione dell'esone 9 che colpisce le regioni codificanti a valle. Il CDH1
mutazione somatica era identico in entrambi i genomi di cancro gastrico primari e metastatici, dimostrando una origine genetica comune e fornendo una forte evidenza genetica che questo driver ha avuto un ruolo fondamentale nel diffuso tumorigenesi gastrica. Le mutazioni che interessano CDH1
esone 9 che portano alla perdita di espressione della proteina sono stati spesso rilevati nel tumore gastrico diffuso [18] - [20]. sequenza aminoacidica di questo esone è un sito legante il calcio putative che probabilmente importante per la funzione del recettore
Il tumore primario e metastatico anche condiviso biallelica splice donatore sito di mutazione. (c.559 + 1G > A) del quinto introne TP53
e un evento LOH cromosoma 17p comprende locus il TP53
(sui file 1: Figura S1). Il TP53
splicing mutazione interrompe splicing dell'RNA [21] ed è una mutazione del cancro riportato in precedenza [22], [23]. Le analisi di tumori gastrici sporadici ed ereditari hanno identificato TP53
mutazioni che si verificano in concomitanza con CDH1
mutazione [24], [25]. CDH1
inattivazione in cellule parietali gastriche non induce carcinoma gastrico, il che suggerisce che la perdita di CDH1
è insufficiente per l'iniziazione del tumore [26]. Tuttavia, doppio knockout condizionale di CDH1
e TP53
induce lo sviluppo di carcinoma gastrico diffuso [26]. È interessante notare che l'intervallo genomico dell'evento LOH influenzare il TP53
locus era maggiore nelle metastasi rispetto al tumore primario. Questo potrebbe essersi verificato a causa della instabilità genomica eventi indipendenti data la forte selezione per la perdita della funzione biallelica TP53.
FGFRis un driver cancro perseguibile esclusiva al primario gastrica tumore
Nel tumore primario, c'è stata una genomica sei volte l'amplificazione di una regione del cromosoma 10 braccio q e coperto un intervallo di 1,66 Mb. All'interno di questo regioni genomiche era un FGFR2 oncogeno macchinista
indicato anche come la crescita dei fibroblasti fattore recettore 2 (Figura 3c). Ciò è stato confermato con diversi metodi, tra cui il sequenziamento, analisi serie, e la convalida mediante PCR quantitativa. FGFR2 è un recettore transmembrana che agisce come parte di un percorso chiave di trasduzione del segnale che regola la riparazione dei tessuti e lo sviluppo embrionale tra una miriade di altre funzioni [26].
Per convalidare la prevalenza di FGFR2
amplificazione diffondere contro i tumori gastrici intestinale , abbiamo analizzato 37 diffusa e 27 principali campioni di tumore gastrico sottotipo intestinale con PCR digitale [27]. In precedenza, abbiamo dimostrato che questo metodo è profondamente sensibile per la rilevazione del numero di copie aberrazione, anche nel contesto della normale DNA diploide del DNA diluizione del tumore. Il nostro studio ha dimostrato FGFR2
l'amplificazione in quattro dei 37 (11%) campioni di tumore diffuso, che era assente nei campioni sottotipo intestinale (Figura 4a). Figura 4 La prevalenza di FGFR2 nei tumori gastrici umani e il suo contributo alla proliferazione cellulare. (A) sporadici campioni di cancro gastrico sono stati valutati mediante PCR quantitativa digitale per determinare il numero FGFR2 genomica copia. I punti neri rappresentano diffusi tumori gastrici. I puntini rossi indicano il sottotipo intestinale di cancro gastrico. (B) le caratteristiche genetiche del AGS (FGFR2
diploide) e KatoIII (FGFR2 amplificato) linee cellulari di cancro gastrico sono mostrati. (C) la sopravvivenza per cento per la linea di cellule di cancro AGS è mostrato con inibitori FGFR2 di diversa specificità. (D) La KatoIII diffusa linea di cellule di cancro gastrico è stato trattato con inibitori FGFR2 di diversa specificità. L'asse Y rappresenta per cento la sopravvivenza contro
l'asse X con concentrazioni di log. In tutti i pannelli, le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. La differenza nella sopravvivenza delle cellule per cento tra le cellule KatoIII e AGS era statisticamente significativa (P
< 0,05). Ai tre più alte concentrazioni di tutte le droghe, ad eccezione Brivanib che era solo significativo a più alta concentrazione
A sostegno della sua ruolo di macchinista, FGFR2
amplificazione è presente in un certo numero di linee di cellule di cancro gastrico [28], [29] e successivamente riportati in diversi tumori gastrointestinali come adenocarcinoma esofageo [30]. Inoltre, il trattamento di linee cellulari tumorali con piccole molecole inibitrici specifici FGFR2 o shRNAs porta alla inibizione della crescita potente [28] suggerendo un ruolo funzionale per FGFR2
l'amplificazione nel sottotipo diffuso. Analisi
funzionale del driver FGFR2 in combinazione con CDH1 e TP53
Abbiamo identificato due esempi di un cancro gastrico diffuso primaria con co-occorrenza dei driver di cancro noti e presunti coinvolgono CDH1
, TP53
, e FGFR2
come si vede nelle paziente indice . Il primo esempio ha coinvolto un campione di cancro gastrico diffuso che è stato tra i adenocarcinoma gastrico analizzati da TCGA. Utilizzando il portale cBio TCGA [10], abbiamo identificato un paziente (TCGA-BR-6803) che ha avuto un simile complemento di aberrazioni genetiche in CDH1
, TP53
, e FGFR2
, ognuno dei quali sono stati precedentemente descritto nel cancro come visto nel repository cancro mutazione COSMIC. Ciò ha incluso il seguente: una mutazione missense nel CDH1
(D254Y) che è stato descritto in altre tre tipi di cancro; una mutazione missenso (L130F) in TP53
cui mutazioni in questo codone sono stati segnalati in 37 altri tipi di tumore; il FGFR2
di amplificazione che noi e altri hanno identificato nel cancro gastrico diffuso.
Come secondo esempio, abbiamo identificato un essere umano diffusa gastrica linea di cellule di cancro, KatoIII, che ha una composizione simile di aberrazioni genetiche che colpiscono gli stessi geni del cancro come il tumore primario della nostra paziente indice. KatoIII ha un CDH1
mutazione che porta ad un inserimento sequenza intronic nel mRNA [31], [32], un TP53
mutazione che porta ad una delezione completa del gene [33] e la FGFR2
amplificazione [29] (Figura 4b). Questa linea cellulare ha permesso di valutare il potenziale ruolo oncogenico del FGFR2
di amplificazione nello specifico contesto genetico di CDH1
e TP53
mutazioni, simile al tumore primario del paziente indice.
Per determinare il contributo di FGFR segnalazione alla crescita neoplastica, abbiamo trattato le cellule KatoIII con diverse piccole molecole inibitori FGFR2 delle tirosin-kinasi (TKI), tra cui Brivanib, TKI258, PONATINIB, e AZD4547 [34]. Come controllo, abbiamo utilizzato la linea cellulare cancro gastrico AGS, che è di tipo selvatico per FGFR2
, CDH1
, e TP53
, ma ha mutazioni in KRAS
e PIK3CA
[35] ( Figura 4b). Tutti gli inibitori FGFR2 indotta morte cellulare in KatoIII ma non le cellule AGS (Figura 4C e D). Il più potente di questi TKI, AZD4547, ha un IC 50 di circa 2 nm nelle cellule KatoIII e 39.580 nM nelle cellule AGS (Figura 4C e D). Ciascuno degli inibitori dimostrato una inferiore, statisticamente significativa IC 50 in cellule KatoIII FGFR2-amplificato rispetto alle cellule AGS non FGFR2-amplificato a tutte le concentrazioni testate (Figura 4c ed).
Al contrario, il trattamento di KatoIII e cellule AGS con agenti chemioterapici citotossici come il paclitaxel, 5-fluorouracile e carboplatino non hanno avuto un effetto significativo su entrambi KatoIII o linee AGS, con simili IC 50 identificate in ciascuna (sui file 1: Tabella S7). Per AZD4547, la differenza di 20.000 volte in sensibilità agli inibitori FGFR suggerisce che la segnalazione FGF è un driver fondamentale per CDH1
iniziati con la proliferazione cellulare gastrica e questo TKI rappresenta un potenziale terapia mirata nei tumori sottotipo diffuse ospitano
FGFR2 amplificazioni.
biallelica inattivazione di TGFBRis esclusivo al metastasi ovarica
divergenza genetica era evidente; Tabella S1. Tabella S2. Tabella S3. Tabella S4. Tabella S5. Tabella S6. Tabella S7. Figura S1. Figura S2. Figura S3.

• La tossina botulinica in sottomucosa gastrica riduce la produzione stimolata HCl nei ratti
• Pronostico metacroni multipli tumori primari in seguito alla resezione curativa del cancro gastrico