evolução do tumor metastático e modelagem organ�de implicam TGFBR2as um motorista de câncer em cancer

gástrico difuso evolução do tumor metastático e modelagem organ�de implicam TGFBR2
como motorista de câncer no câncer gástrico difuso da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é a segunda -leading causa de mortes por câncer globais, com doença metastática que representam a principal causa de mortalidade. Para identificar motoristas candidatos envolvidos na oncogênese e evolução do tumor, realizamos uma extensa análise de sequenciamento do genoma de progressão metastática em um câncer gástrico difuso. Isto envolve uma comparação entre um tumor primário a partir de uma pró-banda difusa hereditária síndrome cancro gástrico e a sua recorrência como uma metástase do ovário.

Resultados Tanto o tumor primário e metástases do ovário tem perda de função de ambos o CDH1 bialélico comum Comprar e TP53
supressores de tumor, indicando uma origem genética comum. Enquanto a principal exposições tumorais amplificação do gene 2 (FGFR2
) receptor do fator de crescimento de fibroblastos, a metástase carece nomeadamente FGFR2
amplificação mas possui alterações bialélicos exclusivas de transformar receptor do factor de crescimento beta 2 (TGFBR2
) , indicando a divergente in vivo
evolução de um TGFBR2
população clonal metastático -mutant neste paciente. Como TGFBR2
mutações não foram previamente validados funcionalmente no câncer gástrico, modelamos o potencial metastático de perda TGFBR2 em uma cultura gástrica murina tridimensional primária organ�de. O TGFBR2
shRNA knockdown dentro CDH1
- /-
; TP53
- /-.
Organóides gera invasão in vitro Comprar e tumorigenicidade metastático robusta in vivo
, confirmando TGFBR2
atividade metástase supressor
Conclusões
Nós documentar o metastático diferenciação e heterogeneidade genética do cancro gástrico difuso e revelar o papel potencial metastático de TGFBR2
perda de função. Em apoio a este estudo, aplicamos um método organ�de primária murino cultura capaz de recapitular no câncer gástrico metastático vivo
. No geral, nós descrevemos uma abordagem integrada para identificar e validar funcionalmente motoristas câncer putativos envolvidos na metástase.
Fundo
Worldwide, adenocarcinoma gástrico é a quarta neoplasia maligna mais comum ea segunda principal causa de mortes por câncer entre homens e mulheres. Com base em características histopatológicas distintas, adenocarcinoma gástrico é classificado em subtipos difusas e intestinal [1]. Em termos de histopatologia, cancros gástricos difusos são geralmente indiferenciado, muitas vezes têm características anel de sinete celular e invasiva infiltrar tecido do estômago normal. Em contraste, o subtipo intestinal tem características epiteliais e formam massas tumorais discretas semelhantes a cancro do cólon. Cancro gástrico difuso tem uma maior incidência de doença metastática e um prognóstico pior geralmente comparado com o subtipo intestinal [2], [3]. Atualmente, as análises genômicas de câncer gástrico difuso envolveram um pequeno número de amostras, incluindo um estudo recente do Projeto Genoma Atlas Câncer (TCGA) e uma pesquisa de sequenciamento do genoma inteiro de um conjunto de tumores difusos gástricas [4]. No entanto, existem poucas, se alguma, os estudos que detalham a evolução metastática do cancro gástrico; tumores metastáticos são tipicamente ausente de pesquisas de câncer genômicos em larga escala, tais como TCGA. No geral, pouco se sabe sobre o processo e tumor oncogênico evolução do cancro gástrico metastático apesar de sua grande importância clínica [5].
Em difuso hereditário câncer gástrico (HDGC), mutações germinativas em CDH1
(isto é, E- caderina) conferem um risco de vida de 70% de desenvolver câncer gástrico difuso [6], [7]. O CDH1
gene supressor de tumor codifica E-caderina, uma glicoproteína transmembranar que medeia a adesão célula-célula dependente de cálcio. As alterações na função CDH1 afectar a transição epitelial-mesenquimal (EMT) que tem sido implicado como desempenhando um papel na tumorigénese. Estudos de tumores dos indivíduos afetados hdgc oferecem uma oportunidade única para determinar os drivers fundamentais de um câncer gástrico difuso no contexto da CDH1
perda de função. Apoiando evidência do papel da CDH1
em cancros gástricos difusos esporádicos inclui a observação de que 50% contêm CDH1
mutações ou hipermetilação do promotor CDH1
[8], [9]. Uma recente pesquisa de sequenciamento do genoma inteiro do câncer gástrico difuso também identificou CDH1
mutações frequentes como o evento driver mais comum [4]. Os dados de câncer gástrico TCGA também mostram uma elevada frequência de CDH1
mutações somáticas [10]. Muito menos se sabe sobre a identidade eo papel de controladores de co-ocorrência que contribuem para difundir a metástase gástrico.
Relata-se um estudo do processo evolutivo metastático em câncer gástrico difuso. Nosso objetivo foi identificar os drivers conhecidos e candidatos que delineiam a progressão do tumor durante a metástase. Foi realizada uma extensa análise de sequenciamento do genoma de um tumor gástrico primário e metástase de um indivíduo com um CDH1 germinal
mutação (Figura 1) que apresentou com um primário gástrica, seguido após 3 anos de metástase no ovário esquerdo. Dada a mutação da linha germinativa existente no CDH1, of the genoma do cancro requer apenas um segundo alélica atingido através de uma aberração genética somática, como é demonstrado no tumor a partir deste indivíduo. Porque o evento inicial motorista câncer é conhecido, genomas do câncer mendeliana proporcionar uma experiência rara e altamente informativo `da natureza" que fornece uma oportunidade para delinear genética somáticas de metástase. análise de sequenciação do genoma de ambos os tumores revelou evidências de uma origem comum com base nas mutações partilhados, mas uma maior diversidade genômica visto tanto a nível de mutações, bem como extensa desequilíbrio alélicas e copiar aberrações numéricas para o metatasis. Figura 1 Família e da história clínica de um câncer gástrico difuso mendeliana. A linhagem do paciente índice 525 (III-1) é representado. tipos de tumores são indicados por cores, incluindo verde para o cancro do pâncreas, vermelho para o cancro gástrico difuso, e amarelo para o cancro da mama. O paciente apresentou com seu câncer gástrico primário com a idade de 37 anos. Três anos mais tarde, ela apresentou com um desconforto abdominal. A tomografia computadorizada com contraste da pelve identificadas uma massa ovário esquerdo (círculo amarelo) que foi confirmado por biópsia para ser uma difusa metástase do câncer gástrico (isto é, tumor de Krukenberg). Durante o curso da evolução do tumor metastático, uma série de eventos do piloto e do cancro candidato delineado a evolução do tumor e divergência genética da metástase do tumor primário.
Determinou-se se os controladores candidatos deste progressão metastática foram suficientes para reproduzir difusa câncer de intestino. Nossa metodologia de modelagem de câncer usado em Organóides gástricas vitro
e permite projetar o contexto motorista genética destes cancros e estudar o processo de evolução metastática e divergência via oncogénica. Integrando análise genética e modelagem biológica, determinou-se o papel independente da TGFBR2
(transformador de crescimento do receptor do factor-β 2) na oncogênese do cancro gástrico difuso. Nossa modelagem de câncer experimental se baseia em uma interface ar-líquido para a cultura intestinal do rato primária que contém ambos os elementos epiteliais e mesenquimais, recapitula com precisão a proliferação de longo prazo, a diferenciação multilinhagens, o /nicho de células-tronco Wnt-dependente Notch, e peristaltismo [11]. Nós relatamos um sistema gástrico primário análogo organ�de cultura que recapitula com precisão diferenciação epitelial multilinhagens e elementos estromais [12]. Recentemente, conseguimos robusta in vitro
transformação oncogénica de gástrico primário, cólon e pâncreas Organóides via mutações no Kras Comprar e Trp53
, que induzem displasia de alto grau e invasão in vitro
com adenocarcinoma em cima transplantação subcutânea em ratos [13]. Nós demonstram a validação funcional dos motoristas candidato gástrica metástase do câncer de estudos do câncer perfil genômico, com foco na modelagem do TGFBR2
motorista como prova de princípio.
Resultados
difusa câncer gástrico e progressão metastática
Na idade de 37 anos, o paciente índice (525) foi diagnosticado com estágio III (T3N1M0) adenocarcinoma gástrico difuso pouco diferenciado (Figura 1). Sua irmã de 42 anos de idade, foi diagnosticado com adenocarcinoma gástrico difuso 2 meses antes. Com base no histórico familiar de câncer gástrico e do extraordinariamente jovem idade de início, ela se submeteu a linha germinal CDH1
testes de mutação. O paciente e sua irmã foram encontrados para ter uma mutação de recomposição da linha germinativa no intrão 10 (c.1565 + 2insT). Esta mutação germinativa foi posteriormente relatado em outra família com câncer hereditário difuso gástrica (HDGC) [14]. O paciente foi submetido a uma gastrectomia total para remover o tumor primário e foi encontrado para ter um único metástases em linfonodos. Ela recebeu tratamento adjuvante padrão, incluindo quimioterapia combinada (cisplatina e 5-fluorouracilo) e radiação. Três anos após sua apresentação inicial, o paciente relatou plenitude abdominal inferior progressiva. A tomografia computadorizada (TC) demonstrou uma grande massa pélvica consistente com uma metástase ovariana esquerda (Figura 1). Posteriormente, o paciente foi submetido a laparotomia com salpingo-ooforectomia bilateral e biópsia da massa pélvica. Estudos patológicos envolvendo demonstrado adenocarcinoma metastático do ovário, de outra forma referido como um tumor de krukenberg, com a mesma aparência histológica como o tumor primário. Um estudo relatou que entre câncer gástrico difuso, com disseminação metastática, o ovário era um local metastático em 28,8% dos casos [15]. Assim, o ovário é um sítio comum para a doença metastática.
Análise de sequenciação do genoma do cancro
Ambos exome e todo genoma emparelhado-fim de sequenciação foram realizadas sobre o tumor primário, metástase do ovário, e tecido normal que incluiu sangue e gástrica normais tecidos (arquivo adicionais 1: Tabela S1). Tecido do metástases em linfonodos não estavam disponíveis para análise. Vários métodos de sequenciação foram utilizados para compensar o ponto de mistura de estroma normal, um resultado directo da invasividade do infiltrante difusa subtipo do cancro gástrico. Determinou-se a extensão da mistura normal de genoma e corrigida para a inclusão do DNA normal (arquivo adicionais 1: Métodos). Dada a complexidade das amostras de tumor, foi realizada uma rodada adicional de seqüenciamento direcionados para confirmar a presença de mutações e outras aberrações genéticas que ocorreram em exons, limites de exão perto ou promotores.
Geral, obteve-se maior do que 100 × cobertura média para cada exome e geralmente se basearam em dados exome para a descoberta de codificação mutações região. Para toda a sequenciação do genoma, tivemos mais de 60 × cobertura média para toda a amostra do genoma do câncer primário e 30 × para o genoma metastático. Toda a sequenciação do genoma foi utilizado para a identificação de aberrações genéticas de maior escala, tais como número de cópias variação (CNVs), desequilíbrios alélicas, rearranjos e outras classes de rearranjos estruturais. Após o alinhamento, realizamos variante ligando para identificar mutações somáticas e outras classes de aberrações genéticas. Isto incluiu mutações somáticas, inserção-deleções (Indels), CNVs, regiões de perda de heterozigosidade (LOH) e rearranjos de câncer (arquivo adicional 1: Tabela S3 e S4 Tabela). Como um controle para único nucleotídeo variante chamada, nós genotipados as amostras com Affymetrix 6,0 polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) matrizes; foram comparados os genótipos para os SNPs identificados a partir dos dados de seqüência. A concordância de exome e SNP genoma inteiro de dados para os dados de matriz foi de 99%.
Codificação mutações região e validação com o seqüenciamento profunda
Foram identificadas mutações que ocorreram em exons e mutações intrônicas dentro de 100 bases da fronteira exão ea os resultados estão resumidos no arquivo adicional 1: Tabela S2. Como notado anteriormente, as amostras de tumor tinha composição complexa que reduziu a cobertura sequência de algumas mutações. Nós procedemos com uma rodada adicional de seqüenciamento direcionados para validar essas mutações e determinar a sua presença em ambos os tumores. Nós projetamos um ensaio para resequencing alvo profundo que cobria cerca de 300 bases em todo o loci mutação específica (arquivo adicionais 1: Tabela S5). A cobertura média sequenciamento direcionados para cada mutação putativa ou loci era 278 × para normal, 251 × para o tumor primário e 152 × para a metástase.
Entre os dois tumores, nós validados de forma independente um total de 77 mutações que ocorreram dentro ou proximal a exons (arquivo adicional 1: Métodos e Tabela S5). aberrações genéticas validados incluídos: (1) mutações não sinónimas, (2) as mutações sinónimas, (3), as inserções ou (4) as supressões. Com os dados de sequenciamento alvo, determinou-se a frequência de mutação alélica (MAF) entre o tumor primário e metástases para cada mutação. Isto envolve a determinação da fracção de uma sequência de ler-se com uma mutação em comparação com a sequência de referência lê. Fomos capazes de identificar quais mutações eram comuns ou exclusivos para o tumor primário versus a metástase. Entre as mutações 77 validados, a distribuição foi de tal modo que as mutações foram geralmente único, quer para o sítio do tumor primário ou metastático. Por exemplo, o tumor primário tinha oito mutações que não estavam presentes na metástase enquanto a metástase tinha 37 mutações que não estão presentes no tumor primário. Comum a ambos os tipos de cancro foram 32 mutações.
Dado o intervalo de três anos antes da detecção da metástase, existe uma possibilidade de que as mutações específicas de metástases ocorreu independentemente a partir do tumor primário. As mutações específicas para o tumor primário que não estavam presentes na metástase do ovário pode ter sido o resultado de deriva genética aleatória. As mutações comuns a ambos indicam uma origem comum, mas o momento exato da diferenciação entre os dois tumores é menos claro como foi observado por essas mutações com menor MAF. Um subconjunto destes genes tinham valores elevados MAF, indicando uma maior probabilidade de estar presente em todas as populações clonais no tumor primário ou metástase. Como descrevemos mais tarde, estes genes foram priorizados para o teste ainda mais experimental em Organóides gástricas.
Mutações que afetam a função do gene
Entre as mutações que foram validados externamente, nós nos concentramos no subconjunto de mutações que conduzem a substituições de aminoácidos, parada prematura códons e indels que alteraram o quadro de leitura aberta. Posteriormente, determinou-se se estas mutações codificam eram potencialmente prejudiciais para a função do gene através de um número de algoritmos de previsão tais como Polyphen [16] e peneirar [17], entre outros. Com base na informação MAF para cada mutação, determinou-se se estas mutações com um possível impacto prejudicial sobre os produtos do gene eram comuns ou exclusivo para o tumor primário e metástases (Figura 2). Figura 2 Comparação das aberrações genéticas no tumor primário e metástases. Comum contra
aberrações genéticas exclusivos são comparados entre os dois genomas tumorais. (A) Os genes com mutações de codificação tendo um potencial impacto deletério são listados. Estes genes são classificados com base em se eles são exclusivos (caracteres vermelhos) ou comuns (caracteres verdes) para o tumor primário e metástases. As mutações tudo levar a alterações na composição de aminoácidos do produto do gene e foram identificados como apresentando uma alteração significativa com uma alta probabilidade de afectar a função do produto do gene. (B) Um resumo das aberrações cromossómicas é mostrado em todo o genoma do cancro de ambos os tumores. Isso inclui a variação do número de cópias (CNV) ou perda de heterozigosidade (LOH). Os blocos vermelhos indica eventos exclusivos para o tumor primário ou metástases. Os blocos verdes indicam eventos comuns a ambas. O número de eventos por cromossoma é listada em cada bloco. As setas indicam eventos LOH ou exclusões que abrangem o braço de p, q braço, ou de todo cromossomo. As setas vermelhas indicam aberrações cromossómicas que são setas exclusivos e verdes indicam eventos que são comuns.
no subconjunto de mutações deletérias, realizamos uma análise adicional biológica via, revisão de literatura e comparação com os dados Cancer Genome Atlas disponíveis para o câncer gástrico difuso. Este identificou um conjunto de genes de câncer conhecidos e candidatos relacionadas com o cancro susceptíveis a mutações que provavelmente tiveram um impacto sobre a função da proteína. Estamos focados em uma série de genes motorista candidato (Tabela 1), que anteriormente tinha sido demonstrado ter supressores potenciais ou eram conhecidos oncogênicos tumorais com mudanças bialélicos presentes nos oncogenes Cancro genomes.Table 1 com amplificações ou drivers de câncer com eventos bialélicos
Origem
conhecido ou driver câncer candidato
evento Bialélicos
alteração Allelic 1
Mutação ou aberração genômica
Chr
posição
Chr ou intervalo
Allelic alteração 2
exclusivo para o
FGFR2 primária *
Amplification
6 vezes amplificação
10
117820033 - 119748751
comum ao tumor primário e metástases
CDH1
Sim
supressão
supressão parcial do exão 9
16
68.847.326-68.847.403
mutação germinativa no CDH1
TP53
Sim
5 'splice local de mutação
splicing aberrante
17
7.578.370
perda hemizygous do braço 17p
exclusivo para a metástase
TGFBR2
Sim
Frameshift INDEL
códon de terminação no exão 4 Sims 3
30.691.871
eliminação hemizygous do tipo selvagem TGFBR2
lócus
PCDH7
Sim
missense
S87R 4
30.723.305
eliminação hemizygous do tipo selvagem 4 braço
FERMT1
loci
Sim
Perda de heterozigosidade
FERMT
1 localizado em 20p12.3
20
FERMT
1 mutação
BMP7
loci
Sim
Perda de heterozigosidade
BMP7
localizado em 20q13.3
20
BMP7
mutação
Chr:. cromossomo
número variações Copiar e desequilíbrios alélicas que distinguem o tumor primário da metástase
Notamos aberrações cromossômicas em maior escala que diferenciaram a principal da metástase (Figuras 2b e 3a). Isto incluiu copiar o número de mudanças e eventos LOH. Exclusivo para o tumor primário foram duas ampliações genómicas nos cromossomos 5 e 10, e duas inversões nos cromossomos 15 e 16 (arquivo adicionais 1: Tabela S4). A amplificação do cromossoma 10 coberta de um intervalo de 1,66 Mb. Ao considerar as supressões alélicas ou desequilíbrios, o único evento importante que se observou uma perda envolvido o braço de P do cromossoma 17. Figura 3 A divergência genética da metástase do ovário do cancro gástrico primário para os condutores candidatos críticos. A posição genômica da mutação, copie variações no número (CNV) regiões ou perda de heterozigosidade intervalos (LOH) são mostradas a partir dos genomas do câncer. Para as tramas de cromossomas, o eixo Y designa posição com o respectivo cromossoma, o seu comprimento em megabases (MB) e designação ideograma mostrados à esquerda do perfil de número de cópia. mutações deletérias são mostradas como setas em caixa com o símbolo do gene. (A) A ampla distribuição do genoma de intervalos CNVs e LOH específicos do cancro encontram-se resumidos em todos os cromossomas para o tumor primário e metástases. (B) no cromossomo 3, a metástase tinha eventos bialélicos singulares envolvendo um TGFBR2
mutação deletéria e uma deleção genômica afetar o outro alelo como visto mais claramente com intervalos LOH. Secundária a deleções genómicas, LOH é demonstrado como uma mudança no valor da relação menor frequência alélica de -1 e correlaciona-se com uma deleção genómica. (C) no cromossoma 10, o gene FGFR2
foi localizada numa região de amplificação genómica observado apenas no primário e não a metástase. A amplificação é observado em um circulo vermelho.
Em contraste com o tumor primário, o tumor metastático teve eventos LOH numerosos escala cromossómico e deleções genómicas que afectam 12 cromossomas diferentes, a maioria das quais eram exclusivos para o tumor metastático (Figura 2) . Isto incluiu várias exclusões e copiar eventos LOH neutros que estão detalhadas no arquivo adicionais 1: Tabela S3. Houve uma amplificação genómica de cinco vezes na cromossoma 2, mas não há genes específicos que existia no intervalo afectada. Não houve translocações cromossómicas inter-detectáveis ​​em qualquer tumor primário ou das metástases genomas. Outros rearranjos de câncer foram identificados, mas que não apontavam para aberrações em quaisquer genes motorista candidato (arquivo adicional 1: Tabela S4). Havia indícios de instabilidade genômica em larga escala com base na análise desequilíbrio alélicas; cromossomos 14, 17, 20 e 22 de todos os envolvidos o cromossomo inteiro. Compra de aberrações no número de cópias e desequilíbrios alélicas, identificamos exclusiva contra eventos comuns entre o tumor primário e metástases. A única aberração genética comum envolvido o braço de P do cromossoma 17. No geral, a falta de sobreposição era indicativo de divergência genética significativa a partir do tumor primário e de metástases, apesar de uma origem comum, como é indicado por mutações em supressores de tumores partilhados críticos.
O genómico intervalos de LOH, o número de cópias aberração e eventos de rearranjo foram comparados com a posição das mutações do gene validados. Esta análise integrada apontou para um número de genes que tinham alterações bialélicos envolvendo tanto uma perda do alelo de tipo selvagem a partir de uma aberração genómico intervalo grande e um alelo mutante. Os resultados para os genes com sucessos bialélicos foram considerados ser fortes candidatos para um envolvimento de perda de função no cancro (Tabela 1).
Identificação dos condutores comuns de cancro para o tumor primário e de metástases
Tanto o primário eo metástase do cancro continha eventos excitador que eram susceptíveis de ser crítica para a tumorigénese no contexto da CDH1 inicial isso mutação (Tabela 1, Figura 2). Para além da linha germinal CDH1
mutação intrónica, o segundo alelo CDH1
tinha uma deleção de 77 pb genómico somática de uma porção do exão 9 que afecta as regiões codificadoras a jusante. O CDH1
mutação somática foi idêntico em ambos os genomas do cancro gástrico primários e metastáticos, demonstrando uma origem genética comum e fornecendo forte evidência genética de que este controlador teve um papel fundamental na tumorigénese gástrico difuso. Mutações que afetam CDH1
exon 9 que levam à perda da expressão da proteína têm sido frequentemente detectada no cancro gástrico difuso [18] - [20]. sequência de aminoácidos deste exão é um local putativo de ligação ao cálcio que é provavelmente importante para a função do receptor
o tumor primário e metastático também partilhada splicing bialélico local dador de mutação. (c.559 + 1G > A) do quinto intrão TP53
e um evento LOH cromossomo 17p abrangendo lócus do TP53
(arquivo adicionais 1: Figura S1). A mutação do gene TP53
interrompe splicing de RNA splicing [21] e é uma mutação do cancro relatado anteriormente [22], [23]. As análises de cânceres gástricos esporádicos e hereditários identificaram TP53
mutações que ocorrem simultaneamente com CDH1
mutação [24], [25]. CDH1
inactivação em células parietais gástricas não induz carcinoma gástrico, sugerindo que a perda de CDH1
é insuficiente para iniciação do tumor [26]. No entanto, double knockout condicional de CDH1 Comprar e TP53
induz o desenvolvimento de carcinoma gástrico difuso [26]. Curiosamente, o intervalo genómico do evento que afecta o gene TP53 LOH
lócus foi maior na metástase em comparação com o tumor primário. Isso pode ter ocorrido devido a eventos instabilidade genômica independentes dada a forte seleção para a perda da função bialélico TP53.
FGFRis um driver câncer acionável exclusivo para o
tumor gástrico primário no tumor primário, houve uma genômica seis vezes amplificação de uma região do cromossoma 10 e o braço q coberto de um intervalo de 1,66 Mb. Dentro deste regiões genómicas era um candidato FGFR2 condutor
oncogénica também referido como o receptor do factor de crescimento de fibroblastos 2 (Figura 3c). Isto foi confirmado com vários métodos, incluindo sequenciamento, análise de matriz e validação por PCR quantitativa. FGFR2 é um receptor transmembranar que atua como parte de uma via de transdução de sinal chave que regula a reparação dos tecidos e desenvolvimento embrionário entre uma série de outras funções [26].
Para validar a prevalência de FGFR2
amplificação na difusa contra cancros gástricos intestinais , foram analisadas 37 difusa e 27 amostras de tumores subtipo intestinal primários gástricos com PCR digital [27]. Anteriormente, foi demonstrado que este método é profundamente sensível para a detecção de cópia número aberração, mesmo no contexto de ADN do tumor diluição normal de ADN diplóide. O nosso estudo demonstrou FGFR2
amplificação em quatro dos 37 (11%) amostras de tumores difusos, que estava ausente nas amostras intestinais subtipo (Figura 4a). Figura 4 Prevalência de FGFR2 em tumores gástricos humanos e sua contribuição para a proliferação celular. (A) As amostras de cancro gástrico esporádicos foram avaliados por PCR digital quantitativa para determinar FGFR2 número cópia genómica. Os pontos pretos representam cancros gástricos difusos. Os pontos vermelhos indicam o subtipo intestinal de câncer gástrico. (B) características genéticas da AGS (FGFR2
diplóides) e KatoIII (FGFR2 amplificado) linhas celulares de cancro gástrico são mostradas. (C) A percentagem de sobrevivência para a linha celular de cancro AGS é mostrado com inibidores de FGFR2 variando especificidade. (D) A KatoIII difusa linha celular de cancro gástrico foi tratada com inibidores de FGFR2 variando especificidade. O eixo Y representa percentagem de sobrevivência em relação
o eixo X com concentrações de log. Em todos os painéis, as barras de erro representam o erro padrão da média. A diferença na sobrevivência celular por cento entre células KatoIII e AGS foi estatisticamente significativa (P Art < 0,05). Nas três maiores concentrações de todas as drogas, exceto Brivanib que só foi significativa na concentração mais elevada
Em apoio da sua papel como um condutor candidato, FGFR2
amplificação está presente num certo número de linhas celulares de cancro gástrico [28], [29] e subsequentemente relatadas em várias malignidades gastrointestinais, tais como adenocarcinoma esofágico [30]. Além disso, o tratamento de linhas celulares de cancro com inibidores de moléculas pequenas específicas de FGFR2 ou shRNAs leva à inibição do crescimento potente [28] o que sugere um papel funcional para FGFR2
amplificação no subtipo difusa.
Análise funcional do condutor em FGFR2 combinação com CDH1 e TP53
Foram identificados dois exemplos de um câncer gástrico difuso primária com co-ocorrência de motoristas de câncer conhecidos e putativos envolvendo CDH1
, TP53
e FGFR2
como visto no paciente índice . O primeiro exemplo incluiu uma amostra câncer gástrico difuso, que estava entre os adenocarcinomas gástricos analisados ​​por TCGA. Usando o portal CBio TCGA [10], identificamos um paciente (TCGA-BR-6803), que teve um complemento semelhante de aberrações genéticas em CDH1
, TP53
e FGFR2
, todos os quais foram anteriormente descrito no cancro como visto no repositório mutação cancro cósmicos. Isto incluiu o seguinte: uma mutação sem sentido na CDH1
(D254Y) que foi descrito em três outros cancros; uma mutação missense (L130F) em TP53
onde as mutações neste códon foram relatados em 37 outros tipos de câncer; o FGFR2
amplificação que nós e outros identificaram no cancro gástrico difuso.
Como segundo exemplo, foi identificado um humano difusa linha celular de cancro gástrico, KatoIII, que tem uma composição semelhante de aberrações genéticas que afectam os mesmos genes do cancro que o tumor primário do nosso paciente índice. KatoIII tem uma CDH1
mutação que conduz a uma inserção de sequência intrónica no ARNm [31], [32], um TP53
mutação que conduz a uma deleção completa do gene [33] e o FGFR2
amplificação [29] (Figura 4b). Esta linha de células nos permitiu avaliar o potencial papel oncogênico do FGFR2
amplificação no contexto genético específico de CDH1
e TP53
mutações, semelhante ao tumor primário do paciente índice.
Para determinar a contribuição de FGFR sinalização para o crescimento neoplásico, que trataram células KatoIII com vários inibidores de FGFR2 pequenas moléculas de tirosina-quinase (TKI), incluindo Brivanib, TKI258, ponatinibe e AZD4547 [34]. Como um controlo, foi utilizada a linha de células de câncer gástrico AGS, que é do tipo selvagem para FGFR2
, CDH1
e TP53
, mas tem mutações no KRAS Comprar e PIK3CA
[35] ( Figura 4b). Todos os inibidores da morte celular induzida por FGFR2 em KatoIII, mas não células de AGS (Figura 4C e D). O mais potente destes TKI, AZD4547, tem um IC 50 de aproximadamente 2 nM em células KatoIII e 39.580 nM em células de AGS (Figura 4C e D). Cada um dos inibidores demonstraram um aumento estatisticamente significativo inferior IC 50 em células KatoIII amplificado-FGFR2 em comparação com células não-AGS-FGFR2 amplificado em todas as concentrações testadas (Figura 4C e D).
Em contraste, o tratamento de e KatoIII células AGS com agentes quimioterápicos citotóxicos, tais como paclitaxel, 5-fluorouracil e carboplatina não teve um efeito significativo em ambos KatoIII ou linhas AGS, com IC semelhante 50 identificadas em cada (arquivo adicionais 1: Tabela S7). Para AZD4547, a diferença de 20.000 vezes na sensibilidade ao FGFR inibidores sugere que a sinalização FGF é um factor crítico para CDH1
proliferação celular gástrica -initiated e este TKI representa um potencial terapia-alvo em cancros subtipo difusas abrigando FGFR2
amplificações.
Bialélicos inativação de TGFBRis exclusiva para a metástase do ovário
divergência genética foi evidente; Tabela S1. Tabela S2. Tabela S3. Tabela S4. Tabela S5. Tabela S6. Tabela S7. Figura S1. Figura S2. Figura S3.

• A toxina botulínica na submucosa gástrico reduz a produção de HCl em ratos estimulados
• Predição de vários cânceres primários metacrônicos após a ressecção curativa de câncer gástrico