Metastatický nádor evolúcie a modelovanie organoidní zapliesť TGFBR2as ovládač rakoviny u difúzny karcinómu žalúdka

Metastatický nádor evolúcie a modelovanie organoidní zapliesť TGFBR2
ako vodič rakoviny u difúzneho karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
žalúdočné rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu globálnych s metastatické ochorenie predstavujúce primárnu príčinu mortality. K identifikácii uchádzačov o prácu rušňovodiča zapojené do onkogenézy a vývoju nádoru, prevádzame rozsiahlu analýzu genómu sekvenovania metastatické progresiu v rozptýlenom rakoviny žalúdka. Ide o porovnanie medzi primárneho nádoru z dedičný difúzna žalúdočné rakovina syndróm probanda aj jeho opakovanie ako ovariálne metastázy.
Výsledky
Obaja primárneho nádoru a vaječníkov metastázy majú spoločnú biallelic so stratou funkcie oboch CDH1 stroje a TP53
nádorové supresormi, čo naznačuje spoločný genetický pôvod. Kým primárny tumor vykazuje zosilnenie 2 (FGFR2
) génu fibroblastový rastový faktor receptor, metastáza najmä postráda FGFR2
amplifikácie, ale skôr má jedinečné biallelic zmeny transformujúceho rastového faktora beta receptor 2 (TGFBR2
) s uvedením divergentná in vivo
evolúcie TGFBR2
-mutant metastatické klonálnej populácie u tohto pacienta. Ako TGFBR2
mutácie neboli predtým funkčne overené u karcinómu žalúdka, sme modelovali metastatické potenciál straty TGFBR2 v myšiam trojrozmernej primárnej žalúdočné organoidní kultúry. TGFBR2
zhrnie porazený v rámci Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoids generuje invázie in vitro stroje a robustný metastatického nádorového bujnenia in vivo
, čo potvrdzuje TGFBR2
metastázy potláčajúci aktivitu
Závery
sme dokumentovať metastatický diferenciácie a genetická heterogenita difúzneho karcinómu žalúdka a odhaliť potenciálne metastatický úlohu TGFBR2
so stratou funkcie. Na podporu tejto štúdii sme sa použiť myšou primárny spôsob organoidní kultúry schopný zhrnuté v karcinómom žalúdku in vivo
. Celkovo možno povedať, popíšeme integrovaný prístup k identifikácii a funkčne overiť predpokladané vodičov s rakovinou zapojené do metastáz.
Pozadie
Worldwide, adenokarcinóme žalúdka je štvrtou najčastejšou zhubné bujnenie a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu medzi mužmi a ženami. Na charakteristických rysov histopatologických založený, adenokarcinóme žalúdka je rozdelená do difúznych a črevných subtypov [1]. Pokiaľ ide o histopathology, difúzna žalúdočné rakoviny sú všeobecne nediferencovanej, často majú pečatný prsteň bunkové funkcie a invazívne infiltrovať normálne žalúdočné tkaniva. Naproti tomu, črevné epitelové podtyp má vlastnosti a tvoria jednotlivé nádorovej masy podobné rakoviny hrubého čreva. Difúzna rakovina žalúdka má vyšší výskyt metastatického ochorenia a všeobecne horšie prognózu než na črevnú subtyp [2], [3]. V súčasnej dobe sú genómovej analýzy difúzneho karcinómu žalúdka sa týkali malého počtu vzoriek, vrátane nedávnej štúdie Cancer Genome Project (Atlas TCGA) a celé sekvenovanie genómu prieskumu sady difúznych nádorov žalúdka [4]. Avšak, existuje len málo, ak vôbec, štúdie, ktoré detail metastatické vývoj rakoviny žalúdka; metastatické nádory sú zvyčajne chýba veľkých genómov prieskumov s rakovinou, ako je TCGA. Celkovo možno povedať, málo je známe o onkogénnym procese a nádorové vývoji karcinómom žalúdka cez jeho zásadný klinický význam [5].
V dedičný difúzna rakovinu žalúdka (HDGC), zárodočnej mutácie v CDH1
(to znamená, E- cadherin) udeľuje 70% celoživotné riziko vzniku karcinómu žalúdka difúzny z [6], [7]. V CDH1
nádorový supresorový gén kóduje E-cadherin, transmembránový glykoproteín, ktorý sprostredkováva adhéziu vápnika závislé bunka-bunka. Zmeny funkcie CDH1 ovplyvňujú epiteliálne-mezenchýmových prechod (EMT), ktorý je zapojený ako hrajú úlohu v vzniku nádorov. Štúdia nádorov ovplyvnený HDGC jednotlivcov poskytujú jedinečnú príležitosť určiť základné hnacie sily difúzneho rakoviny žalúdka v kontexte CDH1
strate funkcie. Podporné dôkazy o úlohe CDH1
sporadických rozptýlených karcinómov žalúdka zahŕňa zistenie, že 50% obsahovať CDH1
mutácie alebo hypermetylace v tomto CDH1
promótor [8], [9]. Nedávna celý genóm sekvenovania prieskum difúzneho karcinómu žalúdka tiež identifikovala časté CDH1
mutácie ako najčastejší prípad vodiča [4]. Údaje rakovina žalúdka TCGA tiež ukazujú na vysokú frekvenciu CDH1
mutácií somatických [10]. Podstatne menej je známe o identite a úlohe čo-nastávať ovládačov, ktoré prispievajú k difúzny žalúdočnej metastáz.
Tu sme správu štúdii metastatického evolučného procesu v difúznej rakoviny žalúdka. Naším cieľom bolo identifikovať známy a kandidátske ovládače, ktoré vymedzujú progresie nádoru počas metastáz. Vykonali sme rozsiahlu analýzu genómu sekvenovania primárneho nádoru žalúdka a metastázy od jedinca s zárodočnej línie CDH1
mutácie (obrázok 1), ktorý sa sťažoval na žalúdočné primárnej a po 3 rokoch od metastáz v ľavom vaječníku. S ohľadom na existujúce embryonálny mutáciu v CDH1,
genóm rakoviny vyžaduje iba druhý alelické zásah prostredníctvom somatické genetické odchýlky, ako je demonštrované v nádoru od jedinca. Vzhľadom k tomu, počiatočné udalosť vodič rakovina je známe, Mendelian rakovinové genómy poskytnúť vzácnu a veľmi informatívny `experiment povahy", ktorý poskytuje príležitosť na vymedzenie somatické genetiky metastáz. Sekvenovania genómu analýza oboch nádorov odhalila dôkazy o spoločný pôvod založený na zdieľaných mutácií, ale väčšie genomické rôznorodosť vidieť tak na úrovni mutácií, rovnako ako rozsiahle alelická nerovnováhy a počet kópií aberácie pre metatasis. Obrázok 1 Rodina a klinickej histórie Mendelian difúzne rakoviny žalúdka. Rodokmeň index pacienta 525 (III-1) je zobrazený. typy nádorov sú farebne označené, vrátane zelená pre rakovinu pankreasu, červené pre difúzne rakoviny žalúdka, a žltej na rakovinu prsníka. Pacient prezentované s jej primárnej rakoviny žalúdka vo veku 37 rokov. O tri roky neskôr sa predstavila s bolesti brucha. Kontrastné CT scan panvy určili ľavého vaječníka masovej (žltý kruh), ktorá bola potvrdená na biopsiu, aby difúzny žalúdočné rakoviny metastázy (tj Krukenberg nádor). V priebehu vývoja metastatického nádoru, rad známych a rakovinových kandidát akcií ovládače vymedzený vývoj nádoru a genetickú divergenciu metastázy z primárneho nádoru.
Zistili sme, v prípade, že kandidátske ovládače z tohto metastatické progresiu boli dostatočné pre reprodukciu difúzny rakovina žalúdka. Naše modelovanie rakovina Metodika použitá pri žalúdočných organoids vitro stroje a umožňuje, aby jeden inžinier genetické súvislosti vodiča týchto typov rakoviny a študovať proces metastatický evolúcie a onkogénnych dráhy divergencie. Integrácia genetickú analýzu a biologické modelovanie, sme stanovili nezávislú úlohu TGFBR2
(transformujúci rastový faktor-β receptorov 2) v onkogenézy rozptýleného rakoviny žalúdka. Naše experimentálne modelovanie rakoviny spolieha na vzduchovom kvapalnom rozhraní pre primárne myšou črevnej kultúry, ktorá obsahuje ako epitelové a mezenchymálnych prvky, presne rekapituluje dlhodobú proliferáciu, multilineární diferenciáciu sa Wnt /Notch závislé kmeňových buniek nika, a peristaltika [11]. hlásených sme analogický primárne žalúdočné organoidní kultivačný systém, ktorý presne rekapituluje multilineární epitelu a diferenciáciu stromálnych prvkov [12]. V poslednej dobe sme dosiahli robustný in vitro
onkogénne transformáciu primárnej žalúdka, hrubého čreva, pankreasu a organoids cez mutácií u Kras stroje a Trp53
ktoré vyvolávajú vysoko kvalitné dysplázia a invázie in vitro
adenokarcinóm na subkutánna transplantáciu do myší [13]. My demonštrujú funkčné validáciu kandidát žalúdka nádorových metastáz vodičov z rakoviny genomické profilovanie štúdií so zameraním na modelovanie TGFBR2
ovládač ako dôkaz princípu.
Výsledky
Difúzny karcinóm žalúdka a metastatické progresiu
Vo veku 37 rokov, index pacient (525) bola diagnostikovaná fáze III (T3N1M0) zle diferencované difúznym adenokarcinóme žalúdka (obrázok 1). Jej 42-ročný sestra bola diagnostikovaná s difúznym adenokarcinóme žalúdka 2 mesiace skôr. Na rodinnú anamnézu rakoviny žalúdka a nezvyčajne mladom veku nástupu na báze podstúpila zárodočná CDH1
testovanie mutácie. Bolo zistené, že pacientka a jej sestra mať zárodočnú mieste zostrihu mutáciu v IntronA 10 (c.1565 + 2insT). Táto zárodočná mutácia bola následne zaznamenaná v inej rodine s dedičným difúznym rakoviny žalúdka (HDGC) [14]. Pacientka podstúpila celkovú gastrektómii odstrániť jej primárny nádor a bolo zistené, že jeden lymfatických uzlín. Získala štandardnú adjuvantnú liečbu vrátane kombinovanej chemoterapii (cisplatina a 5-fluóruracilu) a žiarenie. Tri roky od jej pôvodného predstavenia, pacient hlásených progresívne spodnej časti brucha plnosti. Vypočítaný tomografia (CT) preukázala veľký panvové hmoty v súlade s ľavým ovariálnej metastázy (obrázok 1). Následne pacient laparotómia s obojstranná adnexektomie a biopsia panvovej hmoty. Patologické štúdie preukázali, metastatické adenokarcinóm vaječníkov zahŕňajúce, inak označované ako nádoru Krukenberg, s rovnakým histologické vzhľad ako primárneho nádoru. Jedna štúdia uvádza, že medzi difúzne rakovinou žalúdka s metastatickým šírením, vaječník bol metastázujú do 28,8% prípadov [15]. To znamená, že vaječník je spoločný miesto pre metastatické ochorenie.
Cancer analýzu sekvencií genómu
Obaja exome a celý genóm škárovanie-end sekvencovania bolo vykonané na primárnom nádoru, metastázy vaječníkov, a normálne tkanivo, ktorá zahŕňala krv a normálne žalúdočnej tkanivo (Ďalší súbor 1: Tabuľka S1). Tkanivo z metastáz lymfatických uzlín bolo k dispozícii pre analýzu. Boli použité viac metód sekvenovania kompenzovať v rozsahu normálneho stromálneho zmesi, priamy dôsledok infiltrative invazivitě difúzna žalúdočné rakoviny podtyp. Určili sme rozsah normálneho genómu zmesi a koriguje zahrnutie normálne DNA (ďalší súbor 1: Metódy). Vzhľadom na zložitosť nádorových vzoriek sme vykonali ďalšie kolo cieleného sekvenovanie, aby sa potvrdila prítomnosť mutácií a ďalších genetických chýb, ku ktorým došlo v exóne, blízko hranice exón alebo promótory.
Celkovo sme získali väčšie ako 100 x priemer pokrytie pre každú exome a všeobecne sa spoliehal na exome údajov za objav kódovanie mutácie regiónu. Pre celé sekvenovanie genómu, mali sme väčšiu ako 60 × priemer krytia pre primárnej rakoviny celej vzorky genómu a 30 x pre metastatické genómu. Celý genóm sekvenovania bola použitá pre identifikáciu väčšom meradle genetické odchýlky, ako napríklad počet kópií variácie (CNVs), alelických nerovnováhy, prestavieb a ďalších tried štrukturálnych prestavieb. Po vyrovnaní sme vykonali variantu vyzývajúce na identifikáciu somatické mutácie a iné triedy genetických odchýlok. To zahŕňalo somatické mutácie, vloženie-delécií (indels), CNVs, strata-of-heterozygozity regióny (LOH) a rakovina preskupenie (ďalší súbor 1: Tabuľka S3 a S4 tabuľka). Ako kontrola pre jediné nukleotidové varianty volanie, sme genotyp vzoriek s Affymetrix 6,0 jednotlivým polymorfizmom (SNP) pole; sme porovnali genotypy s ohľadom na zistené SNP zo sekvenčných dát. Zhoda exome a celý genóm SNP údajov k údajom Pole bolo 99%.
Kódovanie mutácie a validácie s hlbokým sekvenovania región
Zistili sme, že mutácie, ku ktorým došlo v exónov a intronom mutácií do 100 báz exónu hranice a výsledky sú zhrnuté v ďalšej oblasti 1: Tabuľka S2. Ako už bolo povedané, vzorky nádorové mal komplexný kompozícia, ktorá znižuje rozsah sekvencie niektorých mutácií. Pokračovali sme s ďalším kole cieleného sekvenovania Pre potvrdenie týchto mutácií a určiť ich prítomnosť v oboch nádoroch. Navrhli sme test pre hlboké cielené resequencing, ktorý pokryl približne 300 základní po celom špecifická mutácia loci (ďalší súbor 1: Tabuľka S5). Priemerná cielené sekvenčné pokrytie pre každú domnelú mutáciu alebo loci bolo 278 × za normálne, 251 × pre primárneho nádoru a 152 × pre metastázy.
Medzi oboma nádorov sme nezávisle overené celkom 77 mutácií, ku ktorým došlo v rámci alebo proximálne exónov (ďalší súbor 1: Metódy a tabuľka S5). Overené genetickej odchýlky patria: (1) non-synonymné mutácie, (2) synonymné mutácie, (3) vložky, alebo (4) delécie. Vďaka cielenému sekvenčného dát, sme určili frekvenciu mutácie alelické (MAF) medzi primárneho nádoru a metastáz pre každú mutáciu. To zahŕňa stanovenie podielu sekvencie čítania s mutáciou v porovnaní s referenčnou sekvenciou číta. Boli sme schopní určiť, ktoré mutácie boli spoločné, alebo výhradne pre primárneho nádoru versus metastáz. Medzi 77 overených mutácií, rozdelenie bola taká, že mutácie boli všeobecne jedinečné buď primárneho nádoru alebo metastatickom mieste. Napríklad, primárny nádor mal osem mutácie, ktoré neboli prítomné v metastáz, zatiaľ čo metastázy malo 37 mutácie, ktoré sa v primárnom nádore. Spoločná pre obe rakoviny boli 32 mutácií.
S ohľadom na interval troch rokov pred detekciu metastáz, je tu možnosť, že mutácia metastázy špecifické došlo nezávisle na sebe z primárneho nádoru. Mutácie špecifické pre primárneho nádoru, ktoré neboli prítomné v ovariálnej metastázy môže byť dôsledkom náhodných genetických driftu. Mutácie spoločné pre oba ukážu spoločný pôvod, ale presné načasovanie rozdielu medzi týmito dvoma nádorov je menej jasné, ako je uvedené týmito mutáciami s nižším MAF. Podskupina týchto génov mal vysoké hodnoty MAF, čo naznačuje vyššiu pravdepodobnosť, že sú prítomné vo všetkých klonálnej populácie v primárneho nádoru alebo metastázy. Ako popíšeme neskôr, tieto gény boli uprednostnené pre ďalšie experimentálne testovanie v žalúdočnej organoids.
Mutácie génu, ktoré ovplyvňujú funkciu
Medzi mutácie, ktoré boli overené externe, sme sa zamerali na podskupine mutácií vedúcich k aminokyselinové substitúcie, predčasný stop kodóny a indels, ktoré zmenili otvorený čítací rámec. Následne sme zistili, či tieto mutácie boli kódujúce potenciálne škodlivé pre funkcie génu pomocou počtu predikčných algoritmov, ako je Polyphen [16] a SIFT [17] a ďalšie. Na základe informácií o MAF pre každú mutáciu, sme zistiť, či tieto mutácie s potenciálny nepriaznivý vplyv na génové produkty sú rovnaké, alebo výhradne pre primárneho nádoru a metastázy (obrázok 2). Obrázok 2 Porovnanie genetických odchýlok v primárnom nádoru a metastáz. Spoločná proti
exkluzívnych genetických odchýlok sa porovnávajú medzi oboma nádorových genómov. (A) Gény s kódujúci mutácie, ktoré majú potenciálne škodlivý vplyv sú uvedené. Tieto gény sú klasifikované podľa toho, či sú exkluzívne (červené znaky), alebo spoločné (zelené znakov) primárneho nádoru a metastáz. Mutácie všetky viesť k zmenám v zložení aminokyselín génového produktu, a bolo identifikovaných, že majú významné zmeny s vysokou pravdepodobnosťou ovplyvnenie funkcie génového produktu. (B) Súhrn chromozómy je znázornené v celom genóme rakoviny oboch nádorov. To zahŕňa počet kópií variáciu (CNV) alebo stratu heterozygozita (LOH). Červené bloky označuje udalosti exkluzívny do primárneho nádoru alebo metastázy. Zelené bloky znamenajú udalosti spoločný. Počet udalostí na chromozóme je uvedená v každom bloku. Šípky ukazujú udalosti Loh alebo delécií, ktoré zahŕňajú p rameno, q paže, alebo celý chromozóm. Červené šípky označujú chromozomálne aberácie, ktoré sú exkluzívne a zelené šípky ukazujú udalosti, ktoré sú bežné.
Na podskupiny škodlivých mutácií, sme vykonali ďalšiu biologickú analýzu dráhy, literárne rešerše a porovnanie proti údajom Cancer Genome Atlas sú k dispozícii pre difúzne rakoviny žalúdka. Táto identifikovala rad známych rakovinových génov a pravdepodobných kandidátov súvisiacich s rakovinou s mutáciou, ktoré pravdepodobne mali vplyv na funkciu proteínu. Zamerali sme sa na rade génov kandidát vodiča (tabuľka 1), ktoré predtým bolo preukázané, že majú onkogénny potenciál, alebo boli známe nádorové supresormi s biallelic zmeny prítomné v rakovinových onkogénov rakoviny genomes.Table 1 s amplifikáciou alebo vodičom, ktorí s rakovinou s biallelic účinky
Pôvod
Známy alebo ovládač rakovina kandidát
Biallelic udalosť
alelická prestavby 1x
mutácie alebo genómovej aberácie
Chr

Chr pozície alebo interval
alelické zmeny 2
Jedinečný primárnej
FGFR2 *
zosilnenie
6-násobné zosilnenie
10
117820033 - 119748751
Spoločným znakom primárneho nádoru a metastáz
CDH1
Áno
vypustení
čiastočné odstránenie exónu 9
16
68.847.326-68847403
zárodočná mutácia v CDH1
TP53
Áno
5 'sestřihové miesto mutácie
Aberrant zostrih
17
7578370
hemizygotní strata 17p ramena
Unikátny metastázy
TGFBR2
Áno
posúvať INDEL
Kodona exónu 4 Sims 3
30691871
hemizygotní vypustení divokého typu TGFBR2
locus
PCDH7
Áno
chybných
S87R
4
30723305
hemizygotní vypustení divokého typu 4 ramená
FERMT1
loci
áno
Strata heterozygozity
FERMT
1 sa nachádza v 20p12.3
20
FERMT
1 mutáciu
BMP7
loci
áno
Strata heterozygozita
BMP7
nachádza v 20q13.3
20
BMP7
mutácie
Chr .: chromozóm
variácií číslo kópie a alelických nerovnováhy rozlišovacích primárneho nádoru z metastáz
Zaznamenali sme vo väčšom meradle genomické aberácie, že diferencované primárne z metastáz (obr 2b a 3a). To zahŕňalo číslo zmeny kopírovať a udalosti Loh. Jedinečnou vlastnosťou primárneho nádoru boli dve genómovej amplifikácie na chromozómoch 5 a 10, a dve inverzie na chromozómoch 15 a 16 (ďalší súbor 1: Tabuľka S4). Chromozómu 10 amplifikácie pokryl 1,66 Mb interval. Pri zvažovaní delécie alebo alelické nerovnováhy, jediná veľká udalosť, ktorá bola zaznamenaná išlo o stratu p ramienku chromozómu 17. Obrázok 3 Genetická divergencia vaječníkov metastázy od primárneho rakoviny žalúdka kritických vodičov kandidátskych. Genómovej poloha mutácie, kopírovať variácie číslo (CNV), regióny alebo strata-of-heterozygotnosti (LOH) intervaly sú zobrazené z nádorových genómov. Na chromozóme plochách, na osi Y označuje polohu s príslušným chromozómu, jeho dĺžka v megabases (MB) a ideogramy označenie zobrazené na ľavej strane profilu počtu kópií. Škodlivé mutácie sú zobrazené ako orámovaných šípky so symbolom génu. (A) Genóm široká distribúcia CNVs a Loh intervale karcinóm špecifického sú zhrnuté vo všetkých chromozómov pre primárneho nádoru a metastáz. (B) na chromozóme 3, metastáza mal unikátny biallelic udalosti zahŕňajúce škodlivé TGFBR2
mutáciu a genómovej deléciu ovplyvňujúce druhý alelou ako je najlepšie vidieť na Loh intervaloch. Sekundárne k genómových delécií, LOH sa prejaví ako posun v menšom alelické hodnoty frekvenčné pomer -1 a koreluje s genómovej deléciou. (C) na chromozóme 10, v FGFR2
gén bol umiestnený v genómovej oblasti zosilnenie sa prejavuje iba na primárnej a nie metastáz. Zosilnenie je uvedené v červenom kruhu.
Na rozdiel od primárneho nádoru je metastatické nádor mal početné chromozomálne meradle Loh udalosti a genomických delécií ovplyvňujúce 12 rôznych chromozómov, pričom väčšina z nich boli jedinečné metastatického nádoru (obrázok 2) , To zahŕňalo viac delécií a kopírovať neutrálne LOH udalosti, ktoré sú podrobne popísané v ďalšej súbor 1: Tabuľka S3. Došlo k päťnásobná genomické zosilnenie v chromozóme 2, ale žiadne špecifické gény známe existoval v postihnutom intervale. Neboli zistené žiadne detekovateľné medzi chromozomálne translokácie v oboch primárneho nádoru alebo metastáz genómov. Boli identifikované ďalšie rakovinové prestavby ale nemal smerovať aberácií v akýchkoľvek génov kandidát vodiča (ďalší súbor 1: Tabuľka S4). Tam boli náznaky veľkom meradle genómovej nestabilite na základe analýzy alel nerovnováhe; chromozómy 14, 17, 20 a 22 všetky zúčastnené celý chromozóm. Apartmán V počte kópií aberácie a alelických nerovnováhy, sme identifikovali exkluzívny oproti bežným udalostí medzi primárneho nádoru a metastáz. Jediným spoločným genetická aberácie zahŕňal p ramienku chromozómu 17. Celkovo nedostatok prekrytie bolo svedčí o značnej genetickej odlišnosti od primárneho nádoru a metastáz aj cez spoločný pôvod ako je označené zdieľané mutáciami v kritických nádorových supresor.
Genómovej intervaly LOH, číslo kópie aberáciu a preskupené udalosti boli porovnané s pozíciou potvrdených génových mutácií. Tento integrovaný analýza ukázala na radu génov, ktoré mali biallelic zmeny zahŕňajúca ako stratu divoké alely z veľkého intervalu genómovej aberácie a mutantný alely. Výsledky pre gény s biallelic hitov boli považované za silné kandidátmi pre strata-of-funkcie zapojenie do karcinómu (Tabuľka 1).
Identifikácia vodičov rakovinových spoločné primárneho nádoru a metastáz
ako primárny a metastáza obsahovala ovládače rakovina účinky, ktoré boli pravdepodobne rozhodujúce pre vzniku nádorov v súvislosti s počiatočným CDH1
mutácie (tabuľka 1, obrázok 2). Okrem zárodočnej línie CDH1
intronové mutácie, druhý CDH1
alela mal somatická 77 bp genómovej vypustenie časti exónu 9, ktoré majú vplyv na nadväzujúcom kódujúcich oblastí rovnako. V CDH1
somatická mutácia bola rovnaká v oboch primárnej a metastatické rakoviny žalúdka genómov sa, čo ukazuje spoločný genetický pôvod a poskytuje silný genetický dôkaz, že tento vodič kritickú úlohu v difúzny žalúdočnej vzniku nádorov. Mutácie, ktoré ovplyvňujú CDH1
exón 9, ktoré vedú k strate expresie proteínu boli často zistené v difúznym karcinómu žalúdka [18] - [20]. Sekvencia aminokyselín tohto exón je domnelý vápnik viažuci miesto, ktoré bude pravdepodobne dôležitý pre funkciu receptora
primárnej a metastázy nádoru tiež zdieľa biallelic zostrihu donorové miesto mutácie. (C.559 + 1G > A) piateho IntronA TP53 stroje a LOH udalosť chromozómu 17p zahŕňajúce TP53
locus (prídavné súboru 1: Obrázok S1). TP53
zostrih mutácie preruší RNA zostrih [21] a je to už bolo skôr oznámené rakoviny mutácie [22], [23]. Analýzy sporadických a zdedených karcinómov žalúdka boli identifikované TP53
mutácie, ktoré sa vyskytujú súčasne s CDH1
mutáciou [24], [25]. CDH1
inaktivácia v žalúdočných parietálnych bunkách neindukuje karcinóm žalúdka, čo naznačuje, že strata CDH1
nestačí k iniciácii nádoru [26]. Avšak, dvojitá podmienečný knockout CDH1 stroje a TP53
indukuje vývoj difúzneho karcinómu žalúdka [26]. Je zaujímavé, že genomická interval udalosti LOH ovplyvňujúce TP53
lokuse bola väčšia v porovnaní s metastázami primárneho nádoru. To by mohlo dôjsť z dôvodu nezávislých genomické nestability akcií vzhľadom k veľkému výberu pre biallelic strata funkcie TP53.
FGFRis napadnuteľný ovládač rakoviny výhradne pre primárny nádor žalúdka
primárneho nádoru, tam bol šesťnásobný genomické amplifikácia oblasti chromozómu 10 q paže a zakryl interval 1,66 Mb. V rámci tejto oblastiach genómu bol onkogénne FGFR2 kandidát ovládač
tiež označovaný ako fibroblastový rastový faktor receptor 2 (obrázok 3c). To bolo potvrdené s niekoľkými metódami, vrátane sekvenovania, analýzu poľa a validáciu kvantitatívnej PCR. FGFR2 je transmembránový receptor, ktorý sa chová ako časť kľúčový signálne transdukcia reguláciu obnove tkaniva a embryonálneho vývoja z celej rady ďalších funkcií [26].
K potvrdení výskytu FGFR2
zosilnenie v difúznej proti karcinómov žalúdka čriev sme analyzovali 37 rozptýlené a 27 črevné podtypu primárnej žalúdočných vzoriek nádoru s digitálnym PCR [27]. Predtým sme ukázali, že táto metóda je hlboko citlivý na detekciu počtom kópií aberáciu dokonca aj v rámci normálnej diploidný DNA riedenie nádorové DNA. Naše štúdie preukázali, FGFR2
zosilnenie v štyroch z 37 (11%) vzoriek difúzna nádoru, ktorý bol prítomný vo vzorkách črevnej podtypu (obrázok 4a). Obrázok 4 Prevalencia FGFR2 v ľudských nádorov žalúdka a jej príspevok k bunkovej proliferácii. (A) Ojedinelé vzorky rakovina žalúdka boli vyhodnotené pomocou kvantitatívnej PCR digitálnej určiť FGFR2 číslo genómovej kópie. Čierne bodky predstavujú difúzny žalúdočné rakoviny. Červené bodky označujú črevné podtyp rakoviny žalúdka. (B) Genetické vlastnosti AGS (FGFR2
diploidný) a KatoIII (FGFR2 zosilnený) žalúdočné rakovina bunkové línie sú uvedené. (C) Percento prežitie pre AGS rakovina bunkové línie je zobrazený s inhibítory FGFR2 rôzneho špecificitu. (D) KatoIII difúzna žalúdočné rakovina bunkové línie sa spracuje s inhibítormi FGFR2 rôzneho špecificitu. Y-os znázorňuje percento prežitia oproti
osi X s koncentráciou protokolu. Vo všetkých paneloch, chybové úsečky predstavujú štandardné chybu strednej hodnoty. Rozdiel v percentách prežitie buniek medzi KatoIII a AGS buniek bol štatisticky významný (P Hotel < 0,05). Na troch najvyšších koncentráciách všetkých drog, okrem Brivanib čo bol jediný významný pri najvyššej koncentrácii
na podporu svojich role ako žiadateľ sám, FGFR2
zosilnenie je prítomný v množstve žalúdočnej rakovinové bunkové línie [28], [29] a následne zaznamenaných v rôznych gastrointestinálnych malignít, ako je adenokarcinóm pažeráka [30]. Okrem toho, liečenie nádorových bunkových línií s nízkomolekulárnych inhibítorov FGFR2 špecifické alebo shRNAs vedie k silnej inhibíciu rastu [28], čo naznačuje funkčné úlohu FGFR2
zosilnenie v difúznej podtypu.
Funkčná analýza vodiča FGFR2 v kombinácia s CDH1 a TP53
Identifikovali sme dva príklady primárnej difúzny rakoviny žalúdka pri súčasnom výskyte známych a predpokladaných vodičov s rakovinou zahŕňajúce CDH1
TP53 stroje a FGFR2
ako je vidieť u pacienta indexe , Prvý príklad zahŕňal difúzna žalúdočné vzorka rakoviny, ktorá bola medzi žalúdočných adenokarcinómov analyzovaných TCGA. Používanie portálu cBio TCGA [10], sme identifikovali pacienta (TCGA-BR-6803), ktorý mal podobný doplnok genetických aberácií v CDH1
TP53 stroje a FGFR2
, z ktorých všetky boli už bolo popísané u rakoviny, ako je vidieť v kozmickom rakoviny mutácie úložiska. To zahŕňa nasledujúce: a missense mutácie v CDH1
(D254Y), ktorá bola popísaná v troch ďalších typov rakoviny; missense mutácie (L130F) v TP53
, kde mutácie v tomto kodóne boli zaznamenané v 37 ďalších typov rakoviny; v FGFR2
zosilnenie, ktoré sme identifikovali a iní v difúznym karcinómu žalúdka.
Ako druhý príklad, sme identifikovali ľudské difúzny karcinómu žalúdka bunkové línie, KatoIII, ktorý má podobné zloženie genetických odchýlok, ktoré ovplyvňujú rovnaké gény s rakovinou ako primárneho nádoru nášho indexu pacienta. KatoIII má CDH1
mutáciu vedúcu k IntronA vkladanie sekvencie v mRNA [31], [32], čo je TP53
mutácia vedúca k vymazaniu kompletného génu [33] a FGFR2
zosilnenie [29] (obrázok 4b). Táto bunková línia nám umožnilo zhodnotiť potenciálnu onkogénne úlohu FGFR2
zosilnenie v špecifickom kontexte genetickej CDH1 stroje a TP53
mutácie, podobne ako u primárneho nádoru indexe pacienta.
S cieľom určiť príspevok FGFR signalizácia rastom neoplastických, sme liečili KatoIII bunky s niekoľkými malými molekulami FGFR2 tyrozín-kinázy (TKI), vrátane Brivanib, TKI258, Ponatinib a AZD4547 [34]. Ako kontrola, sme použili žalúdočné rakovina bunkovú líniu, ktorá je AGS divokého typu pre FGFR2
CDH1 stroje a TP53
, ale má mutácie v géne KRAS stroje a PIK3CA
[35] ( obrázok 4b). Všetky inhibítory FGFR2 indukovanej bunkovej smrti v KatoIII ale nie AGS bunky (Obrázok 4C a d). Najsilnejší z nich TKI, AZD4547, má IC 50 o približne 2 nM v KatoIII bunkách a 39,580 nM v AGS bunkách (Obrázok 4c a D). Každý z inhibítorov preukázala štatisticky významný nižšia IC 50 FGFR2-amplifikovanej KatoIII buniek v porovnaní s non-FGFR2-zosilnený AGS bunky vo všetkých testovaných koncentráciách (obrázok 4c a d). Na rozdiel od
, liečba a KatoIII AGS bunky s cytotoxickými chemoterapeutikami ako paclitaxel, 5-fluóruracilu sú a karboplatinou nemala významný vplyv na oboch KatoIII alebo AGS liniek, s podobným IC 50 identifikovaných v každej (ďalší súbor 1: Tabuľka S7). Pre AZD4547 je 20000-násobný rozdiel v citlivosti na FGFR inhibítorov naznačujú, že FGF signalizácia je rozhodujúci vodič CDH1
-initiated žalúdočné bunkovej proliferáciu, a to TKI predstavuje potenciálne cielenú terapiu rozptýlených podtypu rakoviny nesúcich
FGFR2 amplifikácie.
Biallelic inaktiváciu TGFBRis exkluzívne k ovariálnej metastázy
Genetická divergencia bola evidentná; metastáza kryl svoju vlastnú jedinečnú podmnožinu mutácií a genomických aberácií.

• Botulotoxín v žalúdku submukóze znižuje stimulovanej produkcie HCl v rats
• Predikcia metachronních viac primárnych nádorov po kuratívny resekcii žalúdka cancer