Metastatisk tumor evolusjon og organoid modellering implisere TGFBR2as en kreft driver i diffuse magekreft

Metastatisk tumor evolusjon og organoid modellering implisere TGFBR2
som en kreft driver i diffuse magekreft
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er den nest største årsaken til global kreftdødsfall, med metastatisk sykdom som representerer den primære årsaken for dødelighet. For å identifisere kandidat bilførere som er involvert i onkogenese og tumor evolusjon, gjennomfører vi en omfattende genomsekvense analyse av metastatisk progresjon i en diffus magekreft. Dette innebærer en sammenligning mellom en primær svulst fra en arvelig diffuse magekreft syndrom proband og gjentagelse som en ovarian metastase
. Resultater
Både primærtumor og eggstokkreft metastase har felles biallelic tap-av-funksjon av både CDH1 Hotell og TP53
tumor dempere, noe som indikerer en felles genetisk opphav. Mens den primære tumor utstillinger forsterkning av fibroblast vekstfaktor-reseptor 2 (FGFR2
) genet, metastase særlig mangler FGFR2
forsterkning men heller besitter unike biallelic endringer av Transforming growth factor-beta-reseptor 2 (TGFBR2
) indikerer den avvikende in vivo
utviklingen av en TGFBR2
-mutant metastatisk klonal befolkningen i denne pasienten. Som TGFBR2
mutasjoner som ikke tidligere har vært funksjonelt validert i magekreft, modellert vi det metastatiske potensiale av TGFBR2 tap i en murin tre-dimensjonal primære gastrisk organoid kultur. Den Tgfbr2
shRNA knockdown innen Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoids genererer invasjon in vitro Hotell og robust metastatisk tumorigenicity in vivo
, bekrefter Tgfbr2
metastase supressoraktiviteten
Konklusjoner
Vi dokumentere metastatisk differensiering og genetisk heterogenitet av diffuse magekreft og avdekke potensielle metastatisk rolle TGFBR2
tap-av-funksjon. Til støtte for denne studien, bruker vi en mus primær organoid dyrkingsmetoden i stand til å rekapitulere in vivo
magekreft med spredning. Samlet beskriver vi en integrert tilnærming til å identifisere og funksjonelt validere mulige kreft bilførere som er involvert i metastasering.
Bakgrunn
Worldwide, adenokarsinom i ventrikkel er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn og kvinner. Basert på karakteristiske histopatologiske funksjoner, er adenokarsinom i ventrikkel kategorisert i diffuse og tarm subtyper [1]. I form av histopatologi, diffuse magekreft er generelt udifferensiert, ofte har signet celle ring funksjoner og invasiv infiltrere normal mage vev. I motsetning til dette, har den intestinale epitel-subtype egenskaper og danner diskrete tumormasser som ligner på tykktarmskreft. Diffus magekreft har en høyere forekomst av metastatisk sykdom, og en generelt dårligere prognose i forhold til tarm subtype [2], [3]. Foreløpig har de genomiske analyser av diffuse magekreft involvert et lite antall prøver, inkludert en fersk undersøkelse utført av Kreft Genome Atlas Project (TCGA) og en hel genom sekvense undersøkelse av et sett med diffuse magesvulster [4]. Men det er få, om noen, studier at detalj metastatisk utskilling av magekreft; metastatiske svulster er vanligvis fraværende fra store genomiske kreftundersøkelser som TCGA. Totalt sett lite er kjent om onkogene prosessen og tumor utvikling av magekreft med spredning til tross for sin overordnet klinisk betydning [5].
I arvelig diffuse magekreft (HDGC), germline mutasjoner i CDH1 plakater (det vil si, E- cadherin) gi en 70% risiko for å rammes diffuse magekreft [6], [7]. Den CDH1
tumor suppressor genet koder for E-cadherin, et trans glykoprotein som formidler kalsiumavhengig celle-celle adhesjon. Endringer i CDH1 funksjon påvirker epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) som har vært innblandet som å spille en rolle i tumorigenesis. Studier av berørte HDGC individers svulster gir en unik mulighet til å bestemme viktige drivere av diffuse magekreft i sammenheng med CDH1
tap av funksjon. Støtte bevis av rollen CDH1
i sporadiske diffuse magekreft omfatter observasjon at 50% inneholder CDH1
mutasjoner eller hypermethylation av CDH1
promoter [8], [9]. En fersk hel genom sekvense kartlegging av diffuse magekreft også identifisert hyppige CDH1
mutasjoner som den vanligste driver aktivitet [4]. De TCGA magekreft data viser også en høy frekvens av somatiske CDH1
mutasjoner [10]. Betydelig mindre er kjent om identitet og rolle co-forekommende drivere som bidrar til å spre magemetastaser.
Heri, rapporterer vi en studie av metastatisk evolusjonsprosessen i diffuse magekreft. Vårt mål var å identifisere kjente og kandidat drivere som avgrense den tumorprogresjon under metastase. Vi utførte en omfattende genomsekvensanalyse av en primær magetumor og metastase fra et individ med en kimlinje CDH1
mutasjon (figur 1) som presentert med en gastrisk primær, etterfulgt etter 3 år av metastase i venstre eggstokk. Gitt den eksisterende germline mutasjon i CDH1,
kreft genomet krever bare et sekund allel hit via en somatisk genetisk avvik, som er demonstrert i svulsten fra denne personen. Fordi den første kreft driver hendelsen er kjent, mendelsk kreft genomer gir en sjelden og svært informativ `eksperiment i naturen" som gir en mulighet til å avgrense somatiske genetikk av metastasering. Genom sekvensanalyse av begge tumorer viste holdepunkter for en felles opprinnelse basert på felles mutasjoner, men større genomiske mangfold sees både ved nivået for mutasjonene, samt omfattende allelisk ubalanse og kopitall avvik for metatasis. Figur 1 Familie og klinisk historie av en mendelsk diffuse magekreft. Den stamtavle av indeksen pasienten 525 (III-1) er avbildet. Tumortyper er angitt med farge inkludert grønt for kreft i bukspyttkjertelen, rød for diffuse magekreft, og gult for brystkreft. Pasienten presenteres med hennes primære magekreft i en alder av 37 år. Tre år senere presenterte hun med et ubehag i magen. Kontrastforsterket skanning CT av bekkenet identifiserte en venstre eggstokk masse (gul sirkel) som ble bekreftet på biopsi for å være en diffus magekreft metastase (dvs. Krukenberg tumor). I løpet av metastatisk tumorutvikling, et antall kjente og kandidatkreft driver hendelser avgrenset tumorutvikling og genetisk divergens av metastase fra den primære tumoren.
Vi har bestemt om kandidat driverne fra denne metastatisk progresjon var tilstrekkelig for å reprodusere diffus magekreft. Vår kreft modellering metoden som er benyttet i vitro
mage organoids og gjør det mulig å konstruere den genetiske driver sammenheng med disse kreftformene og studere prosessen med metastatisk evolusjon og onkogen sti divergens. Integrering genetisk analyse og biologisk modellering, bestemt vi den uavhengige rollen TGFBR2 plakater (transformerende vekstfaktor-β-reseptor 2) i onkogenese av diffuse magekreft. Vårt eksperimentelle kreft modellering er avhengig av en luft-væske-grenseflate for musetarmkulturen som inneholder både epiteliale og mesenchymale elementer, nøyaktig sammenfatter langvarig proliferasjon, multilineage differensiering, Wnt /Notch-avhengige stamcelle nisje, og peristaltikk [11]. Vi rapporterte en analog primære mage organoid kultur system som nøyaktig sammenfatter multilineage epitelial differensiering og stromal elementer [12]. Nylig oppnådde vi robust in vitro
onkogene transformasjon av primære mage, tykktarm og bukspyttkjertel organoids via mutasjoner i Kras Hotell og Trp53
, som induserer høygradig dysplasi og invasjon in vitro
med adenokarsinom på subkutan transplantasjon i mus [13]. Vi viser den funksjonelle validering av kandidat magekreft metastase drivere fra kreft genomisk profilering studier, med fokus på modellering TGFBR2
sjåføren som bevis på prinsipp.
Resultater
Diffuse magekreft og metastatisk progresjon
I en alder av 37 år, ble indeksen pasienten (525) diagnostisert med stadium III (T3N1M0) dårlig differensiert diffuse mage adenokarsinom (figur 1). Hennes 42 år gamle søster ble diagnostisert med diffuse mage adenokarsinom 2 måneder tidligere. Basert på familiens historie av magekreft og den uvanlig ung alder av utbruddet, hun gjennomgikk kimcellelinje CDH1
mutasjonstesting. Pasienten og hennes søster ble funnet å ha en germline spleisesete mutasjon i intron 10 (c.1565 + 2insT). Dette germline mutasjon ble senere rapportert i en annen familie med arvelig diffuse magekreft (HDGC) [14]. Pasienten gjennomgikk en total gastrektomi for å fjerne sin primærtumor og ble funnet å ha en enkelt lymfeknutemetastase. Hun fikk standard adjuvant behandling inkludert kombinert kjemoterapi (cisplatinaindusert og 5-fluorouracil) og stråling. Tre år etter hennes første presentasjonen, pasienten rapporterte progressive lavere abdominal fylde. En computertomografi (CT) scan viste en stor bekken masse i samsvar med et venstre eggstokk-metastasering (figur 1). Deretter pasienten gjennomgikk laparotomi med bilateral salpingo-ooforektomi og biopsi av tumor i bekkenet. Patologiske studier vist metastatisk adenocarcinom involverer eggstokk, ellers referert til som et Krukenberg tumor, med den samme histologisk utseende som den primære tumor. En studie rapporterte at blant diffuse magekreft med metastatisk spredning, eggstokk var en metastatisk område i 28,8% av tilfellene [15]. Således er det eggstokk et vanlig sted for metastatisk sykdom.
Cancer genomsekvensanalyse
Både exome og hele genomet sammenkoblet ende sekvensering ble utført på den primære tumor, eggstokkmetastase, og normalt vev som omfattet blod og normal gastrisk vev (tilleggsfiler 1: Tabell S1). Vev fra lymfeknutemetastase ikke var tilgjengelig for analyse. Flere sekvenseringsmetoder ble anvendt for å kompensere for omfanget av normal stromal blanding, et direkte resultat av den infiltrerende invasivitet av den diffuse magekreft subtype. Vi har fastslått omfanget av normal genom blanding og korrigert for inkludering av normal DNA (Tilleggs fil 1: Metoder). Gitt kompleksiteten i tumorprøver, gjennomførte vi en ekstra runde med målrettet sekvensering for å bekrefte tilstedeværelse av mutasjoner og andre genetiske avvik som skjedde i eksoner, i nærheten ekson grenser eller arrangører.
Totalt fikk vi mer enn 100 × gjennomsnittlig dekning for hver exome og generelt avhengig av exome data for oppdagelse av kodende region mutasjoner. For hele genomsekvensering, hadde vi større enn 60 × gjennomsnittlig dekning for den primære kreft hele genomet prøven og 30 × for metastatisk genom. Hele genomsekvensering ble brukt for å identifisere større skala genetiske avvik som kopier antall variasjon (CNVs), allele ubalanser, rearrangements, og andre klasser av strukturelle rearrangements. Etter justering, gjennomførte vi variant ringer for å identifisere somatiske mutasjoner og andre klasser av genetiske avvik. Dette inkluderte somatiske mutasjoner, innsetting-slettinger (indels), CNVs, tap-av-heterozygositet regioner (LOH) og kreft rearrangements (Tilleggs fil 1: Tabell S3 og tabell S4). Som en kontroll for enkelt nukleotid variant kall, genotypet vi prøvene med Affymetrix 6,0 enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) arrays; vi sammenlignet genotypene til de identifiserte SNPS fra sekvensdataene. Den konkordans av exome og hele genomet SNP data til array data var 99%.
Kodende region mutasjoner og validering med dyp sekvense
Vi identifiserte mutasjoner som skjedde i eksoner og intronic mutasjoner innenfor 100 baser av ekson grensen og resultatene er oppsummert i Tilleggs fil 1: Tabell S2. Som nevnt tidligere, tumor prøver hadde kompleks sammensetning som reduserte sekvensen dekning av enkelte mutasjoner. Vi fortsatte med en ekstra runde med målrettet sekvensering for å validere disse mutasjonene og bestemme deres tilstedeværelse i både svulster. Vi laget en analyse for dyp målrettet resequencing som dekket omtrent 300 baser rundt den spesifikke mutasjonen loci (tilleggsfiler 1: Tabell S5). Den gjennomsnittlige målrettet sekvensering dekning for hver antatte mutasjon eller loci var 278 × for normal, 251 × for primærtumor og 152 × for metastasering.
Mellom de to svulster, vi uavhengig validert totalt 77 mutasjoner som har oppstått innenfor eller proksimalt for eksoner (Tilleggs fil 1: Metoder og tabell S5). Validerte genetiske avvik som følger med: (1) ikke-synonyme mutasjoner, (2) synonyme mutasjoner, (3) innsettinger, eller (4) slettinger. Med målrettet sekvensering av data, bestemt vi mutasjonen alleliske frekvens (MAF) mellom det primære tumor og metastase for hver mutasjon. Dette innebærer å bestemme den fraksjon av en sekvens leses med en mutasjon i forhold til referansesekvensen leser. Vi var i stand til å identifisere hvilke mutasjoner var vanlig eller eksklusivt til den primære svulsten versus metastase. Blant de 77 validerte mutasjoner, fordelingen var slik at mutasjoner var vanligvis et unikt enten til primærtumor eller metastatisk nettstedet. For eksempel, den primære svulsten hadde åtte mutasjoner som ikke var tilstede i den metastasering, mens metastase hadde 37 mutasjoner som ikke finnes i den primære tumor. Felles for begge typer kreft var 32 mutasjoner.
Gitt intervall på tre år forut for påvisning av metastase, er det en mulighet for at de metastasespesifikke mutasjoner funnet sted uavhengig av den primære tumor. Mutasjoner er spesifikke for den primære svulsten som ikke var til stede i eggstokkene metastaser kan ha vært et resultat av tilfeldig genetisk drift. Mutasjonene er felles for både indikere et felles opphav, men det eksakte tidspunktet for differensiering mellom de to svulstene er mindre klart som det fremgår av de mutasjoner med lavere MAF. En undergruppe av disse genene hadde høye MAF-verdier, noe som indikerer en høyere sannsynlighet for å være tilstede i alle klonale populasjoner i det primære tumor eller metastase. Som vi beskriver senere ble disse genene prioritert for videre eksperimentell testing i mage organoids.
Mutasjoner som påvirker gen-funksjon
Blant de mutasjonene som ble eksternt validert, vi fokusert på den delen av mutasjoner fører til aminosyresubstitusjoner tidlig stopp kodoner og indels som endret den åpne leseramme. Deretter fant vi ut om disse kode mutasjonene var potensielt skadelig for gen-funksjon ved hjelp av en rekke prediksjon algoritmer som Polyphen [16] og sile [17] blant andre. Basert på den MAF informasjon for hver mutasjon, vi fastslått om disse mutasjonene med en mulig skadelig innvirkning på genproduktene var vanlig eller eksklusivt til den primære tumor og metastase (figur 2). Figur 2 Sammenligning av de genetiske avvik i den primære tumor og metastase. Felles versus
eksklusive genetiske avvik sammenlignes mellom de to kreft genomer. (A) Gener med kode mutasjoner som har en potensiell skadelig virkning er oppført. Disse genene er klassifisert basert på om de er eksklusive (røde tegn) eller vanlige (grønne tegn) til primærtumor og metastaser. Mutasjonene som alle fører til forandringer i aminosyre-sammensetning av genproduktet og ble identifisert til å ha en vesentlig endring med en høy sannsynlighet for å påvirke genproduktet funksjon. (B) En sammenfatning av kromosomale avvik er vist over hele kreft genomet av begge tumorer. Dette omfatter kopiantall variasjon (CNV) eller tap av heterozygositet (LOH). De røde blokkene indikerer hendelser eksklusive til primærtumor eller metastasering. De grønne blokkene angir hendelser som er felles for begge. Antall hendelser per kromosom er oppført i hver blokk. Pilene viser LOH hendelser eller slettinger som omfatter p arm, q arm, eller hele kromosom. Røde piler indikerer kromosomavvik som er eksklusive og grønne pilene viser hendelser som er felles.
På undergruppe av skadelige mutasjoner, har vi gjennomført ytterligere biologisk sti analyse, litteraturgjennomgang og sammenligning mot kreft Genome Atlas data tilgjengelig for diffuse magekreft. Dette identifisert et sett med kjente kreftgener og sannsynlige kreftrelaterte kandidater med mutasjoner som sannsynligvis hadde en innvirkning på protein funksjon. Vi fokuserte på en rekke kandidat driver gener (tabell 1) som tidligere hadde vist seg å ha onkogene potensielle eller var kjent tumor dempere med biallelic endringer stede i kreft genomes.Table 1 Kreft onkogener med presiseringer eller kreft drivere med biallelic hendelser
Hvor stammer
kjent eller kandidat kreft driver
biallelic hendelsen
Allelic endring 1
Mutation eller genomisk aberrasjon
Chr

Chr posisjon eller intervall
Allelic endring 2
Unikt for den primære
FGFR2 *
Amplification
6-fold forsterkning
10
117820033 til 119748751
Felles for primærtumor og metastaser
CDH1
Ja
sletting
delvis sletting av ekson 9
16
68847326-68847403
germline mutasjon i CDH1
TP53
Ja
5 'spleisesete mutasjon
Aberrant spleising
17
7.578.370
hemizygous tap av 17p arm
Unikt for metastase
TGFBR2
Ja
rammeskifte Indel
stoppkodon i exon 4
3
30691871
hemizygous sletting av vill type TGFBR2
locus
PCDH7
Ja
missense
S87R
4
30723305
hemizygous sletting av vill type 4 arm
FERMT1
loci
Ja
Tap av heterozygositet
FERMT
en ligger i 20p12.3
20
FERMT
en mutasjon
BMP7
loci
Ja
Tap av heterozygositet
BMP7
ligger i 20q13.3
20
BMP7
mutasjon
Chr. kromosom
kopiantall variasjoner og allele ubalanser skille den primære svulsten fra metastaser
Vi merket større skala genomiske avvik som differensiert primær fra metastaser (Tall 2b og 3a). Dette inkluderte kopinummerendringer og LOH hendelser. Unikt for den primære svulsten var to genomiske presiseringer om kromosomer 5 og 10, og to inversjoner på kromosom 15 og 16 (tilleggsfiler 1: Tabell S4). Den kromosom 10 forsterkning dekket 1.66 Mb intervall. Når du vurderer slettinger eller allele ubalanser, den eneste store hendelse som ble notert involvert tap av p arm av kromosom 17. Figur 3 Genetisk divergens av eggstokkreft metastaser fra primærmagekreft for kritiske kandidat drivere. Den genomisk posisjon av mutasjonen, kopiere antall variasjoner (CNV) regioner eller tap-av-heterozygositet (LOH) intervaller er vist fra kreft genomer. For kromosom tomter, Y-aksen angir stilling med den respektive kromosomet, dens lengde i megabases (MB) og ideogrammet betegnelse som vises til venstre for kopiantall profilen. Skadelige mutasjoner er vist som piler eske med genet symbol. (A) genom bred fordeling av kreftspesifikke CNVs og LOH intervaller er oppsummert i alle kromosomene for den primære tumor og metastase. (B) på kromosom 3, metastase hadde unike biallelic hendelser som involverer en skadelig TGFBR2
mutasjon og en genomisk sletting påvirke den andre allelet som tydeligst med LOH intervaller. Sekundært til genomiske delesjoner, er LOH vist som et skifte i den mindre alleliske frekvensforhold verdi på -1 og korrelerer med et genomisk delesjon. (C) på kromosom 10, den FGFR2
-genet ble lokalisert i en genomisk region amplifikasjon sett bare i den primære og ikke den metastasering. Forsterkningen er notert i en rød sirkel.
I motsetning til den primære svulsten, metastatisk tumor hadde mange kromosom skala LOH hendelser og genomiske slettinger som påvirker 12 forskjellige kromosomer, de fleste som er unike for metastatisk tumor (figur 2) . Dette inkluderte flere slettinger og kopiere nøytrale LOH hendelser som er beskrevet i tilleggsfiler 1: Tabell S3. Det var en fem-fold genomisk forsterkning i kromosom 2, men ingen konkrete kjent gener eksisterte i det berørte intervall. Det var ingen påvisbare inter-translokasjon i enten primærtumor eller metastase genomer. Andre kreft rearrangements ble identifisert, men ikke peke mot avvik i noen kandidat driver gener (tilleggsfiler 1: Tabell S4). Det var indikasjoner på stor skala genomisk ustabilitet basert på allel ubalanse analyse; kromosomer 14, 17, 20 og 22 alle involverte hele kromosomet.
For kopitall avvik og allele ubalanser, identifiserte vi eksklusive kontra vanlige hendelser mellom primærtumor og metastaser. Den eneste felles genetisk avvik omfattet p arm av kromosom 17. Totalt sett er mangelen på overlappingen var indikasjon på vesentlig genetisk avvik fra den primære tumor og metastasering til tross for en felles opprinnelse som er betegnet med delte mutasjoner i tumor kritiske suppressorer.
Genomiske intervaller av LOH, kopinummer aberrasjon og omorganisering hendelser ble sammenlignet med plasseringen av validerte genmutasjoner. Denne integrerte analysen viste til et antall gener som hadde biallelic modifikasjoner som involverer både et tap av villtype-allelet fra et stort intervall genomisk aberrasjon og et mutant allel. Resultatene for gener med biallelic treff ble ansett for å være sterke kandidater til et tap-av-funksjon engasjement i kreft (tabell 1).
Identifikasjon av kreft drivere felles for primærtumor og metastaser
Både grunnskolen og den metastase innedriver kreft hendelser som var sannsynlig å være kritisk for tumorgenese i sammenheng med den første CDH1
mutasjoner (tabell 1, figur 2). I tillegg til den kimlinje CDH1
intronic mutasjon, den andre CDH1
allele hadde en somatisk 77 bp genomisk delesjon av en del av ekson 9 som påvirker nedstrøms kodende områder i tillegg. Den CDH1
somatisk mutasjon var identisk i både primære og magekreft med spredning genomer, viser en felles genetisk opphav og gir sterk genetisk bevis for at denne sjåføren hadde en avgjørende rolle i diffuse mage tumorigenesis. Mutasjoner som påvirker CDH1
exon 9 som fører til tap av protein ekspresjon har ofte blitt påvist i diffus magekreft [18] - [20]. Dette exon er aminosyresekvensen er en antatt kalsiumbindingssted som sannsynligvis viktig for reseptor-funksjon
primære og metastatiske tumor delte også bialleliske spleisedonorsete mutasjon. (C.559 + 1G > A) av den femte intron av TP53
og et kromosom 17p LOH hendelse omfatter TP53
locus (tilleggsfiler 1: Figur S1). TP53
spleising mutasjon avbryter RNA-spleising [21] og er en tidligere rapportert kreft-mutasjonen [22], [23]. Analysene av sporadiske og arvet mage kreft har identifisert TP53
mutasjoner som oppstår samtidig med CDH1
mutasjon [24], [25]. CDH1
inaktivering i mage parietalceller induserer ikke magekreft, noe som tyder på at tap av CDH1
er utilstrekkelig for startfasen [26]. Men dobbel betinget knockout av CDH1 Hotell og TP53
induserer utvikling av diffuse magekreft [26]. Interessant, den genomiske intervallet for LOH arrangementet påvirker TP53
locus var større i den metastaser i forhold til primære tumor. Dette kunne ha oppstått på grunn av uavhengige genomisk ustabilitet hendelser gitt sterk seleksjon for biallelic tap av TP53 funksjon.
FGFRis en nyttig kreft driver eksklusivt til den primære mage svulst
I den primære svulsten, var det en seksdoblet genomisk amplifikasjon av en region av kromosom 10 q arm og dekket et intervall på 1,66 Mb. Innenfor denne genomiske regioner var en onkogen kandidat driver FGFR2
også referert til som fibroblast-vekstfaktor-reseptor 2 (figur 3c). Dette ble bekreftet med flere metoder, inkludert sekvensering, rekke analyse og validering av kvantitativ PCR. FGFR2 er et trans reseptor som fungerer som en del av en nøkkel signaltransduksjonsbane regulerer vev reparasjon og embryoutvikling blant en rekke andre funksjoner [26].
Å validere utbredelsen av FGFR2
forsterkning i diffuse versus intestinal mage kreft analyserte vi 37 diffus og 27 intestinal subtype primære mage tumorprøver med digital PCR [27]. Tidligere viste vi at denne metoden er dypt følsom for påvisning av kopiantall avvik, selv i forbindelse med normal diploid DNA fortynning tumor-DNA. Vår undersøkelse viste FGFR2
forsterkning i fire av 37 (11%) diffus tumorprøver, som var fraværende i de intestinale subtype prøvene (figur 4a). Figur 4 Utbredelse av FGFR2 i menneskelige mage svulster og dens bidrag til mobilnettet spredning. (A) Sporadiske magekreft prøver ble evaluert ved kvantitativ digital-PCR for å bestemme FGFR2 genomkopiantall. Svarte prikker representerer diffuse magekreft. Røde prikker angir tarm subtype av magekreft. (B) genetiske egenskapene til de AGS (FGFR2
diploide) og KatoIII (FGFR2 forsterket) mage kreft cellelinjer vises. (C) Prosent overlevelse for AGS cancercellelinje er vist med FGFR2 inhibitorer av varierende spesifisitet. (D) KatoIII diffus magecancer-cellelinjen ble behandlet med FGFR2 inhibitorer av varierende spesifisitet. Y-aksen viser prosent overlevelse versus
X-aksen med log konsentrasjoner. I alle paneler, Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. Forskjellen i prosent celle overlevelse mellom KatoIII og AGS celler var statistisk signifikant (P
< 0,05). På de tre høyeste konsentrasjonene av alle rusmidler, bortsett Brivanib som var bare signifikant på høyeste konsentrasjonen
Til støtte for sin rolle som en kandidat driver, er FGFR2
forsterkning til stede i et antall av mage cancer-cellelinjer [28], [29] og senere rapportert i forskjellige gastrointestinale maligne lidelser som spiserørs adenokarsinom [30]. I tillegg er behandling av cancer cellelinjer med FGFR2-spesifikk lavmolekylære inhibitorer eller shRNAs fører til kraftig vekst-inhibering [28] tyder på en funksjonell rolle for FGFR2
forsterkning i den diffuse subtype.
Funksjonell analyse av FGFR2 føreren i kombinasjon med CDH1 og TP53
Vi identifiserte to eksempler på en primær diffuse magekreft med co-forekomst av kjente og antatte kreft drivere involverer CDH1
, TP53
, og FGFR2
sett i indeksen pasient . Det første eksempelet inkluderte en diffus magekreft prøve som var blant de mage adenokarsinomer analysert ved TCGA. Bruke cBio TCGA portal [10], identifiserte vi en pasient (TCGA-BR-6803) som hadde en lignende komplement av genetiske avvik i CDH1
, TP53
, og FGFR2
, som alle har vært tidligere beskrevet i kreft som sett i den kosmiske kreft mutasjon depotet. Dette inkluderte følgende: en missense mutasjon i CDH1 plakater (D254Y) som har blitt beskrevet i tre andre kreftformer; en missense mutasjon (L130F) i TP53
hvor mutasjoner i dette kodon er rapportert hos 37 andre kreftformer; den FGFR2
forsterkning som vi og andre har identifisert i diffus magekreft.
Som det andre eksemplet har vi identifisert en human diffundere magekreft cellelinje, KatoIII, som har en lignende sammensetning av genetiske avvik som påvirker de samme kreftgener som den primære svulst i indeksen vår pasient. KatoIII har en CDH1
mutasjon fører til en intronic sekvens benytte i mRNA [31], [32], en TP53
mutasjon fører til en komplett gen sletting [33] og FGFR2
forsterkning [29] (figur 4b). Denne cellelinje tillater oss til å vurdere den potensielle onkogene rolle FGFR2
forsterkning i den spesifikke genetiske sammenheng med CDH1
og TP53
mutasjoner, i likhet med indeks pasientens primære tumor.
Å bestemme bidraget av FGFR aliserte til neoplastisk vekst, behandlet vi KatoIII celler med flere FGFR2 lite molekyl tyrosin-kinase hemmere (TKI), inkludert Brivanib, TKI258, Ponatinib, og AZD4547 [34]. Som en kontroll, vi brukte magekreft cellelinje AGS som er villtype for FGFR2
, CDH1
, og TP53
, men har mutasjoner i KRAS Hotell og PIK3CA product: [35] ( Figur 4b). Alle FGFR2 hemmere indusert celledød i KatoIII men ikke AGS celler (Figur 4c og D). Den mest potente av disse TKI, AZD4547, har en IC 50 på omtrent 2 nM i KatoIII celler og 39 580 nM i AGS celler (Figur 4c og d). Hver av inhibitorer viste en statistisk signifikant lavere IC 50 i FGFR2-amplifisert KatoIII-celler sammenlignet med ikke-FGFR2-amplifisert AGS-celler ved alle konsentrasjoner som ble testet (figur 4c og d).
I kontrast til behandling av KatoIII og AGS celler med cytotoksiske kjemoterapeutika som paclitaxel, 5-fluorouracil og karboplatin ikke har en signifikant effekt på enten KatoIII eller AGS linjer, med lignende IC 50 identifisert i hver (tilleggsfiler 1: Tabell S7). For AZD4547, 20.000 ganger forskjell i følsomheten for FGFr hemmere tyder på at FGF signalering er en viktig driver for å CDH1
-klargjort mage cellulær proliferasjon og dette TKI representerer en potensiell målrettet terapi i diffuse subtype kreft husing FGFR2
presiseringer.
biallelic inaktivering av TGFBRis eksklusivt til eggstokkreft metastase
Genetisk divergens var tydelig; den metastase næret sin egen unike undergruppe av mutasjoner og genomiske avvik.

• Botulinum toxin i mage submucosa reduserer stimulert HCl produksjon hos rotter
• Prediksjon av metachronous flere primære kreft etter den kurative reseksjon av mage cancer