Tiopuriner kan hjälpa till att stoppa viral replikation hos mänskliga coronavirus

Forskare från Institutionen för mikrobiologi och immunologi, Dalhousie University, University of Calgary, och Institutionen för biokemi och molekylärbiologi, University of British Columbia, Kanada, arbetat med mänskliga coronavirus i cellkulturer för att leta efter läkemedel som kan förhindra ackumulering och replikering av det allvarliga akuta andningssyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Deras studie med titeln, ”Tiopuriner aktiverar ett antiviralt utvecklat proteinsvar som blockerar viral glykoproteinackumulering i cellodlingsinfektionsmodell, ”Publicerades online som ett förtryck på webbplatsen bioRxiv* .

Vad är ett oveckat proteinsvar (UPR)?

Forskarna förklarade att virus som är inneslutna, som coronaviruset, har genetiskt material som kan koda membranproteiner som kan syntetiseras och modifieras i det endoplasmatiska retikulumet (ER) innan de kan transporteras till samlingsområdena för virionens delar.

Om ER -proteinets vikningskapacitet är överväldigad av för många virionpartiklar, det finns en överbelastning av utfällda proteiner i ER. Detta utlöser ett veckat proteinsvar (UPR). Detta aktiverar transkriptionsfaktorn-6 (ATF6), inositol som kräver enzym-1 (IRE1) och PKR-liknande endoplasmatiskt retikulumkinas (PERK). Dessa kan känna att akuten är stressad, och det finns således en syntes av grundläggande transkriptionsfaktorer för leucin -dragkedja (bZIP).

När UPR aktiveras, proteinvikningsförmågan hos ER ökar. Detta utlöser också ER-associerad nedbrytning (ERAD). Alla proteiner som inte viks ordentligt tas ut ur ER och bryts ned via 26S -proteasomen.

Tiopurinanaloger 6-TG och 6-TGo inducerar selektivt spänningskorn i IAV-infekterade celler. (A) Strukturdiagram över små molekyler som identifieras på skärmen. (B) Kvantifiering av bildning av EGFP-G3BP-foci i IAV-Udorn-infekterade (blå) eller håna (röda) infekterade celler behandlade med ökande doser av 6-TG och 6-TGo (överst) och representativa Cellomics-bilder av EGFP-kanal av behandlade celler med 30 | jM 6-TG och 6-TGo (botten). Vid 4 hpi, celler behandlades med 0, 1, 10 och 30 uM doser av tiopurinanaloger 6-tioguanin (6- TG) eller 6-tioguanosin (6-TGo). Vid 8 hpi, celler fixerades och färgades med Hoeschst 33342. Automatiserad bildtagning utfördes med en Cellomics Arrayscan VTI HCS -läsare. 15 bilder togs för varje brunn och genomsnittlig punkterad EGFP-G3BP1-intensitet beräknades. (C) A549-celler infekterades med IAV-CA/07 vid en MOI på 1. Vid 4 hpi, celler behandlades med 6-TG eller mock-behandlade. Vid 8 hpi, celler fixerades och immunfärgades med antikroppar riktade mot stressgranulatmarkörproteiner G3BP1 (röd), PABP (grön) och en polyklonal IAV -antikropp (blå) som detekterar antigener från NP, M1, och HA, följt av färgning med Alexa-konjugerade sekundära antikroppar. (D) A549-celler infekterades med IAV-CA/07 vid en MOI på 1. Vid 4 hpi, celler behandlades med 6-TG (10 | jM). Vid 8 hpi, celler fixerades och immunfärgades med antikroppar riktade mot stressgranulatmarkörproteiner G3BP1 (röd), TIAR (grön) och eIF3A (grön), följt av färgning med Alexa-konjugerade sekundära antikroppar. Bilder tagna med ett Zeiss Axioimager Z2 fluorescerande mikroskop. Representativa bilder visas. Skalstaplar representerar 20 µm.

Överväldigande av ER under viral replikation

När viruspartikeln invaderar en cell, den försöker replikera snabbt, och detta belastar akuten. Viruset frigör utbrott av glykoproteiner som överväldigar ER. Viruset, dock, kan kringgå UPR och främjar effektiv replikering.

Tekniker som används av influensa A -virus (IAV)

IAV kan koda tre integrerade membranproteiner:hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och matrisprotein 2 (M2). Medan IAV -replikationen orsakar selektiv aktivering av UPR, specifika mekanismer kan aktivera UPR men sedan kringgå den för att främja effektiv viral replikation. Teamet förklarar att effekterna av NA- och M2 -proteiner på UPR inte är tydliga, men HA kan främja UPR.

Coronavirus och UPR

Flera coronavirus (CoV) kan aktivera UPR. Detta inkluderar ”infektiöst bronkitvirus (IBV), mushepatitvirus (MHV), överförbart gastroenteritvirus (TGEV), mänskligt coronavirus (HCoV) -OC43, och SARS-CoV-1. ” Hela den genetiska sekvensen, dock, reagerar inte på samma sätt som CoV -replikationen.

Tiopurin och virusreplikationen

Teamet identifierade två FDA-godkända tiopurinanaloger kallade "6- tioguanin (6-TG) och 6-tioguanosin (6-TGo)". Dessa befanns blockera IAV- och HCoV-OC43-replikation när deras dos ökades gradvis.

Pateamine A och Silvestrol hade testats tidigare. Dessa två tiopuriner, dock, befanns störa processen för ackumulering av virala glykoproteiner som kunde aktivera UPR. I cellerna som hade behandlats med 6-TG, den virala glykoproteinsyntesen kunde delvis återställas genom den kemiska inhiberingen av UPR.

CoV Spike (S) -proteiner som uttrycks på virusets yta visade UPR -aktivering. S-proteinet från det nya coronaviruset eller SARS-CoV-2 S orsakade också UPR-aktivering. 6-TG inhiberade ackumulering av S0- eller furinklyvda S2-fusionsproteiner i full längd, noterade de. Det påverkade inte S1 -ektodomänen. 6-TG kan inducera UPR som påskyndar ERAD-medierad omsättning av membranförankrade S0- och S2-glykoproteiner, laget hittade.

6-merkaptopurin (6-MP) har ingen sådan effekt

Forskarna experimenterade och fann att en kemiskt liknande förening tiopurin 6-merkaptopurin (6-MP) hade liten effekt på UPR och påverkade inte replikationen av IAV HCoV-OC43.

Fundera över mekanismen för UPR-induktion av tiopurinföreningarna 6-TG och 6-TGo, laget skrev att dessa effekter sannolikt inte kommer att förmedlas genom DNA eller RNA-införlivande av 6-TG på grund av flera skäl. Den första anledningen är att stressen i samband med viral replikation inte specifikt inducerar UPR. Den andra anledningen är att bland virala proteiner, ackumuleringen av glykoproteiner och deras behandling avbröts selektivt. Den tredje anledningen var att budbärar -RNA -nivåerna av HA och NA i IAV inte påverkades signifikant. 6 MP, å andra sidan, kan omvandlas till 6-tioguanosintrifosfat men inducerade inte UPR och hade inga effekter på IAV-glykoproteiner eller OC43-replikation.

Slutsatser och konsekvenser

Teamet skrev att deras data avslöjar att "UPR-inducerande molekyler kan vara effektiva värdinriktade antiviraler mot virus som är beroende av ER-processer för att stödja effektiv replikering." Induktion av UPR med 6-TG och 6-TGo kan således vara en ny metod genom vilken en antiviral mekanism kan utlösas av värdcellen själv. Detta har varit en tidigare okänd unik handlingsmekanism, skrev laget.

De skrev avslutningsvis "... dessa data indikerar att 6-TG och 6-TGo är effektiva värdinriktade antiviraler som utlöser UPR och stör ackumulering av virala glykoproteiner."

*Viktigt meddelande

medRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte är granskade och, därför, ska inte betraktas som avgörande, vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende, eller behandlas som etablerad information.

• UChicago genomforskare vinner NIH Directors New Innovator Award
• Studien ger ny inblick i mikrobiomerna från förindustriella jordbrukspopulationer