Tiopurini bi mogli pomoći u zaustavljanju replikacije virusa u humanih koronavirusa

Istraživači s Odjela za mikrobiologiju i imunologiju, Sveučilište Dalhousie, Sveučilište u Calgaryju, i Odjel za biokemiju i molekularnu biologiju, Sveučilište Britanske Kolumbije, Kanada, radio je s ljudskim koronavirusima u staničnim kulturama na traženju lijekova koji bi mogli spriječiti nakupljanje i umnožavanje teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2).

Njihova studija pod nazivom, „Tiopurini aktiviraju antivirusni proteinski odgovor koji blokira nakupljanje glikoproteina virusa u modelu infekcije stanične kulture, ”Objavljen je na internetu kao predispis bioRxiv* .

Što je nerazvijeni proteinski odgovor (UPR)?

Istraživači su objasnili da virusi koji su omotani, poput koronavirusa, imaju genetski materijal koji može kodirati membranske proteine ​​koji se mogu sintetizirati i modificirati u endoplazmatskom retikulumu (ER) prije nego što se mogu transportirati u područja sastavljanja dijelova viriona.

Ako je kapacitet savijanja proteina ER preopterećen previše čestica viriona, dolazi do preopterećenja rasklopljenih proteina u ER -u. To pokreće nerazvijeni proteinski odgovor (UPR). Time se aktivira transkripcijski faktor-6 (ATF6), inozitol koji zahtijeva enzim-1 (IRE1) i PKR-sličnu endoplazmatsku retikulum kinazu (PERK). Oni mogu osjetiti da je hitna pomoć pod stresom, i tako dolazi do sinteze transkripcijskih faktora osnovnih leucinskih zatvarača (bZIP).

Kako se UPR aktivira, povećava se sposobnost savijanja proteina ER -a. Ovo također pokreće degradaciju povezanu s ER (ERAD). Svi proteini koji nisu pravilno savijeni iznose se iz ER -a i razgrađuju putem 26S proteasoma.

Analozi tiopurina 6-TG i 6-TGo selektivno izazivaju granule stresa u stanicama inficiranim IAV-om. (A) Strukturni dijagrami malih molekula identificiranih na ekranu. (B) Kvantificiranje formiranja žarišta EGFP-G3BP u zaraženim stanicama zaraženim IAV-Udorn (plavim) ili lažnim (crvenim) stanicama tretiranim povećanjem doza 6-TG i 6-TGo (gore) i reprezentativnim Cellomics slikama EGFP kanala tretiranih stanica s 30 µM 6-TG i 6-TGo (dolje). Pri 4 hpi, stanice su tretirane s 0, 1, 10 i 30 uM doza tiopurinskih analoga 6-tiogvanina (6- TG) ili 6-tiogvanozina (6-TGo). Pri 8 hpi, stanice su fiksirane i obojene Hoeschstom 33342. Automatsko snimanje slike izvedeno je pomoću čitača Cellosics Arrayscan VTI HCS. Za svaku jažicu je snimljeno 15 slika i izračunat je prosječni točkasti EGFP-G3BP1 intenzitet. (C) A549 stanice inficirane su IAV-CA/07 pri MOI-u 1. Na 4 hpi, stanice su tretirane sa 6-TG ili lažno tretirane. Pri 8 hpi, stanice su fiksirane i imunobojene antitijelima usmjerenim na proteine ​​markera granule stresa G3BP1 (crveno), PABP (zeleno) i poliklonsko IAV antitijelo (plavo) koje detektira antigene iz NP, M1, i HA, nakon čega slijedi bojenje sekundarnim antitijelima konjugiranim s Alexa. (D) A549 stanice inficirane su IAV-CA/07 pri MOI-u 1. Na 4 hpi, stanice su tretirane sa 6-TG (10 uM). Pri 8 hpi, stanice su fiksirane i imunološki obojene antitijelima usmjerenim na proteine ​​markera granule stresa G3BP1 (crveno), TIAR (zeleno) i eIF3A (zeleno), nakon čega slijedi bojenje sekundarnim antitijelima konjugiranim s Alexa. Slike snimljene fluorescentnim mikroskopom Zeiss Axioimager Z2. Prikazane reprezentativne slike. Šipke razmjera predstavljaju 20 µm.

Snažan ER tijekom replikacije virusa

Kad čestica virusa napadne stanicu, pokušava se brzo replicirati, a to opterećuje hitnu pomoć. Virus oslobađa nalete glikoproteina koji nadvladavaju ER. Virus, međutim, sposoban je zaobići UPR i promiče učinkovitu replikaciju.

Tehnike usvojene od virusa influence A (IAV)

IAV može kodirati tri integralna membranska proteina:hemaglutinin (HA), neuraminidaza (NA), i protein matrice 2 (M2). Dok replikacija IAV -a uzrokuje selektivnu aktivaciju UPR -a, određeni mehanizmi mogu aktivirati UPR, ali ga zatim zaobići kako bi potaknuli učinkovitu replikaciju virusa. Tim objašnjava da učinci NA i M2 proteina na UPR nisu jasni, ali HA može promicati UPR.

Koronavirusi i UPR

Nekoliko koronavirusa (CoV) mogu aktivirati UPR. To uključuje „virus infektivnog bronhitisa (IBV), mišji virus hepatitisa (MHV), prijenosni virus gastroenteritisa (TGEV), humani koronavirus (HCoV) -OC43, i SARS-CoV-1. " Cijeli genetski slijed, međutim, ne reagira slično na replikaciju CoV.

Replikacija tiopurina i virusa

Tim je identificirao dva analoga tiopurina koje je odobrila FDA, a koji se zovu "6- tioguanin (6-TG) i 6-tioguanozin (6-TGo)". Utvrđeno je da oni blokiraju replikaciju IAV-a i HCoV-OC43 kada se njihova doza povećala na stupanj.

Pateamin A i Silvestrol prethodno su testirani. Ova dva tiopurina, međutim, otkriveno je da ometaju proces nakupljanja virusnih glikoproteina koji bi mogli aktivirati UPR. U stanicama koje su tretirane 6-TG, sinteza virusnog glikoproteina mogla bi se djelomično obnoviti kemijskom inhibicijom UPR -a.

Proteini CoV Spike (S) koji su izraženi na površini virusa pokazali su UPR aktivaciju. S protein iz novog koronavirusa ili SARS-CoV-2 S također je uzrokovao UPR aktivaciju. 6-TG inhibira nakupljanje fuzijskih proteina S0 cijele dužine ili S2 cijepljenih furinom, primijetili su. Nije utjecao na S1 ektodonu. 6-TG bi mogao inducirati UPR koji ubrzava ERAD posredovani promet membranski usidrenih S0 i S2 glikoproteina, tim je pronašao.

6-merkaptopurin (6-MP) nema takav učinak

Znanstvenici su eksperimentirali i otkrili da kemijski sličan spoj tiopurin 6-merkaptopurin (6-MP) ima mali učinak na UPR i ne utječe na replikaciju IAV HCoV-OC43.

Razmišljanje o mehanizmu indukcije UPR-a tiopurinskim spojevima 6-TG i 6-TGo, tim je napisao da ti učinci vjerojatno neće biti posredovani ugradnjom 6-TG u DNK ili RNK iz nekoliko razloga. Prvi razlog je taj što stres povezan s replikacijom virusa ne izaziva specifično UPR. Drugi razlog je taj što među virusnim proteinima, nakupljanje glikoproteina i njihova obrada je selektivno poremećena. Treći razlog bio je taj što razine RNA glasnika HA i NA u IAV -u nisu bile značajno pogođene. 6 MP, s druge strane, može se pretvoriti u 6-tioguanozin trifosfat, ali nije inducirao UPR i nije imao učinka na IAV glikoproteine ​​ili replikaciju OC43.

Zaključci i implikacije

Tim je napisao da njihovi podaci otkrivaju da bi "molekule koje induciraju UPR mogle biti učinkoviti antivirusni lijekovi usmjereni na domaćina protiv virusa koji ovise o ER procesima kako bi podržali učinkovitu replikaciju". Indukcija UPR-a pomoću 6-TG i 6-TGo mogla bi stoga biti nova metoda pomoću koje bi sama stanica domaćin mogla pokrenuti antivirusni mehanizam. To je bio dosad nepriznati jedinstveni mehanizam djelovanja, napisao je tim.

Zaključno su napisali, "... ti podaci ukazuju da su 6-TG i 6-TGo učinkoviti antivirusni lijekovi usmjereni na domaćina koji pokreću UPR i ometaju nakupljanje virusnih glikoproteina."

*Važna obavijest

medRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i, stoga, ne treba smatrati konačnim, usmjeriti kliničku praksu/ponašanje povezano sa zdravljem, ili se tretira kao utvrđena informacija.

• Istraživač genomike UChicaga dobitnik je nagrade NIH Directors New Innovator Award
• Studija pruža nove uvide u mikrobiome predindustrijskog poljoprivrednog stanovništva