Tiopuríny by mohli pomôcť zastaviť replikáciu vírusov v ľudských koronavírusoch

Vedci z Katedry mikrobiológie a imunológie, Dalhousie University, Univerzita v Calgary, a Katedra biochémie a molekulárnej biológie, Univerzita Britskej Kolumbie, Kanada, pracoval s ľudskými koronavírusmi v bunkových kultúrach na hľadaní liekov, ktoré by mohli zabrániť akumulácii a replikácii závažného akútneho respiračného syndrómu koronavírusu 2 (SARS-CoV-2).

Ich štúdia s názvom "Thiopuríny aktivujú antivírusovú rozvinutú proteínovú odpoveď, ktorá blokuje akumuláciu vírusového glykoproteínu v modeli infekcie bunkovej kultúry," ”Bol zverejnený online ako predtlač na webe bioRxiv* .

Čo je reakcia nezloženého proteínu (UPR)?

Vedci vysvetlili, že vírusy, ktoré sú obalené, ako je koronavírus, majú genetický materiál, ktorý môže kódovať membránové proteíny, ktoré je možné syntetizovať a modifikovať v endoplazmatickom retikule (ER), než sa môžu transportovať do oblastí montáže častí viriónu.

Ak je skladacia kapacita proteínu ER preťažená príliš veľkým počtom častíc viriónu, v ER dochádza k preťaženiu rozvinutých bielkovín. To spustí reakciu rozvinutého proteínu (UPR). Aktivuje sa tým transkripčný faktor-6 (ATF6), inozitol vyžadujúci enzým-1 (IRE1) a PKR-podobnú endoplazmatickú retikulum kinázu (PERK). Môžu cítiť, že ER je v strese, a dochádza teda k syntéze transkripčných faktorov základného leucínového zipsu (bZIP).

Keď sa UPR aktivuje, kapacita skladania bielkovín ER je zvýšená. To tiež spúšťa degradáciu spojenú s ER (ERAD). Všetky proteíny, ktoré nie sú správne poskladané, sú vytiahnuté z ER a degradované prostredníctvom 26S proteazómu.

Tiopurínové analógy 6-TG a 6-TGo selektívne indukujú stresové granule v bunkách infikovaných IAV. (A) Štrukturálne diagramy malých molekúl identifikovaných na obrazovke. (B) Kvantifikácia tvorby ložísk EGFP-G3BP v bunkách infikovaných IAV-Udorn (modrá) alebo falošne (červených) ošetrených zvyšujúcimi sa dávkami 6-TG a 6-TGo (hore) a reprezentatívne celomické obrázky kanála EGFP buniek ošetrených s 30 uM 6-TG a 6-TGo (dole). Pri 4 hpi, bunky boli ošetrené 0, 1, 10 a 30 uM dávky tiopurínových analógov 6-tioguanínu (6-TG) alebo 6-tioguanozínu (6-TGo). Pri 8 hpi, bunky boli fixované a zafarbené Hoeschst 33342. Automatické zachytenie obrazu bolo uskutočnené pomocou čítačky Cellomics Arrayscan VTI HCS. Pre každú jamku bolo zachytených 15 snímok a bola vypočítaná priemerná intenzita bodového EGFP-G3BP1. (C) Bunky A549 boli infikované IAV-CA/07 pri MOI 1. Pri 4 hpi, bunky boli ošetrené 6-TG alebo falošne ošetrené. Pri 8 hpi, bunky boli fixované a imunofarbené protilátkami nasmerovanými na stresové granulové markerové proteíny G3BP1 (červené), PABP (zelená) a polyklonálna IAV protilátka (modrá), ktorá deteguje antigény z NP, M1, a HA, nasleduje zafarbenie sekundárnymi protilátkami konjugovanými s Alexou. (D) Bunky A549 boli infikované IAV-CA/07 pri MOI 1. Pri 4 hpi, bunky boli ošetrené 6-TG (10 uM). Pri 8 hpi, bunky boli fixované a imunofarbené protilátkami nasmerovanými na stresové granulové markerové proteíny G3BP1 (červené), TIAR (zelená) a eIF3A (zelená), nasleduje zafarbenie sekundárnymi protilátkami konjugovanými s Alexou. Obrázky zachytené fluorescenčným mikroskopom Zeiss Axioimager Z2. Zobrazené reprezentatívne obrázky. Mierka predstavuje 20 µm.

Preťaženie ER počas replikácie vírusu

Keď vírusová častica napadne bunku, pokúša sa rýchlo replikovať, a to zaťažuje ER. Vírus uvoľňuje výbuchy glykoproteínov, ktoré zaplavujú ER. Vírus, však je schopný obísť UPR a podporuje efektívnu replikáciu.

Techniky prijaté vírusmi chrípky A (IAV)

IAV môže kódovať tri integrálne membránové proteíny:hemaglutinín (HA), neuraminidáza (NA), a matricový proteín 2 (M2). Zatiaľ čo replikácia IAV spôsobuje selektívnu aktiváciu UPR, špecifické mechanizmy môžu aktivovať UPR, ale potom ho obísť, aby sa podporila účinná replikácia vírusu. Tím vysvetľuje, že účinky NA a M2 proteínov na UPR nie sú jasné, ale HA môže podporovať UPR.

Koronavírusy a UPR

Niekoľko koronavírusov (CoV) môže aktivovať UPR. Patrí sem „vírus infekčnej bronchitídy (IBV), myší vírus hepatitídy (MHV), prenosný vírus gastroenteritídy (TGEV), ľudský koronavírus (HCoV) -OC43, a SARS-CoV-1. “ Celá genetická sekvencia, však nereaguje podobne na replikáciu CoV.

Tiopurín a replikácia vírusu

Tím identifikoval dva tiopurínové analógy schválené FDA s názvom „6-tioguanín (6-TG) a 6-tioguanozín (6-TGo)“. Zistilo sa, že blokujú replikáciu IAV a HCoV-OC43, keď sa ich dávka zvyšuje stupňovitým spôsobom.

Pateamine A a Silvestrol boli testované predtým. Tieto dva tiopuríny, však bolo zistené, že narúšajú proces akumulácie vírusových glykoproteínov, ktoré by mohli aktivovať UPR. V bunkách, ktoré boli ošetrené 6-TG, syntéza vírusového glykoproteínu by mohla byť čiastočne obnovená chemickou inhibíciou UPR.

Proteíny CoV Spike (S), ktoré sú exprimované na povrchu vírusu, vykazovali aktiváciu UPR. Proteín S z nového koronavírusu alebo SARS-CoV-2 S tiež spôsobil aktiváciu UPR. 6-TG inhiboval akumuláciu fúznych proteínov S2 v plnej dĺžke alebo furínom štiepených, poznamenali. Na ektodoménu S1 to nemalo vplyv. 6-TG by mohol indukovať UPR, ktorý urýchľuje ERAD sprostredkovaný obrat membránovo ukotvených glykoproteínov S0 a S2, tím našiel.

6-merkaptopurín (6-MP) nemá taký účinok

Vedci experimentovali a zistili, že chemicky podobná zlúčenina tiopurín 6-merkaptopurín (6-MP) má malý vplyv na UPR a neovplyvňuje replikáciu IAV HCoV-OC43.

Uvažujúc o mechanizme indukcie UPR tiopurínovými zlúčeninami 6-TG a 6-TGo, tím napísal, že tieto efekty pravdepodobne nie sú sprostredkované inkorporáciou 6-TG DNA alebo RNA z niekoľkých dôvodov. Prvým dôvodom je, že stres spojený s vírusovou replikáciou neindukuje špecificky UPR. Druhým dôvodom je, že medzi vírusovými proteínmi akumulácia glykoproteínov a ich spracovanie bolo selektívne narušené. Tretím dôvodom bolo, že hladiny messengerovej RNA HA a NA v IAV neboli významne ovplyvnené. 6 MP, na druhej strane, môžu byť prevedené na 6-tioguanozíntrifosfát, ale neindukovali UPR a nemali žiadne účinky na IAV glykoproteíny alebo replikáciu OC43.

Závery a implikácie

Tím napísal, že ich údaje odhaľujú, že „molekuly vyvolávajúce UPR by mohli byť účinnými antivirotikami zameranými na hostiteľa proti vírusom, ktoré na podporu efektívnej replikácie závisia od procesov ER.“ Indukcia UPR 6-TG a 6-TGo by teda mohla byť novou metódou, ktorou by antivírusový mechanizmus mohla spustiť samotná hostiteľská bunka. Toto bol predtým nepoznaný jedinečný mechanizmus účinku, napísal tím.

Napísali na záver, "... tieto údaje naznačujú, že 6-TG a 6-TGo sú účinné antivirotiká zamerané na hostiteľa, ktoré spúšťajú UPR a narúšajú akumuláciu vírusových glykoproteínov."

*Dôležitá poznámka

medRxiv vydáva predbežné vedecké správy, ktoré nie sú recenzované a preto, by nemali byť považované za presvedčivé, viesť klinickú prax/správanie súvisiace so zdravím, alebo sa s nimi zaobchádza ako so zavedenými informáciami.

• Výskumník genomiky UChicago získal cenu NIH Directors New Innovator Award
• Štúdia poskytuje nové pohľady na mikrobiómy predindustriálnej poľnohospodárskej populácie