Tiopurini bi lahko pomagali ustaviti replikacijo virusa pri človeških koronavirusih

Raziskovalci z Oddelka za mikrobiologijo in imunologijo, Univerza Dalhousie, Univerza v Calgaryju, in Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo, Univerza v Britanski Kolumbiji, Kanada, sodeloval s človeškimi koronavirusi v celičnih kulturah, da bi poiskal zdravila, ki bi lahko preprečila kopičenje in razmnoževanje hudega akutnega respiratornega sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2).

Njihova študija z naslovom "Tiopurini aktivirajo protivirusni razgrnjen proteinski odziv, ki blokira kopičenje glikoproteinov virusa v modelu okužbe s celično kulturo, ”Je bil objavljen na spletu kot predtisk na spletnem mestu bioRxiv* .

Kaj je odporen proteinski odziv (UPR)?

Raziskovalci so pojasnili, da so virusi, ki jih obdaja, kot je koronavirus, imajo genetski material, ki lahko kodira membranske beljakovine, ki jih je mogoče sintetizirati in spremeniti v endoplazemskem retikulumu (ER), preden se lahko transportirajo na območja sestavljanja delov viriona.

Če je sposobnost zlaganja beljakovin ER preobremenjena s preveč virionskimi delci, v ER je preobremenjena razgrnjena beljakovina. To sproži odzvan odziv beljakovin (UPR). S tem se aktivira transkripcijski faktor-6 (ATF6), inozitol, ki potrebuje encim-1 (IRE1) in PKR-podobno endoplazmatsko retikulum kinazo (PERK). Ti lahko čutijo, da je urgenca pod stresom, in tako pride do sinteze transkripcijskih faktorjev na bazi levcinske zadrge (bZIP).

Ko se UPR aktivira, sposobnost zlaganja beljakovin v ER se poveča. To sproži tudi degradacijo, povezano z ER (ERAD). Vsi proteini, ki niso pravilno zloženi, se izvlečejo iz ER in razgradijo s proteasomom 26S.

Analogi tiopurina 6-TG in 6-TGo selektivno inducirajo stresne granule v celicah, okuženih z IAV. (A) Strukturni diagrami majhnih molekul, identificiranih na zaslonu. (B) Kvantificiranje nastanka žarišč EGFP-G3BP v okuženih celicah, okuženih z IAV-Udorn (modro) ali lažno (rdeče), obdelanih z naraščajočimi odmerki 6-TG in 6-TGo (zgoraj), in reprezentativne cellomične slike kanala EGFP, zdravljenih celic s 30 µM 6-TG in 6-TGo (spodaj). Pri 4 hpi, celice so bile obdelane z 0, 1, 10 in 30 uM odmerkov tiopurinskih analogov 6-tiogvanina (6- TG) ali 6-tiogvanozina (6-TGo). Pri 8 hpi, celice smo fiksirali in obarvali s Hoeschstom 33342. Samodejno zajem slike smo izvedli z bralnikom VTI HCS Cellomics Arrayscan. Za vsako vdolbinico je bilo zajetih 15 slik in izračunana je bila povprečna točkasta točka EGFP-G3BP1. (C) Celice A549 so bile okužene z IAV-CA/07 pri MOI 1. Pri 4 hpi, celice so bile obdelane s 6-TG ali lažno obdelane. Pri 8 hpi, celice smo fiksirali in imunsko obarvali s protitelesi, usmerjenimi v beljakovinske markerje zrnc stresa G3BP1 (rdeče), PABP (zeleno) in poliklonsko protitelo IAV (modro), ki zaznava antigene iz NP, M1, in HA, sledi barvanje s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi z Alexa. (D) A549 celice so bile okužene z IAV-CA/07 pri MOI 1. Pri 4 hpi, celice smo obdelali s 6-TG (10 µM). Pri 8 hpi, celice smo fiksirali in imunsko obarvali s protitelesi, usmerjenimi v beljakovinske markerje zrnc stresa G3BP1 (rdeče), TIAR (zelena) in eIF3A (zelena), sledi barvanje s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi z Alexa. Slike, posnete s fluorescentnim mikroskopom Zeiss Axioimager Z2. Prikazane reprezentativne slike. Merilne palice predstavljajo 20 µm.

Premočna ER med replikacijo virusa

Ko virusni delček vdre v celico, poskuša se hitro kopirati, in to obremenjuje urgenco. Virus sprošča izbruhe glikoproteinov, ki preplavijo urgenco. Virus, vendar je sposoben zaobiti UPR in spodbuja učinkovito replikacijo.

Tehnike, ki jih sprejemajo virusi influence A (IAV)

IAV lahko kodira tri integralne membranske proteine:hemaglutinin (HA), neuraminidaza (NA), in beljakovine matriksa 2 (M2). Medtem ko replikacija IAV povzroči selektivno aktiviranje UPR, posebni mehanizmi lahko aktivirajo UPR, potem pa ga zaobidejo, da bi spodbudili učinkovito razmnoževanje virusa. Ekipa pojasnjuje, da učinki proteinov NA in M2 na UPR niso jasni, lahko pa HA spodbuja UPR.

Koronavirusi in UPR

Več koronavirusov (CoV) lahko aktivira UPR. To vključuje „virus nalezljivega bronhitisa (IBV), mišji virus hepatitisa (MHV), virus prenosljivega gastroenteritisa (TGEV), človeški koronavirus (HCoV) -OC43, in SARS-CoV-1. " Celotno genetsko zaporedje, vendar ne reagira podobno na replikacijo CoV.

Razmnoževanje tiopurina in virusa

Ekipa je identificirala dva analoga tiopurina, ki ju je odobrila FDA, imenovana "6- tioguanin (6-TG) in 6-tioguanozin (6-TGo)". Ugotovljeno je bilo, da blokirajo razmnoževanje IAV in HCoV-OC43, ko se je njihov odmerek stopnjevano povečal.

Pateamin A in Silvestrol sta bila že testirana. Ta dva tiopurina, vendar Ugotovljeno je bilo, da motijo ​​proces kopičenja virusnih glikoproteinov, ki bi lahko aktivirali UPR. V celicah, ki so bile zdravljene s 6-TG, sintezo virusnega glikoproteina bi lahko delno obnovili s kemično inhibicijo UPR.

Proteini CoV Spike (S), ki so izraženi na površini virusa, so pokazali aktivacijo UPR. Protein S iz novega koronavirusa ali SARS-CoV-2 S je prav tako povzročil aktivacijo UPR. 6-TG je zaviral kopičenje fuzijskih beljakovin S2 ali S2 v celotni dolžini, so ugotovili. To ni vplivalo na S1 ektodomano. 6-TG bi lahko sprožil UPR, ki bi pospešil ERAD-posredovani promet membransko zasidranih glikoproteinov S0 in S2, ekipa je našla.

6-merkaptopurin (6-MP) nima takšnega učinka

Raziskovalci so eksperimentirali in ugotovili, da ima kemično podobna spojina tiopurin 6-merkaptopurin (6-MP) majhen učinek na UPR in ni vplivala na razmnoževanje IAV HCoV-OC43.

Razmišljanje o mehanizmu indukcije UPR s tiopurinskimi spojinami 6-TG in 6-TGo, ekipa je zapisala, da ti učinki verjetno ne bodo posredovani z vključitvijo 6-TG v DNA ali RNA zaradi več razlogov. Prvi razlog je, da stres, povezan z replikacijo virusa, ne povzroči posebej UPR. Drugi razlog je, da med virusnimi beljakovinami kopičenje glikoproteinov in njihova predelava je bila selektivno motena. Tretji razlog je bil, da na ravni prenosnih RNA HA in NA v IAV niso bistveno vplivali. 6 MP, po drugi strani, se lahko pretvori v 6-tiogvanozin trifosfat, vendar ni povzročil UPR in ni vplival na glikoproteine ​​IAV ali replikacijo OC43.

Sklepi in posledice

Ekipa je zapisala, da njihovi podatki razkrivajo, da so "molekule, ki inducirajo UPR, lahko učinkovita protivirusna zdravila, usmerjena na gostitelja, proti virusom, ki so odvisni od procesov ER, da podpirajo učinkovito replikacijo." Indukcija UPR s 6-TG in 6-TGo je tako lahko nova metoda, s katero bi lahko gostiteljska celica sprožila protivirusni mehanizem. To je bil prej nepriznan edinstven mehanizem delovanja, je zapisala ekipa.

Na koncu so zapisali:"... ti podatki kažejo, da sta 6-TG in 6-TGo učinkovita protivirusna zdravila, usmerjena na gostitelja, ki sprožijo UPR in motijo ​​kopičenje virusnih glikoproteinov."

*Pomembno obvestilo

medRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso recenzirana in, zato, ne velja za dokončno, vodi klinično prakso/vedenje, povezano z zdravjem, ali se obravnavajo kot uveljavljeni podatki.

• Raziskovalec genomike UChicago je prejel nagrado NIH Directors New Innovator Award
• Študija ponuja nov vpogled v mikrobiome predindustrijske kmetijske populacije