PLOS ONE: Förbättrad M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori-associerad atrofisk gastrit och i Vaccinerade Mice

Abstrakt

Bakgrund

Infektion med Helicobacter pylori
utlöser en kronisk mag- inflammation som kan utvecklas till atrofi och magcancer. Polarisering av makrofager är en egenskap hos både cancer och infektioner, och kan främja progression eller resolution av sjukdomen. Men rollen av makrofager och deras polarisation under H. pylori
infektion har inte väldefinierade.

Metodik /viktigaste resultaten

Genom att använda en musmodell för infektion och gastriska biopsier från 29 personer, har vi analyserat makrofag rekrytering och polarisering under H. pylori
infektion genom flödescytometri och realtids-PCR. Vi hittade en sekventiell rekrytering av neutrofiler, eosinofiler och makrofager till magslemhinnan av infekterade möss. Genexpressionsanalys magen vävnad och sorterade makrofager visade att gastric makrofager polariserad M1 efter H. pylori
infektion, och denna process väsentligt påskyndas genom tidigare vaccination. Human H. pylori
infektion kännetecknades av en blandad M1 /​​M2 polarisering av makrofager. Men i H. pylori
-associated atrofisk gastrit, ett uttryck för inducerbart kväveoxidsyntas var markant ökade jämfört med okomplicerad gastrit, ett tecken på en förbättrad M1 makrofag polarisering i denna pre-maligna lesioner.

Slutsatser /Betydelse

Dessa resultat visar att vaccination av möss mot H. pylori
förstärker M1 polarisering av gastriska makrofager, och att en liknande förbättrad M1 polarisation är närvarande i humant H. pylori
inducerad atrofisk gastrit

Citation. Quiding-Järbrink M, Raghavan S, Sundquist M (2010) Förstärkt M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori
-Associated atrofisk gastrit och i vaccinerade möss. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10.1371 /journal.pone.0015018

Redaktör: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

emottagen: 26 augusti 2010; Accepteras: 7 oktober 2010; Publicerad: 23 november 2010

Copyright: © 2010 Quiding-Järbrink et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie stöddes av kompetenscentrum MIVAC, finansierat av Svenska Stiftelsen för strategisk forskning, Adlerbertska Research Foundation, Wilhelm & Martina Lundgrens stiftelse, Inga-Britt & Arne Lundbergs stiftelse och Sahlgrenska Universitetssjukhuset. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori
kolonisera magen epitel mer än hälften av världens befolkning [1]. Infektionen är ofta livslång och utlöser en kronisk inflammation i magslemhinnan, som i ca 1-2% av infekterade individer så småningom utvecklas till magcancer [1]. Utveckling av magcancer, särskilt tarm typ, är en flerstegsprocess som utvecklats under årtionden genom premaligna lesioner i magslemhinnan, såsom atrofisk gastrit, intestinal metaplasi och dysplasi [2]. Utfallet av infektionen beror på virulensen hos den infekterande H. pylori
stam, miljöfaktorer som rökning och kost, och värd genetiska faktorer som påverkar typen och intensiteten av det inflammatoriska svaret [1].

En stark pro-inflammatoriskt svar är associerat med ökade nivåer av reaktiva syre- och kväve arter i magslemhinnan [3], som kan främja utvecklingen av cancer [4]. Till exempel möss infekterade med H. pylori Idéer för sex månader har en ökad frekvens av gastric mutationer jämfört med oinfekterade möss [5]. Dessutom möss som är bristfälliga för enzymet inducerbar kväveoxidsyntas (iNOS) har en minskad förekomst av magcancer efter H. pylori
infektion och cancerframkallande utmaning jämfört med normala möss [6]. Medan iNOS bidrar till utvecklingen av magcancer, är en hög nivå av kemokinen CCL18 i gastriska tumörer förknippade med förlängd överlevnad av patienter magcancer [7]. Intressant är iNOS produceras av klassiskt aktiverade /M1 makrofager medan CCL18 produktion är ett kännetecken för att alternativt aktiverade /M2 makrofager [8]. Sammantaget tyder dessa fynd att makrofager polarisering kan ha en viktig roll i utvecklingen av H. pylori
-associated magcancer.

M1 makrofager tar normalt en del i den initiala immunsvaret mot invaderande mikroorganismer och främja T-hjälpar (Th) en immunitet, medan M2 makrofager induceras under upplösning fasen av inflammation och är involverade i skräp sophantering, vävnadsombildning, och främjande av Th2 immunitet [8], [9]. Polarisering av makrofager styrs av mikromiljö. M1 makrofager induceras av interferon-y och mikrobiella produkter, såsom lipopolysackarid [9]. Å andra sidan, är M2 makrofager inducerad av Th2- eller antiinflammatoriska cytokiner och tillväxtfaktorer, inklusive IL-4, IL-10 och transformerande tillväxtfaktor-β [8], [9].

Under H. pylori
infektion, är makrofager rekryteras till magslemhinnan, där de bidrar till produktionen av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Dessutom visade en färsk studie som liposommedierad utarmning av makrofager minskade gastric patologi i H. pylori
infekterade möss [16]. Trots detta funktionen av makrofager under in vivo H. pylori
infektion förblir relativt dåligt definierad. Funktionen av makrofager är intimt kopplad till deras polarisationstillstånd, som också tycks ha en roll vid utveckling av magcancer [6], [7]. Därför har vi granskat makrofag polarisering i magslemhinnan av H. pylori
-infekterade möss och människor. Vi visar att vaccination av möss mot H. pylori
hastigheter och förstärker M1 polarisering av gastric makrofager. Dessutom är det förstadium till hudcancer atrofisk gastrit kännetecknas av en förbättrad makrofager M1 polarisering hos människor.

Resultat

Ökad frekvens av makrofager, eosinofiler och neutrofiler i magslemhinnan efter H. pylori
infektion

Rekryteringen av medfödda celler till infektionsstället är en förutsättning för smittskydd. Inte bara kan medfödda celler, såsom makrofager och neutrofiler, deltar i bakteriell dödande; de producerar också inflammatoriska mediatorer, som lagt grunden till den efterföljande immunsvaret. För att undersöka ansamling av medfödda celler i magslemhinnan under H. pylori
infektion, infekterade vi C57BL /6 möss med mus-anpassad H. pylori
Sydney stam 1 (SS1), och efter fyra, åtta och 26 veckor vi analyserade gastric inflammatorisk infiltrat av individuella möss genom flera färger flödescytometri. Det totala antalet lamina propria-celler som isolerats från magen förändrades inte under de första fyra veckorna av infektion, men vid åtta veckor efter infektion det totala antalet celler som isolerats fördubblades, och vid 26 veckors infektion fanns en åtta-faldig ökning i det totala antalet celler isolerade jämfört med oinfekterade möss (Fig. 1A). Bland de celler rekryteras till magen var makrofager, eosinofiler och neutrofiler. Gastriska makrofager identifierades som celler som uttrycker CD11b och större histokompatibilitetskomplex klass II (MHC-II), men som saknar uttryck av Gr1 (neutrofil markör), CD103 (uttrycks av en underuppsättning av dendritiska celler (DC)) och sialinsyra bindande immunoglobulin- liknande lektin (Siglec-F, eosinofil markör) (Fig. 1B). Dessa celler uttryckte makrofag markör F4 /80 (Fig. 1E), och baserat på cellmorfologi bekräftades som makrofager (Fig. 1B). Frekvensen av makrofager i magslemhinnan oförändrad efter fyra och åtta veckor av H. pylori
infektion (Fig. 1F). Men efter 26 veckor frekvensen av gastric makrofager ökades jämfört med oinfekterade möss (Fig. 1F).

Eosinofiler definierades som CD11b ^{+ Siglec-F + celler (Fig. 1C, [17]). These celler uttryckte mellanliggande nivåer av F4 /80 och hade en hög sidospridning profil vid analys genom flödescytometri (Fig. 1E). Kresylviolett färgning av sorterade CD11b + Siglec-F + celler bekräftade eosinofil morfologi (Fig. 1C). Frekvensen av eosinofiler i magslemhinnan fördubblades efter åtta veckor och ökade ytterligare efter 26 veckors infektion (Fig. 1F).}

Neutrofiler definierades som CD11b ^{+ Gr1 + celler (Fig . 1D). Eftersom Gr1 antikroppen känner igen både Ly6C och Ly6G epitopen vi bekräftade att alla CD11b + Gr1 + celler uttryckte den specifika neutrofil markör Ly6G (Fig. 1D och E). Frekvensen av neutrofiler ökade med 10 gånger åtta veckor efter infektion och ökade ytterligare efter 26 veckor (Fig. 1F). Således, under H. pylori
infektion finns en sekventiell ansamling av neutrofiler och eosinofiler, följt av makrofager i mag lamina propria.}

karakterisering av gastric DC

För att karakterisera gastric DC, först identifierade vi en population av CD11c ^{+ MHC-II + celler (Fig. 2A). När dessa celler analyserades vidare med avseende på expression av F4 /80 och αE grinkedjan CD103, hälften av CD11c + MHC-II + celler identifierades som F4 /80 + makrofager (Fig. 2A ). Emellertid, bland de CD11c + MHC-II + celler som saknade uttryck av F4 /80, två populationer av förmodade DC: er med differential expression av CD103 kunde särskiljas (Fig. 2A). På grund av de många fluorokromer som krävs vi valde att endast karakterisera gastric CD103 +
DCs ytterligare, eftersom dessa celler har varit inbegripna som viktiga antigenpresenterande celler i slemhinnevävnader [18]. Gastric CD103 + DCs var lätt identifieras genom färgning för CD11c och CD103 (Fig. 2B). Den gastriska CD103 + DCs uttryckte höga nivåer av MHC-II, och bestod av en CD11b låg och CD11b hög delmängd (Fig. 2C). I jämförelse, mag- CD103 - DCs var alla CD11b hög (Fig 2D.). Dessutom har CD103 + DCs saknade uttryck av CD8a och F4 /80 (Fig. 2C). Men frekvensen av CD103 + DCs förändrades inte nämnvärt i magslemhinnan efter infektion (Fig. 2E).}

Gastric makrofager och CD103 + DCs inte uppreglera samstimulerande molekyler efter H. pylori
infektion

För att undersöka de möjliga effekterna av H. pylori
infektion på uttrycket av samstimulerande molekyler och MHC-II genom gastriska makrofager och CD103 ^{+ DC: er, var uttrycket av dessa markörer analyserades med flödescytometri efter fyra, åtta och 26 veckor av infektion. I steady state, makrofager och CD103 + DCs i mag lamina propria uttryckte liknande nivåer av samstimulerande molekylen CD86 samt MHC-II (Fig. 3A). Överraskande, var uttrycket av CD86 och MHC-II genom antingen gastric makrofager eller CD103 + DCs inte ökat efter infektion med H. pylori
förhållande med åldersmatchade naiva möss som analyserats parallellt (fig. 3B). Således, makrofager och CD103 + DCs i mag lamina propria inte uppreglera CD86 och MHC-II efter H. pylori
infektion, trots den pågående inflammatoriska svaret.}

M1 polarisering av gastric makrofager under H. pylori
infektion

Eftersom våra resultat tyder på att mag makrofagerna kanske inte helt aktiveras under H. pylori
infektion, vi kännetecknas dessa celler vidare genom att undersöka deras polarisation M1 /​​M2. För att bestämma makrofag polarisering under H. pylori
infektion, använde vi realtids-PCR för att mäta uttrycket av gener associerade med M1 eller M2 polarisering av makrofager i magsäcksvävnaden [8], [9]. Vi mätte också expression av IL-10, som kan framställas av reglerande makrofager [9]. Ingen av markörerna analyserade var differentiellt uttryckt fyra veckor efter H. pylori
infektion i förhållande till naiva möss (Fig. 4A). Vid åtta veckor efter infektion uttrycket av M1 markörerna iNOS och CXCL11 ökade signifikant, och dessa markörer rades ytterligare uppregleras vid 26 veckors infektion (Fig. 4A). Dessutom var expression av IL-10 uppregleras vid åtta och 26 veckor av infektion i förhållande till naiva möss (Fig. 4A). I kontrast, M2 markörer funna i inflammatorisk zon 1 (FIZZ1) och arginas-1 inte var differentiellt uttryckta i magen vid fyra, åtta eller 26 veckors infektion jämfört med naiva möss (Fig. 4A).

att identifiera källan till iNOS och CXCL11 i magslemhinnan, makrofager (CD11b ^{+ Gr1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinofiler (CD11b + Gr1 -Siglec-F + MHC-II -) och de återstående cellerna efter grind ut makrofager och eosinofiler (CD11b - och CD11b + Gr1 +) sorterades från poolade gastric lamina propria-celler från möss som infekterats med H. pylori
under 26 veckor (Fig. 4B). MRNA uttryck av iNOS och CXCL11 i sorterade cellpopulationer från infekterade möss samt totalt gastric lamina propria-celler från både naiv och infekterade möss bestämdes sedan genom realtids-PCR. Ett tillräckligt antal sorterade makrofager kunde inte erhållas från naiva möss för tillförlitlig analys av mRNA-uttryck. Gastric makrofager uttryckte den högsta nivån av iNOS och CXCL11 jämfört med de andra sorterade cellpopulationer och totala gastric lamina propria-celler före sortering (Fig. 4C). Sammantaget visar dessa resultat att gastric makrofager polarise M1 under H. pylori
infektion.}

Vaccination mot H. pylori
förstärker makrofag M1 polarisering

Skydds immunisering mot H. pylori
är i allmänhet förknippas med den snabba utvecklingen av en gastric Th1 svar [19]. Eftersom Th1 cytokin interferon-γ inducerar makrofager M1 polarisation [9], undersökte vi om vaccination kan påverka makrofag polarisering under H. pylori
infektion. För detta ändamål, immuniserades möss sublingualt med H. pylori
lysat och koleratoxin adjuvans och därefter utmanade med H. pylori
SS1. Detta immuniseringsregim ledde till en betydande minskning av bakteriehalten i magen fyra veckor efter utmaning (fig. 5A). Samtidigt var uttrycket av M1 och M2 markörer i magsäcken analyseras genom realtids-PCR. I icke-immuniserade möss, bara ett uttryck för CXCL11 signifikant uppregleras fyra veckor efter infektion jämfört med naiva möss (Fig. 5B). I kontrast, immuniserade möss uppvisade en stor uppreglering av både M1 markörer iNOS och CXCL11 medan uttrycket av M2 markörer FIZZ1 och arginas-1 ändrades inte, fyra veckor efter utmaning (fig. 5B). Den ökade uttrycket av iNOS och CXCL11 i immuniserade /utmanade möss var inte på grund av immunisering ensam, eftersom immuniserade men icke-utmanade möss inte ändra uttrycket av någon av de analyserade M1 eller M2 markörer jämfört med helt obehandlade möss (data visas inte ).

Dessutom analyserade vi frekvensen av makrofager i magslemhinnan hos immuniserade och utmanade möss genom flödescytometri. I förhållande till infekterade endast för möss, immuniserade möss hade en signifikant ökad frekvens av gastric makrofager tre veckor efter utmaning (Fig. 5C). Trots att makrofager rekryterades till magslemhinnan av immuniserade och utmanade möss, makrofagerna inte uppreglera uttrycket av CD86 eller MHC-II i förhållande till infekterade enbart möss (Fig. 5D). Dessa resultat visar att efter framgångsrik vaccination med H. pylori
lysat och koleratoxin, makrofager ackumuleras i magslemhinnan och snabbt polariserad M1 efter infektion.

Ökning av makrofager M1 polarisering i mänsklig atrofisk gastrit

Vi undersökte nästa roll av H. pylori
infektion och atrofisk gastrit för makrofager polarisering i den mänskliga magslemhinnan. För detta ändamål har uttrycket av humana M1 (iNOS, CXCL11) och M2 markörer (CCL17, CCL18, CD206) mätt i biopsier från antrum genom realtids-PCR. H. pylori
infekterade individer med okomplicerad gastrit visade en signifikant ökad uttryck av mRNA för både M1 (iNOS, 8-faldigt, CXCL11, 20-faldig) och M2 markörer (CCL17, 30-faldig, CCL18, 70-faldig, CD206 , 2-faldig) jämfört med icke-infekterade frivilliga (Fig. 6A). Men personer med atrofisk gastrit (4/6 hade intestinal metaplasi utöver atrofi) uttryckte ännu högre nivåer av iNOS-mRNA jämfört med dem med okomplicerad gastrit (20 gånger), medan CXCL11 och markörer för M2 polarisering på liknande uttrycktes (Fig. 6A). I själva verket ett uttryck för iNOS var 180-faldigt ökad hos personer med atrofisk gastrit, jämfört med oinfekterade kontroller (Fig. 6A), vilket tyder på en förbättrad M1 polarisering av gastric makrofager hos patienter med atrofisk gastrit.

För att undersöka huruvida ökat mRNA-uttryck av M1 och M2 markörer översätter också till ökade proteinnivåer, var totala proteinerna extraherades från antral biopsiprover och koncentrationen av iNOS och CCL18 bestämdes genom ELISA. Gastric biopsier från individer med atrofisk gastrit var endast tillgänglig för proteinextraktion från en volontär som differentiellt visas i figur 6B. Hälften av H. pylori
infekterade individer hade detekterbara nivåer av iNOS protein i antrum medan koncentrationen av iNOS var under detektionsgränsen i alla infekterade individer (Fig. 6B). Uttrycket av iNOS mRNA och iNOS protein var signifikant korrelerad (R ^{2 = 0,88, P
< 0,01) vilket indikerar att mRNA-analys reflekterar proteinuttryck, även när proteinnivåerna är låga. Koncentrationen av M2 markör CCL18 ökades i magsäckens vävnad från H. pylori
infekterade individer jämfört med oinfekterade kontroller (Fig. 6B). Dessutom koncentrationen av CCL18 protein var signifikant korrelerad med uttrycket av CCL18 mRNA (R 2 = 0,754, P Hotel < 0,01).}

Sammantaget dessa fynd indikerar närvaron av både M1 och M2 makrofager i magslemhinnan av H. pylori
infekterade individer. Vidare är atrofisk gastrit associerad med en stark förstärkning av iNOS-uttryck i magslemhinnan, vilket visar en förbättrad M1 polarisering av makrofager.

Diskussion

I denna studie har vi undersökt polarisationen av gastrisk makrofager under kronisk H. pylori
infektion. Vi visar att H. pylori
infekterade individer uttrycker mRNA i magslemhinnan som indikerar en blandad M1 /​​M2 polarisering av makrofager, och detta bekräftades ytterligare på proteinnivå. Men i H. pylori
inducerad atrofisk gastrit fanns en markant ökning av uttrycket av iNOS i jämförelse med okomplicerad gastrit. Atrofisk gastrit ger en ökad risk att utveckla magcancer relativt okomplicerad H. pylori
-associated gastrit [20]. Den ökade expressionen av iNOS i atrofisk gastrit kan bidra till gastrisk cancerutveckling via produktion av reaktiva kvävearter, som kan främja karcinogenes genom induktion av DNA-skada, störning av DNA-reparation, post-translationell modifiering av proteiner och p53-mutationer [4]. I själva verket, iNOS-brist möss har en minskad förekomst av magcancer efter H. pylori
infektion och utmaning med en kemisk karcinogen jämfört med normala möss [6]. Även polymorfismer i promotorregionen av iNOS, vilket leder till en högre transkriptionsaktivitet, korrelerar med en högre förekomst av tarm typ av magcancer i japanska kvinnor [21].

I motsats till mänsklig H . pylori
infektion, SS1-infekterade C57BL /6-möss visade en genexpression profil i magslemhinnan indikativ för makrofag M1 polarisation. Genuttrycksanalys av sorterade makrofager som isolerats från den gastriska slemhinnan hos infekterade möss bekräftade att uttryck av M1 markörer iNOS och CXCL11 anrikades i den sorterade makrofag befolkningen. Dessutom M1 polarisering av gastric makrofager väsentligt påskyndas genom tidigare vaccination. Redan fyra veckor efter utmaning, immuniserade möss uppreglerade uttrycket av iNOS och CXCL11 till ungefär samma nivå som den som ses efter 26 veckor i infekterade endast för möss. Studier av iNOS-brist möss har visat att iNOS främjar utveckling av atrofi och cancer i magslemhinnan under Helicobacter
infektion [6], [22]. Dessutom clearance H. pylori
efter vaccination sker oberoende av iNOS [23]. Således verkar iNOS att bidra till värd patologi snarare än skydd under infektion med H. pylori
. Därför, om den förbättrade produktionen av iNOS i magslemhinnan bibehålls efter vaccination, kan det vara en oönskad biverkning som kan öka svårighetsgraden av H. pylori
inducerad inflammation och malignitet, såvida inte steril immunitet uppnås. Men för att det relativa bidraget av iNOS värd patologi kontra skydd under olika skeden av H. pylori
infektion optioner ytterligare utredning.

Vi observerade en sekventiell rekrytering av medfödda celler till magslemhinnan av SS1-infekterade möss, med makrofager ackumulera ganska sent under infektionsförloppet (26 veckor). Däremot frekvenserna hos gastriska neutrofiler och eosinofiler i magslemhinnan ökade åtta veckor efter infektion och förblev förhöjd vid 26 veckor. Ansamlingen av makrofager inträffade mycket snabbare hos vaccinerade möss, i vilket fall frekvensen av gastric makrofager ökades redan tre veckor efter utmaning. Tidigare har neutrofiler visats rekryteras till magslemhinnan av SS1-infekterade möss i två faser, en tidig fas topp 1-2 dagar efter infektion och en sen fas som börjar vid 2-3 veckor efter infektion [24]. En rekryteringsmönster, liknande det av neutrofiler, har också beskrivits för gastric makrofager [24]. Emellertid var makrofagerna definieras som CD11b ^{+ Gr1 - celler [24], en cellpopulation som i våra händer huvudsakligen består av eosinofiler (se figur 1 och 2.). Asim et al. definierade makrofager som CD11b + F4 /80 + celler och observerade en tidig topp i makrofager nummer i magslemhinnan 1-2 dagar efter infektion med H. pylori
[15]. Dessutom räknades antalet makrofager ökade igen vid 60 och 120 dagar efter infektion i förhållande till naiva möss [15]. Vi utökar dessa resultat genom att visa att rekryteringen av dessa medfödda cellpopulationer bibehålls fram till 26 veckor efter infektion. Dessutom beskriver vi ansamling av eosinofiler i magslemhinnan, en cellpopulation att genom att långt fler än de gastriska makrofager och neutrofiler (fig. 1). I själva verket roll eosinofiler i H. pylori
inducerad gastrit bör utredas ytterligare. Eosinofiler och makrofager andel uttrycket av flera markörer, inklusive CD11b och F4 /80 (Fig. 1, [25]). Därför multipla markörer måste analyseras samtidigt för att skilja dessa medfödda cellpopulationer.}

Vi kunde identifiera två populationer av DC i magslemhinnan hos möss. Båda delmängder uttryckte höga nivåer av CD11c och MHC-II, saknade uttryck av makrofag markör F4 /80, men skilde sig med avseende på uttryck av CD103. Frekvensen av gastric CD103 ^{+ DCs inte förändras efter fyra, åtta eller 26 veckors H. pylori
infektion. I motsats till vår studie, en färsk undersökning från Kao et al. kunde inte detektera CD103 + DC i magslemhinnan av oinfekterade möss [26]. Snarare CD103 + DCs framkom 24 timmar efter H. pylori
infektion. Eftersom tiden för analys skiljer sig mellan den studien och våra experiment, är det svårt att direkt jämföra resultaten.}

Trots att M1 makrofager uppreglerar vanligtvis MHC-II och samstimulerande molekyler, vi kunde inte identifiera ett ökat uttryck av MHC -II eller CD86 på gastric makrofager eller CD103 ^{+ DCs från antingen icke immuniserade eller immuniserade möss efter infektion. I kontrast, in vitro inkubation av H. pylori hotell med humana monocyter [27], mänskliga monocythärledda DCs [28], [29], [30], [31], mus härledd från benmärg DC [32], [33], eller humana primära mag DCs [34], inducerar uppreglering av samstimulerande molekyler och MHC-II. Därför underlåtenheten att uppreglera MHC-II och CD86 på mag makrofager och CD103 + DCs i kronisk H. pylori
infektion kan orsakas av den inflammatoriska miljön och inte av bakterierna i sig. Faktum är att samspelet mellan DC och H. pylori
in vitro inte nödvändigtvis återspeglar vad som händer in vivo, där den lokala mikro vid platsen för antigen förvärv och antigenpresentation samt DC delmängd involverade i antigenpresentation av H. pylori
, kommer att påverka svaret. Till exempel, regulatoriska T-celler, som är vanliga i H. pylori
infekterade magslemhinnan [35], [36], kan förhindra uppregleringen av samstimulerande molekyler och MHC-II på DCs [37]. Dessutom kan IL-10 hindra att uppreglering av samstimulerande molekyler och MHC-II på makrofager och DCs [38].}

Under akuta inflammatoriska svar, makrofager är typiskt polariserat till M1 och utövar potenta antimikrobiella effekter. Till exempel, infektion med Salmonella typhimurium
eller Listeria monocytogenes
inducerar M1 polarisering av makrofager, som erfordras för styrning av infektion [39]. Upplösning av inflammation kännetecknas av en förändring i makrofager polarisering till M2, som främjar vävnadsläkning. Tuberkulos patienter uppvisar en ökad produktion av Th2-cytokiner som infektionen fortsätter [40], [41], vilket kan inducera M2 polarisering av makrofager. Hos möss, M1 polarisering av makrofager utgör den tidiga svar på Mycobacterium tuberculosis
, medan alveolära makrofager polarise till M2 under sent skede infektion [42]. Men skiftet i makrofager polarisering inducerad av kroniska infektioner resulterar ofta i en reducerad kapacitet av makrofagerna att döda invaderande bakterier [39], [43]. Å andra sidan, är kronisk inflammation med ihållande M1 makrofag polarisering associerat med en ökad risk för cancerutveckling [4].

Gör makrofager bidra till värdförsvar mot H. pylori
? Till skillnad från neutrofiler, är makrofager inte ofta ses i magsäckens lumen efter translokation över epitel [44]. Eftersom H. pylori
företrädesvis uppehålla sig i magslemhinnan skiktet eller är fästa vid gastric epitelceller, kan makrofager inte komma i direkt kontakt med hela bakterier. I själva verket, utarmning av makrofager av läkemedelsladdade liposomer hade någon effekt på H. pylori
kolonisering [16], vilket tyder på att makrofager inte direkt kan bidra till värdförsvar mot H. pylori
. Däremot kan makrofager främja gastric patologi. Till exempel, liposommedierad utarmning av makrofager förbättras gastrit inducerad av H. pylori
infektion [16]. Dessutom selektiv deletion av I-kB-kinas β i myeloida celler, vilket förhindrar aktivering av NF-kB i dessa celler, inhiberade utvecklingen av gastrisk atrofi efter H. felis
infektion [45]. Således behöver makrofager verkar inte bidra till Helicobacter
clearance, men kan i stället främja gastric patologi.

Sammanfattningsvis visar denna studie att vaccination av möss mot H. pylori
förstärker M1 polarisering av gastric makrofager. Ett liknande fenomen ses i mänsklig atrofisk gastrit där den blandade M1 /​​M2 polarisering närvarande i okomplicerad gastrit är ersatt med en M1-dominerade polarisering. Detta kan framkalla en tumörfrämjande inflammation, och skifta makrofag polarisering från M1 till M2 kan därför representera ett terapeutiskt mål vid kronisk H. pylori
infektion.

Material och metoder

Etik uttalande

Studien godkändes av regeringen djuretik kommitté (Göteborgs djuretisk kommitté, 328/2008 och 254 /2009). Den regionala mänskliga etiska kommittén i Västra Götalands län i Sverige (706/03 och 85/06) godkände studien, och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare. Detta är den enda myndighet som etiska tillstånd för forskning på människor i Sverige, och det är inte direkt knutna till sjukhus eller universitet.

Möss

C57BL /6-möss köptes från Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland), eller när det gäller vaccinationsexperiment från Taconic (Ejby, Danmark). Möss infekterades vid en ålder av 8-12 veckor.

Bakterier och infektion av möss

H. pylori
SS1 odlades på Columbia ISO agarplattor under 2 dagar vid 37 ° C, varefter de överfördes till Brucella-buljong kompletterad med 5% fetalt kalvserum (FCS) och antibiotika (Vancomycin, 10 | ig /ml; Polymyxin B , 20 U /ml; trimetoprim 5 | ig /ml) och inkuberades skakning över natten vid 37 ° C under mikroaerofila betingelser. Före infektion, var motiliteten av bakterierna bekräftades genom mikroskopi. Koncentrationen av bakterier uppskattades spektrofotometriskt. Mössen fick 3 x 10 ^{8 kolonibildande enheter av SS1 intragastriskt.}

Sublingual immunisering

Möss gavs fyra 10 pl doser av 500 mikrogram H. pylori
lysat (framställt från stam Hel305 såsom tidigare beskrivits [46]) i kombination med 10 | j, g koleratoxin (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ) sublingualt vid en veckas intervall [47], [48]. Två veckor efter den sista immuniseringen, utmanades mössen intragastriskt med 3 x 10 ^{8 kolonibildande enheter av H. pylori
SS1.}

Bedömning av bakteriell kolonisering

För kvantitativ bedömning av bakteriell kolonisering i immuniseringsexperiment, en halv av magsäcken försiktigt tvättades med PBS och homogeniserades med användning av en Ultra Turrax homogenisator ( IKA Laboratory Technology, Staufen, Tyskland). Serieutspädningar av homogenatet ströks ut på Skirrow agarplattor. När gastrisk lamina propria-celler isolerades från hela magen en kvantitativ uppskattning av den gastriska bakteriebelastningen inte skulle kunna utföras. I detta fall var magen, som skars längs den större kurvaturen och tvättades i PBS genom att försiktigt ströks ut på Skirrow agarplattor. Förekomsten av H. pylori
kolonier bekräftades av en ureastest. På detta sätt kunde vi bekräfta H. pylori
kolonisering och ändå använda hela magen för cellisolering.

Isolering av gastrisk lamina propria-celler

glandulär mage skars i 5 mm bitar och inkuberas totalt tre gånger med H.

• PLOS ONE: Noggrannhet och brytvärden av pepsinogener I, II och Gastrin 17 för diagnos av Gastric Fundic Atrofi: Inverkan av gastrit
• PLOS ONE: Bakteriell Microbiota profilering i gastrit utan Helicobacter pylori-infektion eller icke-steroida antiinflammatoriska droganvändning