PLoS ONE: Forbedret M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori-Associated atrofisk gastritt og hos vaksinerte Mice

Abstract

Bakgrunn

Infeksjon med Helicobacter pylori
utløser en kronisk mage betennelse som kan utvikle seg til atrofi og adenokarsinom i ventrikkel. Polarisering av makrofager er et karakteristisk for både kreft og infeksjoner, og kan fremme progresjon eller oppløsning av sykdom. Imidlertid er rollen til makrofager og deres polarisasjon i løpet av H. pylori
infeksjon er ikke godt definert.

metodikk /hovedfunnene

Ved å bruke en musemodell for infeksjon og mage biopsier fra 29 personer, har vi analysert makrofag rekruttering og polarisering under H. pylori
infeksjon av flowcytometri og real-time PCR. Vi fant en sekvensiell rekruttering av nøytrofile, eosinofile og makrofager til mageslimhinnen av infiserte mus. Genekspresjonsanalyse av magen vev og sortert makrofager avslørte at mage makrofager ble polarisert til M1 etter H. pylori
infeksjon, og denne prosessen ble vesentlig fremskyndet av tidligere vaksinasjon. Menneskelig H. pylori
infeksjon ble preget av en blandet M1 /​​M2 polarisering av makrofager. Men i H. pylori
-associated atrofisk gastritt, uttrykk for induserbar nitrogenoksid syntase ble markert økt sammenlignet med ukomplisert gastritt, en indikasjon på en forbedret M1 makrofag polarisering i denne pre-malign lesjon.

Konklusjon /Betydning

Disse resultatene viser at vaksinering av mus mot H. pylori
forsterker M1 polarisering av gastrisk makrofager, og at en lignende forbedret M1 polarisering er til stede i human H. pylori
indusert atrofisk gastritt

Citation. Quiding-Järbrink M, Raghavan S, Sundquist M (2010) Forbedret M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori
-Associated atrofisk gastritt og i vaksinerte mus. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10,1371 /journal.pone.0015018

Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India

mottatt: 26 august 2010; Godkjent: 07.10.2010; Publisert: 23.11.2010

Copyright: © 2010 Quiding-Järbrink et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet av kompetansesenter MIVAC, finansiert av den svenske Stiftelsen for strategisk forskning, den Adlerbert Research Foundation, Wilhelm & Martina Lundgren fundament, Inga-Britt & Arne Lundbergs stiftelse, og Sahlgrenska universitetssykehus. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Helicobacter pylori
kolon magen epitel mer enn halvparten av verdens befolkning [1]. Infeksjonen er ofte livslang og utløser en kronisk betennelse i den gastriske slimhinne, som i omtrent 1-2% av infiserte individer utvikler etter hvert inn i gastrisk adenokarsinom [1]. Utvikling av magekreft, spesielt tarmtypen, er en flertrinns prosess som utvikler seg over flere tiår gjennom premaligne lesjoner i den gastriske slimhinne, slik som atrofisk gastritt, intestinal metaplasi, dysplasi og [2]. Utfallet av infeksjonen avhenger av virulens av infisere H. pylori
belastning, miljøfaktorer som røyking og kosthold, og vert genetiske faktorer som påvirker type og intensitet av den inflammatoriske responsen [1].

En sterk pro-inflammatorisk respons er assosiert med økte nivåer av reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser i den gastriske slimhinne [3], noe som kan fremme utvikling av kreft [4]. For eksempel mus infisert med H. pylori
i seks måneder har en økt frekvens av mage mutasjoner i forhold til uinfiserte mus [5]. I tillegg mus som er mangel for enzymet induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS) har en redusert forekomst av magekreft etter H. pylori-infeksjon
og kreftfremkallende utfordring sammenlignet med normale mus [6]. Mens iNOS bidrar til utvikling av magekreft, er et høyt nivå av chemokine CCL18 i mage svulster assosiert med forlenget overlevelse av mage kreftpasienter [7]. Interessant er iNOS produsert av klassisk aktiverte /M1 makrofager mens CCL18 produksjon er et kjennetegn for alternativt aktiverte /m2 makrofager [8]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at makrofagen polarisering kan ha en viktig rolle i utviklingen av H. pylori
-associated magekreft.

M1 makrofager typisk ta del i den innledende immunresponsen mot invaderende mikroorganismer, og fremmer T-hjelpeceller (Th) en immunitet, mens M2-makrofager blir indusert i oppløsningsfasen av inflammasjon og er involvert i rusk scavenging, vev remodeling, og fremming av Th2 immunitet [8], [9]. Polarisering av makrofager er regissert av mikromiljøet. M1 makrofager indusert av interferon-y og mikrobiell produkter slik som lipopolysakkarid [9]. På den annen side er M2-makrofager indusert av Th2- eller anti-inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer, inkludert IL-4, IL-10 og transformerende vekstfaktor-β [8], [9].

I løpet H. pylori
infeksjon, er makrofager rekruttert til den gastriske slimhinne, hvor de bidrar til produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner [10], [11], [12], [13], [14], [15] . I tillegg er en fersk studie viste at liposom-mediert uttømming av makrofager redusert mage patologi i H. pylori
-infected mus [16]. Til tross for dette, funksjonen til makrofager under in vivo H. pylori
infeksjon er relativt dårlig definert. Funksjonen av makrofager er nært koplet til sin polarisasjonstilstand, som også ser ut til å ha en rolle i utvikling av magekreft [6], [7]. Derfor har vi undersøkt makrofag polarisering i mageslimhinnen av H. pylori
-infected mus og mennesker. Vi viser at vaksinering av mus mot H. pylori
hastigheter og forsterker M1 polarisering av mage makrofager. I tillegg er den pre-kreft lesjon atrofisk gastritt, karakterisert ved en forbedret macrophage M1 polarisasjon hos mennesker.

Resultatene

økt hyppighet av makrofager, eosinofiler og neutrofiler i den gastriske slimhinne etter H. pylori
infeksjon

Rekruttering av medfødte celler til stedet for infeksjon er en forutsetning for smittsomme kontroll. Ikke bare kan medfødte celler, slik som makrofager og neutrofiler, delta i bakteriedrepingen; de også produserer inflammatoriske mediatorer, som setter scenen for den påfølgende immunrespons. For å undersøke akkumulering av medfødte celler i mageslimhinnen under H. pylori
infeksjon, infisert vi C57BL /6 mus med musen tilpassede H. pylori
Sydney belastning 1 (SS1), og etter fire, åtte og 26 uker vi analyserte den inflammatoriske mage infiltrat av individuelle mus ved multi-color flowcytometri. Det totale antall lamina propria celler isolert fra magen ikke ble endret i løpet av de fire første ukene av infeksjon, men ved åtte uker etter infeksjon det totale antall celler isolert ble fordoblet, og etter 26 uker med infeksjon var der en åtte gangers økning i det totale antall celler isolert i forhold til ikke-infiserte mus (fig. 1A). Blant de cellene som blir rekruttert til magen var makrofager, eosinofile og nøytrofile. Gastriske makrofager ble identifisert som celler som uttrykker CD11b og store histokompatibilitetskompleks klasse II (MHC-II), men som mangler ekspresjon av GR1 (nøytrofile markør), CD103 (uttrykt ved en undergruppe av dendrittiske celler (DC)) og sialinsyre bindende immunoglobulin- som lektin (Siglec-F, eosinofil markør) (fig. 1B). Disse cellene uttrykte makrofag markør F4 /80 (fig. 1E), og basert på cellemorfologi ble bekreftet som makrofager (Fig. 1B). Hyppigheten av makrofager i mageslimhinnen forble uendret etter fire og åtte uker H. pylori
infeksjon (Fig. 1F). Men etter 26 uker frekvensen av mage makrofager ble økt sammenlignet med infisert mus (Fig. 1F).

Eosinofile ble definert som CD11b ^{+ Siglec-F + celler (Fig. 1C, [17]). Disse cellene uttrykte middels nivå av F4 /80 og hadde en høy side scatter profil analysert ved flowcytometri (Fig. 1E). Cresylfiolett farging av sortert CD11b + Siglec-F + celler bekreftet eosinofil morfologi (Fig. 1C). Frekvensen av eosinofiler i mageslimhinnen ble doblet etter åtte uker, og økte ytterligere etter 26 uker med infeksjon (Fig. 1F).}

Nøytrofile ble definert som CD11b ^{+ GR1 + celler (fig . 1D). Siden GR1 antistoffet gjenkjenner både Ly6C og Ly6G epitop vi bekreftet at alle CD11b + GR1 + celler uttrykte bestemt nøytrofile markør Ly6G (Fig. 1D og E). Hyppigheten av neutrofiler økt 10 ganger åtte uker etter infeksjon og ble ytterligere øket etter 26 uker (fig. 1F). Dermed under H. pylori
infeksjon det er en sekvensiell opphopning av nøytrofile og eosinofile, etterfulgt av makrofager i mage lamina propria.}

Karakterisering av mage DC

For å karakterisere mage DC, vi først identifisert en populasjon av CD11c ^{+ MHC-II + celler (fig. 2A). Når disse cellene ble videre analysert for ekspresjon av F4 /80 og den αE integrinkjede CD103, halvparten av CD11c + MHC-II + celler ble identifisert som F4 /80 + makrofager (fig. 2A ). Men blant de CD11c + MHC-II + celler som manglet uttrykk for F4 /80, to populasjoner av antatte DCs med differensial uttrykk for CD103 kan skilles (Fig. 2A). På grunn av de mange nødvendige fluorokromer valgte vi å bare beskrive den gastriske CD103 +
DC ytterligere, siden disse cellene er blitt implisert som viktige antigen-presenterende celler i slimhinnevevet [18]. Gastric CD103 + DC ble lett identifiseres ved farging for CD11c og CD103 (Fig. 2B). Mage CD103 + DC uttrykt høye nivåer av MHC-II, og besto av en CD11b lav og en CD11b høy undergruppe (Fig. 2C). Til sammenligning mage CD103 - DC var alle CD11b høy (figur 2D.). I tillegg CD103 + DC manglet ekspresjon av CD8a og F4 /80 (Fig. 2C). Men frekvensen av CD103 + DCs ikke endres vesentlig i mageslimhinnen etter infeksjon (fig. 2E).}

Gastric makrofager og CD103 + DC klarer å oppregulere samtidig stimulerende molekyler etter H. pylori
infeksjon

For å undersøke mulige effekter av H. pylori
infeksjon på uttrykk for samtidig stimulerende molekyler og MHC-II av mage makrofager og CD103 ^{+ DC, ble uttrykket av disse markørene analysert ved flowcytometri etter fire, åtte og 26 uker med infeksjon. I steady state, makrofager og CD103 + DC i mage lamina propria uttrykk for lignende nivåer av kostimulerende molekylet CD86 samt (Fig. 3A) MHC-II. Overraskende, uttrykket av CD86 og MHC-II ved enten mage makrofager eller CD103 + DC ble ikke økt etter infeksjon med H. pylori
forhold til alderstilpassede naive mus analysert parallelt (Fig. 3B). Dermed makrofager og CD103 + DC i mage lamina propria klarer å oppregulere CD86 og MHC-II etter H. pylori
infeksjon, til tross for den pågående betennelsesreaksjon.}

M1 polarisering av mage makrofager under H. pylori
infeksjon

Siden våre resultater antydet at mage makrofager kanskje ikke fullt aktivert under H. pylori
infeksjon, preget vi disse cellene videre ved å undersøke deres M1 /​​M2 polarisering. For å bestemme makrofag polarisering under H. pylori
infeksjon, anvendte vi real-time PCR for å måle ekspresjonen av gener assosiert med M1 eller M2 polarisering av makrofager i magevevet [8], [9]. Vi målte også ekspresjonen av IL-10, som kan fremstilles av regulatoriske makrofager [9]. Ingen av markører analysert var forskjellig uttrykt fire uker etter H. pylori
infeksjon i forhold til naive mus (fig. 4A). På åtte uker etter smitte uttrykk for M1 markører iNOS og CXCL11 ble betydelig økt, og disse markørene ble ytterligere oppregulert etter 26 uker på infeksjon (fig. 4A). I tillegg ble ekspresjon av IL-10 oppreguleres på åtte og 26 uker med infeksjon i forhold til naive mus (Fig. 4A). I motsetning til M2-markører som finnes i inflammatorisk sone 1 (FIZZ1) og arginase-1 ble ikke uttrykt forskjellig i magen på fire, åtte eller 26 uker etter infeksjon sammenlignet med naive mus (Fig. 4A).

for å identifisere kilden til iNOS og CXCL11 i mageslimhinnen, makrofager (CD11b ^{+ GR1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinofile (CD11b + GR1 -Siglec-F + MHC-II -) og de gjenværende celler etter gating ut makrofager og granulocytter (CD11b - og CD11b + GR1 +) ble sortert fra sammenslått mage lamina propria celler av mus infisert med H. pylori
i 26 uker (Fig. 4B). MRNA-ekspresjon av iNOS og CXCL11 i sorterte cellepopulasjoner fra infiserte mus, så vel som til sammen gastrisk lamina propria-celler fra både naive og infiserte musene ble deretter bestemt ved sanntids-PCR. Et tilstrekkelig antall sorterte makrofager kunne ikke hentes fra naive mus for pålitelig analyse av mRNA uttrykk. Gastric makrofager uttrykte det høyeste nivået av iNOS og CXCL11 forhold til de andre sorterte cellepopulasjoner og totale mage lamina propria celler før sortering (fig. 4C). Samlet utgjør disse resultatene viser at mage makrofager er polarisert til M1 under H. pylori
infeksjon.}

Vaksinasjon mot H. pylori
forsterker makrofag M1 polarisering

Protective immunisering mot H. pylori
er vanligvis forbundet med den raske utviklingen av en gastrisk Th1 reaksjon [19]. Siden Th1 cytokin interferon-γ induserer makrofag M1 polarisering [9], undersøkte vi om vaksinering kan påvirke makrofag polarisering under H. pylori
infeksjon. For dette formål, ble mus immunisert med sublingualt H. pylori
lysat og kolera toksin adjuvans, og deretter utfordret med H. pylori
SS1. Denne immuniseringssystem førte til en betydelig reduksjon i bakteriemengde i mage fire uker etter utfordring (Fig. 5A). På samme tid, ble ekspresjonen av M1 og M2 markører i magen analysert ved hjelp av sanntids-PCR. I ikke-immuniserte mus, var bare ekspresjon av CXCL11 signifikant oppregulert fire uker etter infeksjon sammenlignet med naive mus (Fig. 5B). I motsetning til dette immuniserte mus viste en stor oppregulering av både M1 markører iNOS og CXCL11, mens ekspresjonen av M2 markører FIZZ1 og arginase-1 ble ikke endret, fire uker etter utfordring (Fig. 5B). Den økte ekspresjon av iNOS og CXCL11 i immuniserte /utfordret mus var ikke på grunn av den immunisering alene, siden immunisert men ikke-utfordret mus ble ikke endret ekspresjon av hvilken som helst av de analyserte M1 eller M2 markørene sammenlignet med helt ubehandlet mus (data ikke vist ).

i tillegg, analyserte vi frekvensen av makrofager i mageslimhinnen fra immuniserte mus og utfordret ved strømningscytometri. I forhold til infiserte kun mus, immunisert mus hadde en signifikant økt hyppighet av magemakrofager tre uker etter utfordring (Fig. 5C). Imidlertid, til tross for at makrofager ble rekruttert til gastrisk mucosa fra immuniserte mus og utfordret, makrofagene ikke oppregulere ekspresjonen av CD86 eller MHC-II i forhold til infiserte-bare mus (fig. 5D). Disse resultatene viser at etter vellykket vaksinering med H. pylori
lysat og kolera toksin, makrofager akkumuleres i mageslimhinnen og er raskt polarisert til M1 etter smitte.

styrking av makrofag M1 polarisering i menneskelig atrofisk gastritt

Vi neste undersøkt rollen av H. pylori-infeksjon og
atrofisk gastritt for makrofag polarisasjon i den humane mageslimhinnen. For dette formål, ble ekspresjon av humane M1 (iNOS, CXCL11) og M2 markører (CCL17, CCL18, CD206) målt i biopsier fra antrum av real-time PCR. H. pylori
-infected personer med ukomplisert gastritt viste en signifikant forhøyet uttrykk av mRNA for både M1 (iNOS, 8 ganger, CXCL11, 20 ganger) og M2 markører (CCL17, 30-fold, CCL18, 70-fold, CD206 , 2-fold) sammenlignet med friske frivillige (fig. 6A). Imidlertid personer med atrofisk gastritt (4/6 hadde intestinal metaplasi i tillegg til atrofi), uttrykt enda høyere nivåer av mRNA iNOS sammenlignet med de med ukomplisert gastritt (20-ganger), mens CXCL11 og markører for M2 polarisasjon ble likeledes uttrykt (fig. 6A). Faktisk, uttrykket av iNOS var 180 ganger høyere hos personer med atrofisk gastritt sammenlignet med friske kontroller (Fig. 6A), noe som indikerer en forbedret M1 polarisering av mage makrofager hos pasienter med atrofisk gastritt.

For å undersøke om øket mRNA-ekspresjon av M1 og M2 markører også oversettes til økte nivåer av protein, ble de totale proteiner ekstrahert fra antrum biopsiprøver og konsentrasjonen av iNOS og CCL18 ble bestemt ved hjelp av ELISA. Gastric biopsier fra personer med atrofisk gastritt var bare tilgjengelig for protein utvinning fra en frivillig, som er differensielt indikert i figur 6B. Halvparten av H. pylori
-infected individer hadde påvisbare nivåer av iNOS protein i antrum mens konsentrasjonen av iNOS var under deteksjonsgrensen på alle uinfiserte individer (fig. 6B). Ekspresjonen av iNOS mRNA og iNOS protein ble signifikant korrelert (R 'sup> 2 = 0,88, P
< 0,01) som indikerer at mRNA-analyse reflekterer proteinekspresjon, selv når proteinnivåene er lave. Konsentrasjonen av M2 markør CCL18 ble øket i mage vev fra H. pylori
-infected personer sammenlignet med friske kontroller (Fig. 6B). Videre konsentrasjonen av CCL18 protein var signifikant korrelert med uttrykk for CCL18 mRNA (R ^{2 = 0,754, P
< 0,01).}

Samlet utgjør disse funnene indikerer tilstedeværelsen av både M1 og M2 makrofager i mageslimhinnen av H. pylori
-infected individer. Videre er atrofisk gastritt forbundet med en kraftig forsterkning av iNOS ekspresjon i mageslimhinnen, hvilket indikerer en forbedret M1 polarisering av makrofager.

diskusjon

I denne studien, har vi undersøkt polarisasjonen av gastrisk makrofager under kronisk H. pylori
infeksjon. Vi viser at H. pylori
-infected individer uttrykker mRNA i gastrisk mucosa som indikerer en blandet M1 /​​M2 polarisering av makrofager, og dette ble ytterligere bekreftet på proteinnivået. Men i H. pylori
indusert atrofisk gastritt var det en markert økning i uttrykket av iNOS forhold til ukomplisert gastritt. Atrofisk gastritt overfører en økt risiko for å utvikle magekreft i forhold til ukomplisert H. pylori
-associated gastritt [20]. Den økte ekspresjon av iNOS i atrofisk gastritt kan bidra til magekreft utvikling via produksjon av reaktive nitrogenforbindelser, som kan fremme carcinogenese ved induksjon av DNA-skade, forstyrrelser i DNA-reparasjon, post-translasjonell modifikasjon av proteiner, og p53-mutasjoner [4]. Faktisk iNOS-manglende mus har en redusert forekomst av adenokarsinom i ventrikkel etter H. pylori-infeksjon og
utfordring med en kjemisk karsinogen sammenlignet med normale mus [6]. Også polymorfismer i promoterregionen av iNOS, som fører til en høyere transkripsjonen aktivitet, korrelerer med en høyere forekomst av tarmtypen magekreft i japansk kvinner [21].

I motsetning til humant H . pylori
infeksjon, SS1-infiserte C57BL /6 mus viste en genekspresjon profil i den gastriske slimhinne tegn på makrofag M1 polarisering. Genekspresjonsanalyse av sorterte makrofager isolert fra mageslimhinnen av infiserte mus bekreftet at uttrykk for M1 markører iNOS og CXCL11 ble beriket i den sorterte makrofag befolkningen. Videre M1 polarisering av mage makrofager ble vesentlig fremskyndet av tidligere vaksinasjon. Allerede fire uker etter smitte, immunisert mus oppregulert uttrykket av iNOS og CXCL11 til et tilsvarende nivå som observert etter 26 uker i infiserte kun mus. Studier av iNOS-manglende mus har vist at iNOS fremmer utvikling av atrofi og kreft i mageslimhinnen under Helicobacter
infeksjon [6], [22]. Videre clearance H. pylori
etter vaksinering skjer uavhengig av iNOS [23]. Dermed ser iNOS å bidra til å være vert for patologi i stedet for beskyttelse under infeksjon med H. pylori
. Derfor, hvis den økte produksjon av iNOS i gastrisk mucosa opprettholdes etter vaksinering, kan det være en uønsket bivirkning som kan forsterke graden av H. pylori
indusert betennelse og kreft, med mindre sterile immunitet er oppnådd. Men den relative bidrag av iNOS vert patologi i forhold til beskyttelse under forskjellige stadier av H. pylori
infeksjon garanterer videre etterforskning.

Vi observerte en sekvensiell rekruttering av medfødte celler til mage mucosa av SS1-infiserte mus, med makrofagene akkumulere ganske sent i løpet av infeksjon (26 uker). I kontrast til frekvenser av mage neutrofiler og eosinofiler i den gastriske slimhinne økes åtte uker etter infeksjon og forble forhøyet i 26 uker. Oppbyggingen av makrofager oppsto mye raskere i vaksinerte mus, i hvilket tilfelle frekvensen av mage makrofager ble hevet allerede tre uker etter utfordring. Tidligere er neutrofiler blitt vist å bli rekruttert til gastrisk mucosa fra SS1-infiserte mus i to faser, en tidlig fase nådde en topp innen 1-2 dager etter infeksjon og en sen fase begynner ved 2-3 uker etter infeksjon [24]. En rekruttering mønster, lik som neutrofiler, ble også beskrevet for gastrisk makrofager [24]. Imidlertid ble makrofagene definert som CD11b ^{+ GR1 - celler [24], en cellepopulasjon som i våre hender i hovedsak består av eosinofiler (se Fig 1 og 2.). Asim et al. definerte makrofager som CD11b + F4 /80 + celler, og observert en tidlig topp i makrofag nummer i mageslimhinnen 1-2 dager etter infeksjon med H. pylori product: [15]. I tillegg ble antallet makrofager økte igjen ved 60 og 120 dager etter infeksjon i forhold til ubehandlede mus [15]. Vi utvider disse resultatene ved å vise at rekrutteringen av disse medfødte celle populasjoner opprettholdes inntil 26 uker etter smitte. I tillegg, beskriver vi akkumulering av eosinofiler i gastrisk mucosa, en cellepopulasjon at langt flere enn magemakrofager og nøytrofile celler (fig. 1). Faktisk, rollen av eosinofiler i H. pylori
indusert gastritt bør undersøkes nærmere. Eosinofiler og makrofager andel ekspresjon av flere markører, inkludert CD11b og F4 /80 (Fig. 1, [25]). Derfor, flere markører må analyseres samtidig for å skille disse medfødte cellepopulasjoner.}

Vi var i stand til å identifisere to populasjoner av DC i mageslimhinnen hos mus. Begge undergrupper uttrykte høye nivåer av CD11c og MHC-II, manglet ekspresjon av makrofag markør F4 /80, men var forskjellig med hensyn til ekspresjon av CD103. Hyppigheten av mage CD103 ^{+ DCs ikke endret etter fire, åtte eller 26 uker med H. pylori
infeksjon. I motsetning til vår studie, en fersk studie av Kao et al. kunne ikke oppdage CD103 + DC i mageslimhinnen av infiserte mus [26]. Snarere CD103 + DC dukket opp 24 timer etter H. pylori
infeksjon. Siden tider av analysen skiller mellom den studien og våre eksperimenter, er det vanskelig å direkte sammenligne resultatene.}

Til tross for at M1 makrofager typisk oppregulere MHC-II og samtidig stimulerende molekyler, vi kunne ikke oppdage et økt uttrykk av MHC -II eller CD86 på mage makrofager eller CD103 ^{+ DC fra enten ikke-immunisert eller immuniserte mus etter smitte. I motsetning til dette in vitro-inkubering av H. pylori
med humane monocytter [27], human monocytt-avledede DC [28], [29], [30], [31], murin benmarg-avledede DC [32], [33], eller human primær gastrisk DCs [34], induserer oppregulering av samtidig stimulerende molekyler og MHC-II. Derfor unnlatelse av å oppregulere MHC-II og CD86 på mage makrofager og CD103 + DC i kronisk H. pylori
infeksjoner kan være forårsaket av den inflammatoriske miljøet og ikke av bakterier per se. Faktisk, samspillet mellom DC og H. pylori
in vitro gjenspeiler ikke nødvendigvis hva som skjer in vivo, der den lokale mikromiljøet på stedet av antigen oppkjøp og antigen presentasjon samt DC undergruppe involvert i antigen presentasjon av H. pylori
, vil påvirke responsen. For eksempel, regulatoriske T-celler, som er utbredt i H. pylori
-infected mageslimhinnen [35], [36], kan hindre oppregulering av samtidig stimulerende molekyler og MHC-II på DCs [37]. I tillegg kan IL-10 hindre oppregulering av ko-stimulerende molekyler og MHC-II på makrofager og DC [38].}

I løpet av akutte inflammatoriske responser, makrofager typisk polarisert til M1 og utøve potente antimikrobielle effekter. For eksempel, infeksjon med Salmonella typhimurium
eller Listeria monocytogenes
induserer M1 polarisering av makrofager, som er nødvendig for kontroll av infeksjonen [39]. Oppløsning av betennelsen er kjennetegnet ved en forskyvning i makrofag polarisasjon til M2, som fremmer helbredelse vev. Tuberkulosepasienter vise en økt produksjon av Th2 cytokiner som infeksjonen utvikler seg [40], [41], som kan indusere M2 polarisering av makrofager. Hos mus, utgjør M1 polarisering av makrofager tidlig respons på Mycobacterium tuberculosis
, mens alveolære makrofager er polarisert til M2 under sent stadium infeksjon [42]. Men skiftet i makrofag polarisering indusert av kroniske infeksjoner ofte resulterer i en redusert kapasitet av makrofager til å drepe invaderende bakterier [39], [43]. På den annen side er kronisk betennelse med vedvarende M1 makrofag polarisering forbundet med en økt risiko for kreftutvikling [4].

Gjør makrofager bidra til å være vert for forsvar mot H. pylori
? I motsetning til neutrofiler, makrofager er ikke ofte sett i magelumen etter trans tvers av epitelet [44]. Siden H. pylori
fortrinnsvis ligge i den gastriske slimet laget eller er festet til mage epitelceller, makrofager kan ikke komme i direkte kontakt med hele bakterier. Faktisk, nedbrytning av makrofager etter medikament-inneholdende liposomer hadde ingen effekt på H. pylori
kolonisering [16], noe som tyder på at makrofager ikke kan direkte bidra til å være vert for forsvar mot H. pylori
. I motsetning til dette, kan makrofager fremme gastrisk patologi. For eksempel, liposom-mediert uttømming av makrofager bedres den gastritt indusert av H. pylori
infeksjon [16]. I tillegg selektiv sletting av I-kB-kinase β i myeloide celler, som hindrer aktivering av NF-kB i disse cellene hemmet utviklingen av gastrisk atrofi etter H. felis
infeksjon [45]. Dermed trenger makrofager ikke ut til å bidra til å Helicobacter
klarering, men kan heller fremme gastric patologi.

I konklusjonen, viser denne studien at vaksinering av mus mot H. pylori
forsterker M1 polarisering av mage makrofager. Et lignende fenomen er sett i human atrofisk gastritt, hvor den blandede M1 /​​M2 polarisasjon til stede i ukomplisert gastritt er erstattet med en M1-dominerte polarisering. Dette kan indusere en tumor-fremme betennelse, og skiftende makrofag polarisering fra M1 til M2 kan derfor representere et terapeutisk mål i kronisk H. pylori
infeksjon.

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

Studiet ble godkjent av regjeringen dyreetikk komité (Göteborgs djurförsöksetiska nämnd, 328/2008 og 254 /2009). Den regionale menneskelig etikk komité av Västra Götalands län i Sverige (706/03 og 85/06) godkjent studien, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Dette er den eneste myndighet gi etisk tillatelse for forskning på mennesker i Sverige, og det er ikke direkte knyttet til sykehus og universiteter.

Mus

Kvinne C57BL /6 mus ble kjøpt fra Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland), eller i tilfelle av vaksinasjonsforsøk fra Taconic (Ejby, Danmark). Mus ble smittet i en alder av 8-12 uker.

Bakterier og infeksjon av mus

H. pylori
SS1 ble dyrket i Columbia ISO-agarplater i 2 dager ved 37 ° C, hvoretter de ble overført til Brucella buljong supplert med 5% føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika (Vancomycin, 10 mikrogram /ml; Polymyxin B , 20 U /ml; Trimethoprim, 5 ug /ml) og inkubert risting over natten ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser. Før infeksjon ble motiliteten av bakteriene bekreftet ved mikroskopi. Konsentrasjonen av bakterier ble bestemt spektrofotometrisk. Mus fikk 3 × 10 ^{8 kolonidannende enheter av SS1 intragastrisk.}

Sublingualt immunisering

Mus fikk fire 10 mL doser på 500 mikrogram H. pylori
lysat (fremstilt fra stamme Hel305 som tidligere beskrevet [46]), kombinert med 10 ug koleratoksin (List Biological Laboratories Inc., Madison, New Jersey) sublingualt at 1-ukers intervaller [47], [48]. To uker etter den siste immunisering ble musene utfordret intragastrisk med 3 x 10 ^{8 kolonidannende enheter av H. pylori
SS1.}

Vurdering av bakteriell kolonisering

For kvantitativ vurdering av bakteriell kolonisering i immuniseringseksperimenter, en halvdel av magen ble forsiktig vasket med PBS og homogenisert ved bruk av en Ultra Turrax homogenisator ( IKA Laboratory Technology, Staufen, Tyskland). Serielle fortynninger av homogenatet ble sådd ut på Skirrow agarplater. Når gastrisk lamina propria-celler ble isolert fra hele magen en kvantitativ bestemmelse av bakterie gastrisk lasten ikke kan utføres. I dette tilfelle ble magen, som ble kuttet langs den store kurvatur og vasket i PBS, forsiktig strøket ut på Skirrow agarplater. Tilstedeværelsen av H. pylori
kolonier ble bekreftet av en urease test. På denne måten kan vi bekrefte H. pylori
kolonisering og fortsatt bruke hele magen for celle isolasjon.

Isolering av mage lamina propria celler

kjertelmagen ble kuttet i 5 mm biter og inkuberes totalt tre ganger med H.

• PLoS ONE: Nøyaktighet og grenseverdier for Pepsinogens I, II og Gastrin 17 for diagnostisering av Gastric fundic Atrofi: Influence of Gastritt
• PLoS ONE: Bakterie Microbiota Profilering i gastritt uten Helicobacter pylori infeksjon eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler bruk