PLOS ONE: Reforçada M1 macrófagos Polarização in Human Helicobacter pylori-Associated Gastrite atrófica e em Vacinados Mice

Abstract

Fundo

A infecção com o Helicobacter pylori
desencadeia uma gástrica crónica inflamação que pode progredir para atrofia e adenocarcinoma gástrico. Polarização de macrófagos é uma característica tanto de cancro e infecção, e podem promover a progressão ou a resolução da doença. No entanto, o papel dos macrófagos e a sua polarização durante H. pylori
não foi bem definida.

Metodologia /Principais Achados

Usando um modelo de rato de infecção e biópsias gástricas de 29 indivíduos, analisamos recrutamento de macrófagos e polarização durante H. pylori
infecção por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Nós achamos um recrutamento sequencial de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos para a mucosa gástrica de ratos infectados. análise de expressão gênica do tecido do estômago e macrófagos ordenados revelou que os macrófagos gástricos foram polarizados para M1 depois de H. pylori
infecção, e este processo foi substancialmente acelerado pela vacinação prévia. Human H. pylori
foi caracterizada por um misto de polarização M1 /​​M2 de macrófagos. No entanto, em H. pylori
gastrite atrófica -associated, a expressão do iNOS foi marcadamente aumentou em comparação com gastrite simples, indicativo de uma polarização de macrófagos M1 reforçada neste lesão pré-maligna.

Conclusões /Significado

Estes resultados mostram que a vacinação de ratinhos contra H. pylori
amplifica M1 polarização de macrófagos gástrico, e que uma polarização melhorada M1 semelhante está presente no humano H. pylori
gastrite atrófica induzida

Citation:. Quiding-Järbrink M, Raghavan S, Sundquist M (2010) aprimorado M1 macrófagos Polarização in Human Helicobacter pylori
-Associated Gastrite atrófica e em Os ratinhos vacinados. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10.1371 /journal.pone.0015018

editor: Niyaz Ahmed, da Universidade de Hyderabad, Índia |

Recebido: 26 de agosto de 2010; Aceito: 07 de outubro de 2010; Publicação: 23 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Quiding-Järbrink et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo centro de MIVAC excelência, financiado pela Fundação sueca para a Investigação Estratégica, o Adlerbert Research Foundation, Wilhelm & A fundação de Martina Lundgren, Inga-Britt & A fundação de Arne Lundberg, e do Hospital Universitário Sahlgrenska. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori
colonizar o epitélio estomacal de mais de metade da população do mundo [1]. A infecção é muitas vezes ao longo da vida e provoca uma inflamação crónica da mucosa gástrica, que em cerca de 1-2% dos indivíduos infectados, eventualmente, se desenvolve em adenocarcinoma gástrico [1]. Desenvolvimento do cancro gástrico, em especial, do tipo intestinal, é um processo multi-passo que progride ao longo de décadas através de lesões pré-malignas da mucosa gástrica, tais como gastrite atrófica, metaplasia intestinal e displasia [2]. O resultado da infecção depende da virulência do infectar H. pylori
tensão, fatores ambientais, como tabagismo e dieta, e fatores genéticos que influenciam o tipo ea intensidade da resposta inflamatória [1].

A resposta pró-inflamatória forte está associada com aumento dos níveis de oxigénio e azoto espécies reactivas na mucosa gástrica [3], que podem promover o desenvolvimento do cancro [4]. Por exemplo, os ratos infectados com H. pylori Compra de seis meses têm um aumento da frequência de mutações gástricas em comparação com ratinhos não infectados [5]. Além disso, os ratinhos que são deficientes para a enzima induzível da óxido nítrico sintase (iNOS) tem uma redução da incidência de cancro gástrico após H. pylori
desafio infecção e cancerígeno em comparação com ratos normais [6]. Enquanto iNOS contribui para o desenvolvimento de cancro gástrico, um elevado nível da quimiocina CCL18 em tumores gástricos está associada com a sobrevivência prolongada de doentes com cancro gástrico [7]. Curiosamente, iNOS é produzido por classicamente activados macrófagos /M1 enquanto a produção de CCL18 é um marco para alternativamente activados macrófagos /M2 [8]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a polarização de macrófagos pode ter um papel importante no desenvolvimento de H. cancro gástrico -associated pylori
.

macrófagos M1 normalmente participam na resposta imune inicial para microorganismos invasores e promover T helper (Th) 1 imunidade, enquanto que os macrófagos M2 são induzidos durante a fase de resolução da inflamação e estão envolvidos na eliminação de detritos, remodelação de tecidos, e promoção da imunidade Th2 [8], [9]. Polarização de macrófagos é dirigido pelo microambiente. macrófagos M1 são induzidas por interf erão-y e produtos microbianos, tais como lipopolissacárido [9]. Por outro lado, os macrófagos M2 são induzidas por Th2- ou citocinas anti-inflamatórias e factores de crescimento, incluindo IL-4, IL-10 e factor de crescimento transformante-β [8], [9].

Durante H. pylori
, macrófagos são recrutados para a mucosa gástrica, onde contribuem para a produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Além disso, um estudo recente mostrou que a diminuição mediada por lipossomas de macrófagos reduzida patologia gástrica em H. pylori
camundongos infectados [16]. Apesar disso, a função dos macrófagos durante in vivo H. pylori
continua a ser relativamente pouco definida. A função dos macrófagos é intimamente ligado ao seu estado de polarização, que também parece ter um papel no desenvolvimento do cancro gástrico [6], [7]. Portanto, nós examinamos a polarização de macrófagos na mucosa gástrica de H. pylori
camundongos infectados e seres humanos. Mostramos que a vacinação de ratinhos contra H. pylori
velocidades e amplifica M1 polarização de macrófagos gástricas. Além disso, a gastrite atrófica lesão pré-cancerosa é caracterizada por um macrófago M1 polarização melhorada em seres humanos.

Resultados

aumento da frequência de macrófagos, eosinófilos e neutrófilos na mucosa gástrica após H. pylori

O recrutamento de células inatas para o local da infecção é um pré-requisito para o controle infeccioso. Não só pode inata células, tais como neutrófilos e macrófagos, participar na morte bacteriana; eles também produzem mediadores inflamatórios, que preparou o palco para a resposta imune que se seguiu. Para investigar o acúmulo de células inatas na mucosa gástrica durante a H. pylori
, que infectou camundongos C57BL /6 com a adaptação do rato H. pylori
Sydney estirpe 1 (SS1), e depois de quatro, oito e 26 semanas analisamos o infiltrado inflamatório gástrica de ratos individual, multi-color citometria de fluxo. O número total de células da lâmina própria isoladas a partir do estômago não se alterou durante as primeiras quatro semanas de infecção, mas a oito semanas após a infecção, o número total de células isoladas foi duplicada, e com 26 semanas de infecção, houve um aumento de oito vezes do número total de células isoladas em comparação com ratinhos não infectados (Fig. 1A). Entre as células que são recrutadas para o estômago eram macrófagos, eosinófilos e neutrófilos. macrófagos gástricas foram identificadas como células que expressam CD11b e histocompatibilidade principal classe complexo II (MHC-II), mas com falta de expressão de Gr1 (marcador de neutrófilos), CD103 (expressa por um subconjunto de células dendríticas (DC)) e immunoglobulin- de ligação de ácido siálico como lectina (Siglec-M, marcador de eosinófilos) (Fig. 1B). Estas células expressaram o marcador de macrófagos F4 /80 (Fig. 1E), e com base na morfologia celular foram confirmados como macrófagos (Fig. 1B). A frequência dos macrófagos na mucosa gástrica permaneceu inalterado após os quatro e oito semanas de H. pylori
infecção (Fig. 1F). No entanto, após 26 semanas a freqüência de macrófagos gástricas foi aumentada em comparação com ratinhos não infectados (Fig. 1F).

Os eosinófilos foram definidos como CD11b ^{+ Siglec-F + células (Fig. 1C, [17]). Estas células expressaram níveis intermediários de F4 /80 e tinha um perfil de difusão lado alto quando analisados ​​por citometria de fluxo (Fig. 1E). coloração violeta cresil de ordenados CD11b + Siglec-F + células morfologia dos eosinófilos confirmada (Fig. 1C). A frequência de eosinófilos na mucosa gástrica foi dobrada após oito semanas e aumentou ainda mais após 26 semanas de infecção (Fig. 1F).}

Os neutrófilos foram definidos como CD11b ^{+ Gr1 + células (Fig . 1D). Uma vez que o anticorpo reconhece tanto o Gr1 epitopo Ly6C Ly6G e confirmou-se que todas as CD11b + Gr1 + células expressaram o marcador específico de neutrófilos Ly6G (Fig. 1D, E). A frequência de neutrófilos aumentou 10 vezes oito semanas após a infecção e foi aumentada após 26 semanas (fig. 1F). Assim, durante H. pylori
há uma acumulação sequencial de neutrófilos e eosinófilos, seguido por macrófagos na lâmina própria gástrico.}

Caracterização de DCs gástrica

Para caracterizar as DCs gástricos, que pela primeira vez identificada uma população de CD11c ^{+ MHC-II + células (Fig. 2A). Quando estas células foram adicionalmente analisadas quanto à expressão de F4 /80 e a cadeia αE integrina CD103, metade do CD11c + de MHC-II + células foram identificadas como F4 /80 + macrófagos (Fig. 2A ). No entanto, entre o CD11c + de MHC-II + células que não tinham expressão de F4 /80, duas populações de DC putativos com expressão diferencial de CD103 pode ser distinguida (Fig. 2A). Devido aos muitos fluorocromos necessários escolhemos só para caracterizar o CD103 gástrica <> + sup
DCs ainda mais, uma vez que estas células têm sido implicados como antigénio importante em células apresentadoras de tecidos da mucosa [18]. Gástrica CD103 + DCs foram facilmente identificados através de coloração para CD11c e CD103 (Fig. 2B). O CD103 gástrica + DCs expressa altos níveis de MHC-II, e consistiu de uma CD11b baixa e uma CD11b alta subconjunto (Fig. 2C). Em comparação, o CD103 gástrica - DCs foram todos CD11b alta (Fig 2D.). Além disso, o CD103 + DCs faltava expressão de CD8a e F4 /80 (Fig. 2C). No entanto, a frequência de CD103 + DCs não mudou significativamente na mucosa gástrica após a infecção (Fig. 2E).}

macrófagos gástrico e CD103 + DCs não upregulate moléculas co-estimuladoras, após H. pylori

A fim de investigar os possíveis efeitos da H. pylori
sobre a expressão de moléculas co-estimuladoras e MHC-II por macrófagos gástricas e CD103 ^{+ DCs, a expressão destes marcadores foi analisada por citometria de fluxo depois de quatro, oito e 26 semanas depois da infecção. No estado estável, macrófagos e CD103 + DCs na lâmina própria gástrico expressaram níveis similares de o co-estimuladora CD86, bem como MHC-II (Fig. 3A). Surpreendentemente, a expressão de CD86 e MHC-II, quer por macrófagos gástricas ou CD103 + DC não foi aumentada após a infecção com H. pylori
relação a camundongos normais da mesma idade, feita em paralelo (Fig. 3b). Assim, macrófagos e CD103 + DCs na lâmina gástrica não upregulate CD86 e MHC-II depois de H. pylori
infecção, apesar da resposta inflamatória em curso.}

M1 polarização de macrófagos gástrico durante a H. pylori
infecção

Uma vez que nossos resultados sugerem que os macrófagos gástricas não pode ser totalmente ativado durante a H. pylori
, caracterizamos estas células ainda por investigar a sua polarização M1 /​​M2. Para determinar a polarização de macrófagos durante a H. pylori
, utilizou-se PCR em tempo real para medir a expressão de genes associados com a M1 ou M2 polarização de macrófagos no tecido gástrico [8], [9]. Nós também medido a expressão de IL-10, que pode ser produzido por macrófagos reguladoras [9]. Nenhum dos marcadores analisados ​​foram diferencialmente expressos quatro semanas após o H. pylori
a infecção em relação a ratinhos ingénuos (Fig. 4A). Aos oito semanas após a infecção a expressão de marcadores M1 a iNOS e a CXCL11 foi significativamente aumentada, e estes marcadores foram ainda mais supra-regulada em 26 semanas de infecção (Fig. 4a). Além disso, a expressão de IL-10 foi regulada positivamente em oito e 26 semanas de infecção em relação a ratinhos não afectados (Fig. 4A). Em contraste, os marcadores M2 encontrados na zona inflamatória 1 (FIZZ1) e arginase-1 não foram expressas diferencialmente no estômago em quatro, oito ou 26 semanas depois da infecção em comparação com ratinhos não afectados (Fig. 4A).

para identificar a origem do iNOS e CXCL11 na mucosa gástrica, os macrófagos (CD11b ^{+ Gr1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinófilos (CD11b + Gr1 -Siglec-F + MHC-II -) e as células restantes após gating fora macrófagos e eosinófilos (CD11b - e CD11b + Gr1 +), foram ordenados a partir da mistura células da lâmina própria gástricos de camundongos infectados com H. pylori
durante 26 semanas (Fig. 4B). A expressão de ARNm de iNOS e CXCL11 em populações de células classificadas a partir de ratinhos infectados, assim como em células totais gástrica lamina propria de ratinhos ingénuos e ambos infectada foi então determinada por PCR em tempo real. Um número suficiente de macrófagos ordenados não poderia ser obtido a partir de ratinhos não afectados para a fiabilidade da análise da expressão de ARNm. macrófagos gástricas expressa o mais alto nível de iNOS e CXCL11 em comparação com as outras populações de células ordenada e células da lâmina própria gástricas totais antes da classificação (Fig. 4C). Tomados em conjunto, estes resultados mostram que os macrófagos gástricas são polarizados para M1 durante a H. pylori
infecção.}

A vacinação contra a H. pylori
amplifica macrófagos M1 polarização

imunização de protecção contra o H. pylori
é geralmente associada com o rápido desenvolvimento de uma resposta Th1 gástrica [19]. Desde o Th1 citocina interferon-γ induz macrófagos M1 polarização [9], examinamos se a vacinação poderia influenciar a polarização de macrófagos durante a H. pylori
infecção. Para este fim, os ratos foram imunizados por via sublingual com H. pylori
lisado e toxina da cólera adjuvante, e subsequentemente desafiados com H. pylori
SS1. Este regime de imunização conduziu a uma redução significativa da carga bacteriana no estômago quatro semanas após o desafio (Fig. 5A). Ao mesmo tempo, a expressão de marcadores M1 e M2 no estômago foi analisada por PCR em tempo real. Em ratinhos não imunizados, apenas a expressão de CXCL11 foi significativamente regulada positivamente quatro semanas após a infecção, em comparação com ratinhos não afectados (Fig. 5B). Em contraste, os ratinhos imunizados mostraram uma grande regulação positiva de ambos os marcadores M1 iNOS e CXCL11 passo que a expressão do M2 marcadores FIZZ1 e arginase-1 não foi mudado, quatro semanas após o desafio (Fig. 5B). O aumento da expressão de iNOS e CXCL11 em ratinhos imunizados /desafiado não era apenas devido à imunização, uma vez imunizado mas ratinhos não desafiados não alterou a expressão de qualquer um dos marcadores M1 ou M2 analisados ​​em comparação com os ratos sem qualquer tratamento (dados não mostrados ).

Além disso, foi analisada a frequência de macrófagos na mucosa gástrica de ratos imunizados e desafiados por citometria de fluxo. Relativa como somente infectados ratos, camundongos imunizados teve um aumento significativo da frequência de macrófagos gástricas três semanas após o desafio (Fig. 5C). No entanto, apesar de que os macrófagos foram recrutados para a mucosa gástrica de ratos imunizados e desafiados, os macrófagos não regular positivamente a expressão de CD86 ou MHC-II em relação a ratinhos infectados somente-(Fig. 5D). Estes resultados mostram que depois de vacinação bem sucedida com H. pylori
lisado e toxina da cólera, os macrófagos se acumulam na mucosa gástrica e são rapidamente polarizada a M1 após a infecção.

Aumento de macrófagos M1 polarização na gastrite atrófica humano

A seguir investigou o papel de H. pylori
infecção e gastrite atrófica para a polarização de macrófagos na mucosa gástrica humana. Para este efeito, a expressão de marcadores humanos M1 (iNOS, CXCL11) e m2 (CCL17, CCL18, CD206) foi medida em biópsias de antro por PCR em tempo real. H. pylori
indivíduos infectados com gastrite simples mostrou uma expressão significativamente elevados de ARNm para ambos M1 (iNOS, 8 vezes; CXCL11, 20 vezes) e marcadores M2 (CCL17, 30 vezes; CCL18, 70 vezes, CD206 , 2 vezes) em comparação com voluntários não infectados (Fig. 6A). No entanto, indivíduos com gastrite atrófica (06/04 tinha metaplasia intestinal, além de atrofia) expressaram níveis ainda mais elevados de ARNm de iNOS em comparação com aqueles com gastrite sem complicações (20 vezes), ao passo que a CXCL11 e marcadores de polarização M2 foram expressas de modo semelhante (Fig. 6A). Na verdade, a expressão do iNOS foi 180 vezes maior em indivíduos com gastrite atrófica em comparação com controles não infectados (Fig. 6A), indicando uma polarização M1 reforçada de macrófagos gástricas em pacientes com gastrite atrófica.

Para investigar se a aumento da expressão de mRNA de marcadores M1 e M2 também se traduz em níveis aumentados de proteínas, as proteínas totais foram extraídas de amostras de biópsia antrais e a concentração de iNOS e CCL18 foi determinada por ELISA. biópsias gástricas de indivíduos com gastrite atrófica estava disponível apenas para extração de proteínas a partir de um voluntário, que é diferentemente indicado na Figura 6B. Metade do H. pylori
indivíduos infectados tinham níveis detectáveis ​​de proteínas iNOS no antro enquanto que a concentração de iNOS foi abaixo do limite de detecção em todos os indivíduos não infectados (Fig. 6B). A expressão de ARNm de iNOS e proteínas iNOS foi significativamente correlacionados (r ^{2 = 0,88, P
< 0,01) indicando que o ARNm de análise reflecte a expressão da proteína, mesmo quando os níveis da proteína são baixos. A concentração do marcador CCL18 M2 foi aumentado no tecido gástrico a partir de H. pylori
indivíduos infectados em comparação com controles não infectados (Fig. 6B). Além disso, a concentração de proteína CCL18 foi significativamente correlacionada com a expressão de ARNm CCL18 (R 2 = 0,754, P
< 0,01).}

Tomados em conjunto, estes resultados indicam a presença de ambos os macrófagos M1 e M2 na mucosa gástrica de H. pylori
indivíduos infectados. Além disso, a gastrite atrófica está associada com uma forte amplificação da expressão de iNOS na mucosa gástrica, indicando uma polarização M1 aumentada de macrófagos.

Discussão

Neste estudo, investigou-se a polarização de gástrica macrófagos durante crónica H. pylori
infecção. Mostramos que H. pylori
indivíduos infectados por expressar ARNm na mucosa gástrica indicativo de uma mistura de polarização M1 /​​M2 de macrófagos, e isto foi confirmado ao nível da proteína. No entanto, em H. pylori
gastrite atrófica induzida houve uma elevação acentuada na expressão de iNOS em comparação com gastrite não complicada. gastrite atrófica confere um risco aumentado de desenvolver câncer gástrico em relação ao simples H. pylori
gastrite -associated [20]. O aumento da expressão de iNOS em gastrite atrófica pode contribuir para o desenvolvimento do cancro gástrico através da produção de espécies de azoto reactivos, que podem promover a carcinogénese pela indução de dano do ADN, interrupção da reparação do ADN, modificação pós-tradução de proteínas, e mutações de p53 [4]. De fato, os camundongos iNOS com deficiência têm uma menor incidência de adenocarcinoma gástrico após a H. pylori
infecção e desafio com um químico cancerígeno em comparação com ratos normais [6]. Além disso, polimorfismos na região do promotor de iNOS, que conduzem a uma actividade de transcrição mais elevado, correlacionam-se com uma maior incidência do tipo intestinal do cancro gástrico em mulheres japonesas [21].

Em contraste com humano H . pylori
infecção, SS1-infectados ratinhos C57BL /6 mostrou um perfil de expressão do gene na mucosa gástrica indicativo de macrófagos M1 polarização. análise de macrófagos ordenadas isoladas da mucosa gástrica de ratos infectados, a expressão do gene confirmou que a expressão de marcadores M1 a iNOS e a CXCL11 foi enriquecida na população de macrófagos de classificação. Além disso, a polarização de macrófagos M1 gástricas foi substancialmente acelerado pela vacinação prévia. Já quatro semanas após o desafio, os ratos imunizados regulada a expressão do iNOS e CXCL11 a um nível semelhante ao observado após 26 semanas em só de camundongos infectados. Estudos de ratinhos deficientes em iNOS têm mostrado que iNOS promove o desenvolvimento de cancro e a atrofia na mucosa gástrica durante Helicobacter
infecção [6], [22]. Além disso, a depuração de H. pylori
após a vacinação ocorre independentemente da iNOS [23]. Assim, iNOS parece contribuir para sediar patologia em vez de proteção durante a infecção com H. pylori
. Portanto, se o aumento da produção de iNOS na mucosa gástrica é mantida após a vacinação, pode ser um efeito colateral indesejado que pode aumentar a gravidade de H. pylori
inflamação induzida e malignidade, a menos imunidade estéril é alcançada. No entanto, a contribuição relativa de iNOS para hospedar patologia contra proteção durante diferentes fases da H. pylori
mandados de infecção posterior investigação.

Foi observada uma recrutamento sequencial de células inatas para a mucosa gástrica de ratos SS1-infectados, com os macrófagos acumulando bastante tarde durante o curso da infecção (26 semanas). Em contraste, as frequências de neutrófilos e eosinófilos gástricas na mucosa gástrica aumentada oito semanas após a infecção e permaneceram elevados em 26 semanas. A acumulação de macrófagos ocorreu muito mais rapidamente em ratinhos vacinados, caso em que a frequência de macrófagos foi já gástricas aumentaram três semanas após o desafio. Anteriormente, os neutrófilos têm sido mostrados para ser recrutados para a mucosa gástrica de ratos infectados-SS1 em duas fases, uma fase inicial com um pico de 1-2 dias após a infecção e uma fase final com início às 2-3 semanas após a infecção [24]. Um padrão de recrutamento, semelhante ao de neutrófilos, também foi descrito para os macrófagos gástricas [24]. No entanto, os macrófagos foram definidos como CD11b ^{+ Gr1 - células [24], uma população de células que nas nossas mãos é composto principalmente de eosinófilos (ver fig 1 e 2.). Asim et ai. macrófagos definidos como CD11b + F4 /80 + células, e observou-se um pico no início número de macrófagos na mucosa gástrica de 1-2 dias após a infecção com H. pylori
[15]. Além disso, o número de macrófagos foi aumentada novamente aos 60 e 120 dias após a infecção em relação a ratinhos naive [15]. Nós estendemos estes resultados, mostrando que o recrutamento dessas populações de células inatas é mantida até 26 semanas após a infecção. Além disso, descreve-se a acumulação de eosinófilos na mucosa gástrica, uma população de células que, de longe, os mais numerosos macrófagos e neutrófilos gástricos (Fig. 1). Na verdade, o papel dos eosinófilos em H. pylori
gastrite induzida deve ser mais investigada. Os eosinófilos e macrófagos partes expressão de vários marcadores, incluindo CD11b e F4 /80 (Fig. 1, [25]). Portanto, vários marcadores precisam ser analisadas simultaneamente, a fim de distinguir estas populações de células inatas.}

Conseguimos identificar duas populações de DCs na mucosa gástrica de ratos. Ambos os subconjuntos expressaram niveis elevados de CD11c e MHC-II, faltava a expressão do marcador de macrófagos F4 /80, mas diferem no que diz respeito à expressão de CD103. A frequência de CD103 gástrica ^{+ DCs não se alterou depois de quatro, oito ou 26 semanas de H. pylori
infecção. Em contraste com nosso estudo, um estudo recente da Kao et al. Não foi possível detectar CD103 DCs + na mucosa gástrica de ratos não infectados [26]. Pelo contrário, o CD103 + DCs surgiu 24 horas depois de H. pylori
infecção. Desde os tempos de análise diferem entre esse estudo e nossas experiências, é difícil comparar diretamente os resultados.}

Apesar de que os macrófagos M1 normalmente upregulate MHC-II e moléculas co-estimuladoras, não foi possível detectar um aumento da expressão de MHC -II ou CD86 nos macrófagos gástricas ou CD103 ^{+ DCs a partir de qualquer ratinhos não imunizados ou imunizados após a infecção. Em contraste, a incubação in vitro de H. pylori
com monócitos humanos [27], as DCs derivadas de monócitos humanos [28], [29], [30], [31], as DCs derivadas de medula óssea de murino, [33] [32], ou humano gástrico primário DC [34], induz a regulação positiva de moléculas co-estimuladoras e MHC-II. Portanto, a falta de upregulate MHC-II e CD86 nos macrófagos gástricas e CD103 + DCs em crônica H. pylori
pode ser causada por meio inflamatório e não pela bactéria per se. Com efeito, a interacção entre as DCs e H. pylori
in vitro não reflecte necessariamente o que acontece in vivo, em que o microambiente local no local de aquisição de antigénios e apresentação de antigénio, bem como o subconjunto CC envolvidos na apresentação de antigénios de H. pylori
, vai influenciar a resposta. Por exemplo, as células T reguladoras, que são predominantes na H. pylori da mucosa gástrica
infectado com [35], [36], pode prevenir a sobre-regulação de moléculas co-estimuladoras e MHC-II em DC [37]. Além disso, a IL-10 pode evitar a sobre-regulação de moléculas co-estimuladoras e MHC-II em macrófagos e células dendríticas [38].}

durante as respostas inflamatórias agudas, os macrófagos são normalmente polarizadas para M1 e exercem efeitos anti-microbianos potentes. Por exemplo, a infecção com Salmonella typhimurium
ou Listeria monocytogenes
induz M1 polarização de macrófagos, o qual é necessário para o controlo da infecção [39]. Resolução da inflamação é caracterizada por uma mudança na polarização de macrófagos para M2, que promove a cicatrização de tecido. pacientes com tuberculose exibir um aumento da produção de citoquinas de Th2, como a infecção progride [40], [41], que pode induzir a polarização dos macrófagos M2. Em ratinhos, M1 polarização de macrófagos constitui a resposta precoce à Mycobacterium tuberculosis
, enquanto os macrófagos alveolares são polarizados para M2 durante a fase tardia da infecção [42]. No entanto, a mudança na polarização de macrófagos induzido por infecções crónicas, muitas vezes resulta numa capacidade reduzida dos macrófagos para matar as bactérias invasoras [39], [43]. Por outro lado, a inflamação crónica persistente com polarização de macrófagos M1 está associada com um risco aumentado de desenvolvimento de cancro [4].

fazer macrófagos contribuem para a defesa do hospedeiro contra o H. pylori
? Ao contrário dos neutrófilos, macrófagos não são vistos com freqüência no lúmen gástrico após a translocação através do epitélio [44]. Desde H. pylori
preferencialmente residem na camada de muco gástrico ou estão associadas a células epiteliais gástricas, os macrófagos podem não entrar em contacto directo com bactérias inteiras. De facto, a depleção de macrófagos por lipossomas carregados com droga não teve efeito sobre o H. pylori
colonização [16], o que sugere que os macrófagos podem não contribuir diretamente para a defesa do hospedeiro contra o H. pylori
. Em contraste, os macrófagos podem promover a patologia gástrica. Por exemplo, a depleção mediada por lipossomas de macrófagos melhorada a gastrite induzida por H. pylori
infecção [16]. Além disso, a eliminação selectiva de I-kB β-quinase em células mielóides, o que previne a activação de NF-kB nestas células, inibiu o desenvolvimento de atrofia gástrica após H. felis
infecção [45]. Assim, os macrófagos não parecem contribuir para Helicobacter
apuramento, mas pode sim promover a patologia gástrica.

Em conclusão, este estudo mostra que a vacinação de ratinhos contra H. pylori
amplifica M1 polarização de macrófagos gástricas. Um fenómeno semelhante é visto na gastrite atrófica humana onde a mistura M1 /​​M2 polarização presente na gastrite simples é substituído por uma polarização M1-dominado. Isso pode induzir uma inflamação, e mudando a polarização de macrófagos de M1 para M2 poderia, portanto, representam um alvo terapêutico na crónica H-promoção tumor. pylori
infecção.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal governo (Göteborgs djurförsöksetiska nämnd, 328/2008 e 254 /2009). O Comité Regional ética humana de Västra Götaland County, na Suécia (706/03 e 85/06) aprovou o estudo, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Esta é a única autoridade dando permissão ética para pesquisas em seres humanos, na Suécia, e não está diretamente associado a hospitais ou universidades.

Ratos

Fêmea camundongos C57BL /6 foram adquiridos de Charles River Laboratories (Sulzfeld, Alemanha), ou, no caso das experiências de vacinação de Taconic (Ejby, Dinamarca). Camundongos foram infectados com uma idade de 8-12 semanas.

Bactérias e infecção de camundongos

H. pylori
SS1 foi cultivado em agar de Columbia ISO placas durante 2 dias a 37 ° C, após o que foram transferidos para caldo Brucella suplementado com 5% de soro fetal de vitelo (FCS) e antibióticos (Vancomicina, 10 ug /ml; polimixina B , 20 U /ml, trimetoprim, 5 ug /ml) e incubou-se agitação durante a noite a 37 ° C sob condições microaerófilas. Antes da infecção, a motilidade das bactérias foi confirmada por microscopia. A concentração de bactérias foi estimada espectrofotometricamente. Os ratinhos receberam 3 × 10 ^{8 unidades formadoras de colónias de SS1 intragastricamente.}

imunização sublingual

Os ratos receberam quatro doses de 10 ul de 500 mg H. pylori
lisado (preparada a partir da estirpe Hel305 como previamente descrito [46]) combinado com 10 ug toxina de cólera (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ), por via sublingual, a intervalos de 1 semana [47], [48]. Duas semanas após a última imunização, os ratinhos foram desafiados por via intragástrica com 3 × 10 ^{8 unidades de H formadoras de colónia. pylori
SS1.}

A avaliação da colonização bacteriana

Para a avaliação quantitativa da colonização bacteriana em experiências de imunização, uma metade do estômago foi suavemente lavadas com PBS e homogeneizadas utilizando um homogeneizador Ultra Turrax ( IKA Laboratório de Tecnologia, Staufen, Alemanha). As diluições seriadas do homogenato foram plaqueadas em placas de agar Skirrow. Quando as células da lâmina própria foram gástrica isolada a partir do estômago toda uma estimativa quantitativa da carga bacteriana gástrica não pode ser realizada. Neste caso, o estômago, a qual foi cortada ao longo da maior curvatura e lavados com PBS, foi suavemente semeadas em placas de agar Skirrow. A presença de H. pylori
colónias foi confirmada por um teste de urease. Desta forma pudemos confirmar H. pylori
colonização e ainda usar o estômago inteiro para isolamento de células.

O isolamento de células da lâmina própria gástrica

O estômago glandular foi cortado em pedaços de 5 mm e incubados um total de três vezes com H.

• PLOS ONE: Precisão e Cut-Off Valores de Pepsinogênios I, II e gastrina 17 para Diagnóstico de gástrico fúndica Atrofia: Influência da gastrite
• PLOS ONE: bacteriana Microbiota Profiling na gastrite sem Helicobacter pylori ou não-esteróides anti-inflamatórios Uso de Drogas