PLoS ONE: Enhanced M1 Macrophage Polarisatie in Human Helicobacter pylori-geassocieerde atrofische gastritis en bij gevaccineerde Mice

De abstracte

Achtergrond

Infectie met Helicobacter pylori
veroorzaakt een chronische maag- ontsteking die kunnen doorstromen naar atrofie en adenocarcinoom van de maag. Polarisatie van macrofagen is een kenmerk van zowel kanker en infecties en kan progressie of resolutie van ziekten te bevorderen. De rol van macrofagen en hun polarisatie tijdens H. pylori
besmetting is nog niet goed gedefinieerd.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Door het gebruik van een muis-model van de infectie en de maag biopten van 29 individuen, hebben we macrofagen werving en polarisatie geanalyseerd tijdens H.
pylori infectie door flowcytometrie en real-time PCR. We vonden een sequentiële rekrutering van neutrofielen, eosinofielen en macrofagen aan het maagslijmvlies van geïnfecteerde muizen. Genexpressie analyse van de maag weefsel en gesorteerd macrofagen bleek dat de maag macrofagen werden gepolariseerd om M1 na H. pylori
infectie, en dit proces is aanzienlijk versneld door voorafgaande vaccinatie. Human H.
pylori infectie gekenmerkt door een gemengde M1 /​​M2 polarisatie van macrofagen. In H.
pylori geassocieerde gastritis atrofische de expressie van induceerbare stikstofoxidesynthase is aanzienlijk toegenomen ten opzichte van ongecompliceerde gastritis, indicatief voor een verbeterd M1 macrofaag polarisatie in het premaligne laesie.

Conclusies /Belang

De resultaten tonen aan dat vaccinatie van muizen met H. pylori
versterkt M1 polarisatie van maag- macrofagen, en dat een vergelijkbare verbeterde M1 aanwezige polarisatie in humane H is. pylori
geïnduceerde atrofische gastritis

Visum:. Quiding-Järbrink M, S Raghavan, Sundquist M (2010) Enhanced M1 macrofaag Polarisatie in Human Helicobacter pylori
geassocieerde atrofische gastritis en in gevaccineerde muizen. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10.1371 /journal.pone.0015018

Editor: Niyaz Ahmed, Universiteit van Hyderabad, India

Ontvangen: 26 augustus 2010; Aanvaard: 7 oktober 2010; Gepubliceerd: 23 november 2010

Copyright: © 2010 Quiding-Järbrink et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door het centrum van uitmuntendheid MIVAC, gefinancierd door de Zweedse Stichting voor Strategische Research, de Adlerbert Research Foundation, Wilhelm & Martina Lundgren's foundation, Inga-Britt & Arne Lundberg's foundation, en de Sahlgrenska University Hospital. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Helicobacter pylori
koloniseren de maag epitheel van meer dan de helft van de wereldbevolking [1]. De ziekte vaak levenslang en veroorzaakt een chronische ontsteking van het maagslijmvlies, die ongeveer 1-2% van de geïnfecteerde individuen uiteindelijk ontwikkelt tot adenocarcinoom [1]. Ontwikkeling van maagkanker, met name de intestinale type is een meerstaps proces vordert decennialang met premaligne laesies in het maagslijmvlies, zoals atrofische gastritis, intestinale metaplasie en dysplasie [2]. Het verloop van de infectie hangt af van de virulentie van het infecterende H.
pylori stam, omgevingsfactoren zoals roken en voeding, en gastheer genetische factoren die de aard en de intensiteit van de ontstekingsreactie beïnvloeden [1].

Een sterke pro-inflammatoire respons is geassocieerd met een verhoogde reactieve zuurstof en stikstof soorten in het maagslijmvlies [3], die de ontwikkeling van kanker kunnen bevorderen [4]. Bijvoorbeeld, muizen geïnfecteerd met H. pylori
zes maanden hebben een verhoogde frequentie van maag-mutaties in vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen [5]. Bovendien muizen die deficiënt zijn voor het enzym induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS) zijn een verminderde incidentie van maagkanker na H. pylori
infectie en kankerverwekkend uitdaging in vergelijking met normale muizen [6]. Terwijl iNOS bijdraagt ​​tot de ontwikkeling van maagkanker, wordt een hoog niveau van de chemokine CCL18 gastrische tumoren geassocieerd met verlengde overleving van maag- kankerpatiënten [7]. Interessant, iNOS wordt geproduceerd door klassiek geactiveerde /M1 macrofagen, terwijl CCL18 productie is een keurmerk voor alternatief geactiveerde /M2 macrofagen [8]. Samengenomen suggereren deze bevindingen dat macrofaag polarisatie een belangrijke rol in de ontwikkeling van H kan hebben. pylori
geassocieerde maagkanker.

M1 macrofagen nemen meestal deel aan de initiële immuunrespons tegen binnendringende micro-organismen en het bevorderen van T-helper (Th) 1 immuniteit, terwijl M2 macrofagen geïnduceerd worden tijdens de resolutie fase van ontsteking en zijn betrokken bij puin scavenging, weefsel remodellering, en bevordering van Th2 immuniteit [8], [9]. Polarisatie van macrofagen wordt geleid door de micro. M1 macrofagen geïnduceerd door interferon-γ en microbiële producten zoals lipopolysaccharide [9]. Anderzijds worden M2 macrofagen geïnduceerd door Th2- of anti-inflammatoire cytokines en groeifactoren, zoals IL-4, IL-10 en transformerende groeifactor-β [8], [9].

Tijdens H.
pylori infectie, zijn macrofagen aangeworven om het maagslijmvlies, waar ze bijdragen aan de productie van pro-inflammatoire cytokines en chemokines [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Bovendien, een recente studie toonde aan dat liposoom-gemedieerde depletie van macrofagen verminderde maagproblemen van H. pylori
geïnfecteerde muizen [16]. Desondanks hebben de functie van macrofagen tijdens in vivo H. pylori
infectie blijft relatief slecht gedefinieerd. De functie van macrofagen is nauw verbonden met de polarisatietoestand, dat eveneens een rol in de ontwikkeling van maagkanker [6] hebben, [7]. Daarom hebben we macrofaag polarisatie onderzocht in het maagslijmvlies van H. pylori
geïnfecteerde muizen en mensen. We tonen aan dat vaccinatie van muizen met H. pylori
snelheden en versterkt M1 polarisatie van maag macrofagen. Bovendien wordt de precancereuze laesie atrofische gastritis gekenmerkt door een verhoogde macrofaag M1 polarisatie bij mensen.

Resultaten

vaker macrofagen, eosinofielen en neutrofielen in het maagslijmvlies na H. pylori
infectie

De werving van aangeboren cellen naar de plaats van de infectie is een voorwaarde voor infectieziektebestrijding. Niet alleen kunnen cellen, zoals macrofagen en neutrofielen aangeboren, deelnemen bacteriedodende; zij produceren ook inflammatoire mediatoren, die het decor voor de daaropvolgende immuunreactie. Om de ophoping van aangeboren cellen in het maagslijmvlies bij H onderzoeken. pylori
, geïnfecteerde we C57BL /6 muizen met de muis-aangepaste H. pylori
Sydney stam 1 (SS1), en na vier, acht en 26 weken analyseerden we de maag ontstekingsinfiltraat van individuele muizen door multi-color flowcytometrie. Het totale aantal lamina propria cellen geïsoleerd uit de maag niet veranderde gedurende de eerste vier weken van de infectie, maar acht weken na infectie het totale aantal cellen geïsoleerd verdubbeld, en bij 26 weken van infectie was er een achtvoudige toename het totale aantal cellen die in vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen (Fig. 1A). Onder de cellen die worden aangeworven om de maag waren macrofagen, eosinofielen en neutrofielen. Gastric macrofagen werden geïdentificeerd als cellen die CD11b en belangrijke histocompatibiliteit complex klasse II (MHC-II), maar zonder de expressie van Gr1 (neutrofielen marker), CD103 (uitgedrukt in een subset van dendritische cellen (DC)) en siaalzuurbindende immunoglobulin- zoals lectine (Siglec-F, eosinofiel marker) (Fig. 1B). Deze cellen brachten het macrofaag marker F4 /80 (Fig. 1E), en op basis van celmorfologie werden bevestigd als macrofagen (fig. 1B). De frequentie van macrofagen in het maagslijmvlies bleef onveranderd na vier en acht weken H. pylori
infectie (Fig. 1F). Echter, na 26 weken de frequentie van maag macrofagen verhoogd vergeleken met niet- geïnfecteerde muizen (Fig. 1F).

Eosinofielen werden gedefinieerd als CD11b ^{+ Siglec-F + cellen (fig. 1C, [17]). Deze cellen brachten tussenniveaus van F4 /80 en had een hoge zijwaartse verstrooiing profiel gebeuren door stroomcytometrie geanalyseerd (fig. 1E). Cresylviolet kleuring van naargelang CD11b + Siglec-F + cellen bevestigd eosinofielen morfologie (Fig. 1C). De frequentie van eosinofielen in het maagslijmvlies werd verdubbeld na acht weken en verder verhoogd na 26 weken van de infectie (fig. 1F).}

Neutrofielen werden gedefinieerd als CD11b ^{+ Gr1 + cellen (Fig . 1D). Aangezien de Gr1 antilichaam herkent zowel de Ly6C en Ly6G epitoop we bevestigd dat alle CD 11 + Gr1 + cellen brachten de specifieke neutrofiel marker Ly6G (fig. 1D en E). De frequentie van neutrofielen verhoogd 10-voudig acht weken na infectie en werd verder verhoogd na 26 weken (Fig. 1F). Zo werden, tijdens H. pylori
infectie is er een sequentiële accumulatie van neutrofielen en eosinofielen, gevolgd door macrofagen in de maag lamina propria.}

Analyse van de maag DCs

Om de maag DCs te karakteriseren, hebben we voor het eerst geïdentificeerd een populatie van CD11c ^{+ MHC-II + cellen (Fig. 2A). Wanneer deze cellen werden verder geanalyseerd op expressie van F4 /80 en αE integrine keten CD103, de helft van de CD11c + MHC-II + cellen werden geïdentificeerd als F4 /80 + macrofagen (Fig. 2A ). Echter, onder de CD11c + MHC-II + cellen die de expressie van F4 /80 ontbrak, twee populaties van vermeende DCs met differentiële expressie van CD103 kunnen worden onderscheiden (figuur 2A.). Vanwege de vele fluorochromen vereiste we besloten enkel karakteriseren de maag CD103 +
DCs verder, aangezien deze cellen zijn geïmpliceerd als belangrijke antigeenpresenterende cellen in mucosale weefsels [18]. Gastric CD103 + DC werden gemakkelijk geïdentificeerd door kleuring voor CD11c en CD103 (Fig. 2B). De gastrische CD103 + DCs brachten hoge niveaus van MHC-II, en bestond uit een CD11b laag en een CD11b hoog deel (fig. 2C). Ter vergelijking: de maag CD103 - DCs waren allemaal CD11b hoog (figuur 2D.). Bovendien, de CD103 + DCs ontbrak expressie van CD8a en F4 /80 (Fig. 2C). De frequentie van CD103 + DCs veranderden niet significant in het maagslijmvlies na infectie (Fig. 2E).}

Maag macrofagen en CD103 + DCs nalaten costimulerende moleculen opwaarts reguleren na H. pylori
infectie

Met het oog op de mogelijke effecten van H onderzoeken.
pylori besmetting van de expressie van costimulerende moleculen en MHC-II maag macrofagen en CD103 ^{+ DCs, de expressie van deze merkers werd geanalyseerd door stromingscytometrie na vier, acht en 26 weken van de infectie. In de steady state, macrofagen en CD103 + DCs in de maag lamina propria uitgedrukt vergelijkbare concentratie van de co-stimulerende molecuul CD86 evenals MHC-II (Fig. 3A). Verrassend genoeg werd de expressie van CD86 en MHC-II door een maag-macrofagen of CD103 + DC niet verhoogd na infectie met H. pylori
ten opzichte van leeftijd gematchte naïeve muizen in parallel (fig. 3B) geanalyseerd. Zo macrofagen en CD103 + DCs in de maag lamina propria niet aan CD86 en MHC-II na H upregulate. pylori
infectie, ondanks de aanhoudende ontstekingsreactie.}

M1 polarisatie van de maag macrofagen tijdens de H. pylori
infectie

Sinds onze resultaten suggereerden dat de maag macrofagen niet volledig kan worden geactiveerd tijdens H. pylori
infectie, we gekenmerkt deze cellen verder door het onderzoeken van hun M1 /​​M2 polarisatie. Om macrofaag polarisatie tijdens de H te bepalen.
pylori infectie, gebruikten we real-time PCR om de expressie van genen geassocieerd met M1 of M2 polarisatie van macrofagen in de gastrische weefsels te meten [8], [9]. Maten we ook de expressie van IL-10, kunnen worden vervaardigd door regelgevende macrofagen [9]. Geen van de geanalyseerde markers waren differentieel tot expressie vier weken na de H.
pylori infectie opzichte van naïeve muizen (Fig. 4A). Bij acht weken na infectie de expressie van het iNOS markers M1 en CXCL11 aanzienlijk verhoogd, en deze markers werden verder opgereguleerd bij 26 weken van de infectie (fig. 4A). Daarnaast is de expressie van IL-10 werd opgereguleerd op acht en 26 weken van infectie ten opzichte van naïeve muizen (Fig. 4A). In tegenstelling, de M2 ​​merkers in inflammatoire zone 1 (FIZZ1) en arginase-1 niet differentieel tot expressie gebracht in de maag op vier, acht of 26 weken van infectie vergeleken met naïeve muizen (Fig. 4A).

naar de bron van iNOS en CXCL11 identificeren in het maagslijmvlies, macrofagen (CD11b ^{+ Gr1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinofielen (CD11b + Gr1 -Siglec-F + MHC-II -) en de resterende cellen na gating uit macrofagen en eosinofielen (CD11b - en CD11b + Gr1 +) werden gesorteerd van samengevoegd maag lamina propria cellen van muizen geïnfecteerd met H. pylori
gedurende 26 weken (Fig. 4B). De mRNA-expressie van iNOS en CXCL11 in gesorteerde celpopulaties van geïnfecteerde muizen en in totaal maag lamina propria cellen van zowel naïeve en geïnfecteerde muizen werd vervolgens bepaald door real-time PCR. Een voldoende aantal gesorteerde macrofagen kon niet worden verkregen van naïeve muizen voor een betrouwbare analyse van mRNA expressie. Gastric macrofagen tot expressie het hoogste iNOS en CXCL11 vergelijking met de andere gesorteerde celpopulaties en totale maag lamina propria cellen vóór sortering (Fig. 4C). Samengenomen tonen deze resultaten dat gastrische macrofagen gepolariseerde M1 tijdens H. pylori
infectie.}

Vaccinatie tegen H. pylori
Versterkt macrofaag M1 polarisatie

Beschermende immunisatie tegen H. pylori
het algemeen samen met de snelle ontwikkeling van een maag- Th1 respons [19]. Omdat de Th1 cytokine interferon-γ induceert macrofaag M1 polarisatie [9], we onderzocht of vaccinatie macrofaag polarisatie tijdens de H zou kunnen beïnvloeden. pylori
infectie. Hiervoor werden muizen geïmmuniseerd met sublinguaal H. pylori
lysaat en cholera toxine adjuvant, en vervolgens uitgedaagd met H. pylori
SS1. Deze immunisatieregime leidde tot een significante vermindering van bacteriële verontreiniging in de maag vier weken na challenge (Fig. 5A). Tegelijkertijd de expressie van markers M1 en M2 in de maag werd geanalyseerd door real-time PCR. In geïmmuniseerde muizen werd alleen de expressie van CXCL11 aanzienlijk opgereguleerd vier weken na infectie vergeleken met naïeve muizen (Fig. 5B). Daarentegen geïmmuniseerde muizen een grote opregulatie van beide markers M1 iNOS en CXCL11 dat de expressie van de markers M2 FIZZ1 en arginase-1 werd niet veranderd, vier weken na challenge (Fig. 5B). De verhoogde expressie van iNOS en CXCL11 bij geïmmuniseerde /uitgedaagd muizen was niet te wijten aan de immunisatie alleen omdat geïmmuniseerde maar niet uitgedaagd muizen werden de expressie van elk van de geanalyseerde M1 of M2 merkers vergeleken volledig onbehandelde muizen niet veranderen (gegevens niet getoond ).

Verder analyseerden we de frequentie van macrofagen in het maagslijmvlies van geïmmuniseerde muizen en uitgedaagd door flowcytometrie. Ten opzichte van geïnfecteerde alleen muizen geïmmuniseerde muizen hadden een significant verhoogde frequentie van maag macrofagen drie weken na challenge (fig. 5C). Ondanks dat macrofagen werden aangeworven om het maagslijmvlies van geïmmuniseerde muizen uitgedaagd en de macrofagen niet de expressie van CD86 en MHC-II ten opzichte van geïnfecteerde alleen muizen (Fig. 5D) reguleert. Deze resultaten tonen aan dat na een succesvolle vaccinatie met H. pylori
lysaat en cholera toxine, macrofagen ophopen in het maagslijmvlies en worden snel gepolariseerd om M1 na infectie.

Augmentation van macrofagen M1 polarisatie in de menselijke atrofische gastritis

Vervolgens onderzochten we de rol van H.
pylori infectie en atrofische gastritis voor macrofaag polarisatie in het menselijke maagslijmvlies. Daartoe de expressie van humaan M1 (iNOS, CXCL11) en M2 merkers (CCL17, CCL18, CD206) werd gemeten in biopten van antrum door real-time PCR. H.
pylori geïnfecteerde individuen met ongecompliceerde gastritis een significant verhoogde expressie van mRNA voor zowel M1 (iNOS, 8-voudig, CXCL11, 20-voudig) en M2 merkers (CCL17, 30-voudig, CCL18, 70-voudig, CD206 , 2-voudig) vergeleken met niet-geïnfecteerde vrijwilligers (fig. 6A). De personen met atrofische gastritis (4/6 had intestinale metaplasie naast atrofie) expressie nog hogere iNOS mRNA in vergelijking met die met ongecompliceerde gastritis (20-voudig), terwijl CXCL11 en markers van M2 polarisatie vergelijkbare werden uitgedrukt (Fig. 6A). Inderdaad, de expressie van iNOS werd 180-voudig verhoogd bij patiënten met atrofische gastritis vergelijking met niet-geïnfecteerde controles (fig. 6A), wijst op een verhoogde M1 polarisatie van maag macrofagen bij patiënten met atrofische gastritis.

Om te onderzoeken of de verhoogde mRNA expressie van M1 en M2 merkers vertaalt zich ook in verhoogde eiwitniveaus werden totaal proteïnen geëxtraheerd uit antrale biopsie specimens en de concentratie van iNOS en CCL18 werd bepaald door ELISA. Maag-biopten van personen met atrofische gastritis was alleen beschikbaar voor eiwit-extractie van de ene vrijwilliger, die differentieel in figuur 6B is aangegeven. De helft van de H.
pylori geïnfecteerde individuen detecteerbare niveaus van iNOS-eiwit in het antrum terwijl de concentratie van iNOS was beneden de detectiegrens in alle geïnfecteerde individuen (Fig. 6B). De expressie van iNOS mRNA en iNOS-eiwit was significant gecorreleerd (R ^{2 = 0,88, P
< 0,01) dat de mRNA analyse weerspiegelt eiwitexpressie, zelfs wanneer de eiwitten laag zijn. De concentratie van de merker M2 CCL18 werd verhoogd in de maag weefsel van H.
pylori geïnfecteerde individuen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles (Fig. 6B). Bovendien was de concentratie van CCL18 eiwit significant gecorreleerd met de expressie van mRNA CCL18 (R 2 = 0,754, P
< 0,01).}

Samengevat, deze bevindingen geven de aanwezigheid van zowel M1 en M2 macrofagen in het maagslijmvlies van H. pylori
geïnfecteerde individuen. Verder wordt atrofische gastritis geassocieerd met een sterke amplificatie van iNOS-expressie in het maagslijmvlies, wijst op een verhoogde M1 polarisatie van macrofagen.

Discussie

In deze studie hebben we de polarisatie van gastrische onderzocht macrofagen tijdens chronische H. pylori
infectie. We tonen aan dat H.
pylori geïnfecteerde individuen uitdrukken mRNA in het maagslijmvlies wijzen op een gemengde M1 /​​M2 polarisatie van macrofagen, en dit werd bevestigd op eiwitniveau. In H.
pylori geïnduceerde atrofische gastritis was er een duidelijke verhoging in de expressie van iNOS in vergelijking met ongecompliceerde gastritis. Atrofische gastritis geeft een verhoogd risico op maagkanker opzichte van ongecompliceerde H. pylori
geassocieerde gastritis [20]. De verhoogde expressie van iNOS in atrofische gastritis kan bijdragen aan maagsappen kankerontwikkeling via productie van reactieve stikstof species, die kankerverwekkend kunnen bevorderen door het induceren van DNA-schade, ontwrichting van DNA herstel, post-translationele modificatie van eiwitten en p53 mutaties [4]. Inderdaad, iNOS-deficiënte muizen hebben een verminderde incidentie van adenocarcinoom van de maag na de H.
pylori infectie en uitdaging met een chemische carcinogeen vergelijking met normale muizen [6]. Ook polymorfismen in het promotorgebied van iNOS, wat leidt tot een hogere transcriptie activiteit correleert met een hogere incidentie van de intestinale type maagkanker bij Japanse vrouwen [21].

In tegenstelling tot humane H .
pylori infectie, SS1 geïnfecteerde C57BL /6 muizen een genexpressieprofiel in het maagslijmvlies indicatief M1 macrofaag polarisatie. Genexpressieanalyse van gesorteerde macrofagen geïsoleerd uit het maagslijmvlies van geïnfecteerde muizen bevestigde dat expressie van de markers M1 iNOS en CXCL11 verrijkt in de gesorteerde populatie macrofaag. Bovendien werd de M1 polarisatie van maag macrofagen aanzienlijk versneld door eerdere vaccinatie. Reeds vier weken na prikkeling, geïmmuniseerde muizen opgereguleerd expressie van iNOS en CXCL11 een vergelijkbaar niveau als waargenomen na 26 weken in geïnfecteerde muizen alleen. Studies van iNOS-deficiënte muizen hebben aangetoond dat iNOS de ontwikkeling bevordert van atrofie en kanker in het maagslijmvlies bij
Helicobacter-infectie [6], [22]. Bovendien is de goedkeuring van de H. pylori
na vaccinatie plaatsvindt onafhankelijk van iNOS [23]. Aldus iNOS lijkt bij te dragen aan pathologie plaats bescherming systeem tijdens infectie met H. pylori
. Als dus de verhoogde productie van iNOS in het maagslijmvlies wordt gehandhaafd na vaccinatie, kan een ongewenst neveneffect dat de ernst van H kan vergroten zijn. pylori
geïnduceerde ontsteking en kwaadaardigheid, tenzij steriel immuniteit wordt bereikt. De relatieve bijdrage van iNOS pathologie versus gastheer bescherming tijdens de verschillende stadia van H.
pylori infectie rechtvaardigt verder onderzoek.

We observeerden een sequentiële rekrutering van aangeboren cellen aan het maagslijmvlies van SS1-geïnfecteerde muizen met de macrofagen relatief laat accumuleren tijdens infectie (26 weken). In tegenstelling, de frequenties van maag neutrofielen en eosinofielen in het maagslijmvlies toegenomen acht weken na infectie en bleef verhoogd op 26 weken. De accumulatie van macrofagen trad sneller in gevaccineerde muizen, waarbij de frequentie van maag macrofagen reeds drie weken na prikkeling werd verhoogd. Eerder hebben neutrofielen is aangetoond dat aangeworven om het maagslijmvlies van SS1-geïnfecteerde muizen in twee fasen, een vroege fase piek 1-2 dagen na infectie en een late fase vanaf 2-3 weken na infectie [24]. Een recruitment patroon vergelijkbaar met dat van neutrofielen, werd ook beschreven voor maag macrofagen [24]. Echter werden de macrofagen gedefinieerd als CD11b ^{+ Gr1 - cellen [24], een celpopulatie die in onze handen voornamelijk uit eosinofielen (zie figuur 1 en 2.). Asim et al. gedefinieerd macrofagen als CD11b + F4 /80 + cellen, en waargenomen een vroege piek in macrofagen nummer in het maagslijmvlies 1-2 dagen na infectie met H. pylori
[15]. Bovendien werd het aantal macrofagen weer toe bij 60 en 120 dagen na infectie opzichte van naïeve muizen [15]. We breiden deze resultaten door te laten zien dat de aanwerving van deze aangeboren celpopulaties wordt gehandhaafd tot 26 weken na de infectie. Daarnaast beschrijven we de accumulatie van eosinofielen in het maagslijmvlies, een celpopulatie die veruit overtreffen de gastrische macrofagen en neutrofielen (Fig. 1). Inderdaad, de rol van eosinofielen in H. pylori
geïnduceerde gastritis moet verder worden onderzocht. Eosinofielen en macrofagen aandeel expressie van verschillende merkers, waaronder CD11b en F4 /80 (fig. 1, [25]). Daarom moeten meerdere markers gelijktijdig worden geanalyseerd om deze aangeboren celpopulaties onderscheiden.}

We konden twee populaties van DC's identificeren de maagslijmvlies muizen. Beide subgroepen brachten hoge niveaus van CD11c en MHC-II, ontbrak expressie van de macrofaag marker F4 /80, maar verschilden met betrekking tot expressie van CD103. De frequentie van de maag CD103 ^{+ DC veranderde niet na vier, acht of 26 weken van de H. pylori
infectie. In tegenstelling tot onze studie, een recente studie van Kao et al. kon niet detecteren CD103 + DCs in het maagslijmvlies van geïnfecteerde muizen [26]. Integendeel, de CD103 + DCs ontstaan ​​24 uur na H. pylori
infectie. Aangezien de analysetijdstippen verschillen tussen deze studie en onze experimenten, is het moeilijk om direct de resultaten te vergelijken.}

Desondanks M1 macrofagen typisch reguleert MHC-II en costimulerende moleculen konden geen verhoogde expressie van MHC detecteren -II of CD86 op de maag macrofagen of CD103 ^{+ DCs van zowel geïmmuniseerde of geïmmuniseerde muizen na infectie. Daarentegen, in vitro incubatie van H. pylori hotels met menselijke monocyten [27], humaan monocyt afgeleide DCs [28], [29], [30], [31], muizen beenmerg afgeleide DCs [32], [33] of humane primaire maag DCs [34], induceert verhoogde expressie van costimulerende moleculen en MHC-II. Daarom is het ontbreken van MHC-II en CD86 upregulate op de maag macrofagen en CD103 + DCs in chronische H.
pylori infectie kan worden veroorzaakt door inflammatoire milieu en niet door de bacteriën op zichzelf. Inderdaad, de interactie tussen DC en H. pylori
in vitro niet noodzakelijk overeen met wat in vivo, waar de lokale micro-omgeving op de plaats van antigen-acquisitie antigeenpresentatie en de DC deelverzameling betrokken bij antigeenpresentatie van H. pylori
, zal de reactie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, regulatoire T-cellen, die heersen in de H zijn. pylori
geïnfecteerde maagslijmvlies [35], [36], kan de opregulatie van co-stimulerende moleculen en MHC-II te voorkomen op DCs [37]. Bovendien kan IL-10 de opwaartse regulatie van costimulerende moleculen en MHC-II op macrofagen en DC [38] te voorkomen.}

Tijdens acute ontstekingsreacties, macrofagen typisch gepolariseerde M1 en krachtige antimicrobiële effecten uitoefenen. Bijvoorbeeld infectie met Salmonella typhimurium
of Listeria monocytogenes
induceert M1 polarisatie van macrofagen, die nodig is voor de controle van de infectie [39]. Resolutie van ontsteking wordt gekenmerkt door een verschuiving in macrofaag polarisatie M2, die weefselgenezing bevordert. Tuberculose patiënten vertonen een verhoogde productie van Th2 cytokinen de infectie voortschrijdt [40], [41], waarin M2 polarisatie van macrofagen kan veroorzaken. Bij muizen, M1 polarisatie van macrofagen vormt het begin van de reactie op de Mycobacterium tuberculosis
, terwijl alveolaire macrofagen zijn gepolariseerd om M2 tijdens de late fase-infectie [42]. De verschuiving in macrofaag polarisatie veroorzaakt door chronische infecties leidt vaak tot een verminderde capaciteit van de macrofagen aan de binnendringende bacteriën [39], [43] doden. Anderzijds, wordt chronische ontsteking met hardnekkige M1 macrofaag polarisatie geassocieerd met een verhoogd risico op kankerontwikkeling [4].

doen macrofagen dragen aan verdediging tegen H gastheer. pylori
? Unlike neutrofielen, macrofagen zijn die tegenkomt in de gastrische lumen na translocatie over het epitheel [44]. Aangezien H. pylori
voorkeur bevinden in het maagslijmvlies laag of zijn bevestigd aan maagepitheelcellen kunnen macrofagen niet in direct contact met hele bacteriën. Inderdaad, depletie van macrofagen van met geneesmiddel beladen liposomen hadden geen effect op H. pylori
kolonisatie [16], wat suggereert dat macrofagen kan niet direct bijdragen aan de verdediging tegen H hosten. pylori
. Daarentegen kunnen macrofagen maagpathologie promoten. Bijvoorbeeld, liposomen gemedieerde depletie van macrofagen verbeterd de gastritis geïnduceerd door H. pylori
infectie [16]. Bovendien selectieve deletie van I-KB-kinase β in myeloïde cellen, die de activering van NF-KB voorkomt in deze cellen, remde de ontwikkeling van maagatrofie na H. felis
infectie [45]. Zo hoeft macrofagen niet lijken bij te dragen aan Helicobacter
speling, maar kan eerder te bevorderen maag pathologie.

Tot slot, deze studie toont aan dat vaccinatie van muizen tegen de H. pylori
versterkt M1 polarisatie van de maag macrofagen. Een vergelijkbaar fenomeen wordt waargenomen in humane atrofische gastritis waarbij de gemengde M1 /​​M2 aanwezige polarisatie in ongecompliceerde gastritis wordt vervangen door een M1 gedomineerde polarisatie. Dit kan leiden tot een tumor-bevordering van ontsteking, en het verschuiven macrofaag polarisatie van M1 tot M2 zou daarom een ​​therapeutisch doel bij chronische H. pylori
infectie.

Materialen en methoden

Ethics statement

Het onderzoek werd goedgekeurd door de regering dier ethische commissie (Göteborgs djurförsöksetiska nämnd, 328/2008 en 254 /2009). De regionale menselijke ethische commissie van de provincie Västra Götaland in Zweden (706/03 en 85/06) ingestemd met de studie, en schriftelijke toestemming werd verkregen van alle deelnemers. Dit is de enige autoriteit die ethische toestemming voor onderzoek op mensen in Zweden, en het is niet rechtstreeks verbonden aan ziekenhuizen en universiteiten.

Mice

Vrouw C57BL /6-muizen werden gekocht van Charles River Laboratories (Sulzfeld, Duitsland), of in het geval van de vaccinatie-experimenten van Taconic (Ejby, Denemarken). Muizen werden geïnfecteerd op een leeftijd van 8-12 weken.

Bacteriën en infectie van muizen

H. pylori
SS1 werd gegroeid op Columbia ISO agarplaten gedurende 2 dagen bij 37 ° C, waarna zij werden overgebracht naar Brucella bouillon aangevuld met 5% foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (Vancomycine, 10 ug /ml; polymyxine B , 20 U /ml, trimethoprim, 5 ug /ml) en geïncubeerd schudden overnacht bij 37 ° C onder microaërofiele omstandigheden. Vóór infectie, de motiliteit van de bacteriën werd bevestigd door microscopie. De concentratie bacteriën werd spectrofotometrisch geschat. Muizen ontvingen 3 x 10 ^{8 kolonievormende eenheden SS1 intragastrisch.}

sublinguaal immunisatie

De muizen kregen vier 10 gl doses van 500 ug H. pylori
lysaat (bereid uit stam Hel305 zoals eerder beschreven [46]) gecombineerd met 10 ug choleratoxine (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ) sublinguaal 1 week ertussen [47], [48]. Twee weken na de laatste immunisatie werden de muizen geprikkeld met intragastrisch 3 x 10 ^{8 kolonievormende eenheden van H. pylori
SS1.}

Evaluatie van bacteriële kolonisatie

Voor kwantitatieve beoordeling van bacteriële kolonisatie in immunisatie experimenten, de helft van de maag werd voorzichtig gewassen met PBS en gehomogeniseerd met een Ultra Turrax homogenisator ( IKA Laboratorium Technologie, Staufen, Duitsland). Seriële verdunningen van het homogenaat werden geplaat op agarplaten Skirrow. Wanneer maag lamina propria cellen werden geïsoleerd uit de hele maag een kwantitatieve schatting van de maag bacteriële verontreiniging kan niet worden uitgevoerd. In dit geval werd de maag, die langs de grote curvatuur werd gesneden en gewassen in PBS, zacht uitgestreken op agarplaten Skirrow. De aanwezigheid van H. pylori
kolonies werd bevestigd door een ureasetest. Op deze manier kunnen we bevestigen H. H.

• PLoS ONE: Nauwkeurigheid en afkappunten van Pepsinogens I, II en Gastrine 17 voor de diagnose van Gastric fundic Atrofie: Invloed van gastritis
• PLoS ONE: Bacteriële Microbiota Profiling in gastritis zonder Helicobacter pylori infectie of niet-steroïdale anti-inflammatoire drugsgebruik