PLOS ONE: Enhanced M1 macrófago humano polarización en Helicobacter pylori asociada a gastritis atrófica y en Vacunados Mice

Extracto

Antecedentes

La infección por Helicobacter pylori
desencadena una gástrica crónica la inflamación que puede progresar a la atrofia y adenocarcinoma gástrico. La polarización de los macrófagos es una característica de tanto el cáncer y la infección, y puede promover la progresión o la resolución de la enfermedad. Sin embargo, la función de los macrófagos y su polarización durante H. pylori
infección no ha sido bien definida.

Metodología /Principales conclusiones

Mediante el uso de un modelo de ratón de infección y biopsias gástricas de 29 individuos, hemos analizado el reclutamiento de macrófagos y la polarización durante H. pylori
infección por citometría de flujo y la PCR en tiempo real. Encontramos un reclutamiento secuencial de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos a la mucosa gástrica de los ratones infectados. La expresión de genes de tejido del estómago y de los macrófagos según reveló que los macrófagos gástricos se polarizaron a M1 después de H. pylori
infección, y este proceso se aceleró sustancialmente por la vacunación previa. Humana H. pylori
infección se caracteriza por una polarización mixta M1 /​​M2 de los macrófagos. Sin embargo, en H. pylori
gastritis atrófica -asociado, la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible fue marcadamente aumentó en comparación con la gastritis no complicada, indicativo de un aumento de la polarización de los macrófagos M1 en esta lesión pre-maligna.

Conclusiones /Importancia

Estos resultados muestran que la vacunación de ratones contra H. pylori
amplifica M1 polarización de macrófagos gástricos, y que una mejorada polarización similares M1 está presente en H humana. pylori
gastritis atrófica inducida

Visto:. Quiding-Järbrink M, S Raghavan, Sundquist M (2010) Enhanced M1 macrófago humano polarización en Helicobacter pylori
-asociado gastritis atrófica y en Los ratones vacunados. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10.1371 /journal.pone.0015018

Editor: Niyaz Ahmed, Universidad de Hyderabad, India

Recibido: 26 Agosto, 2010; Aceptado: 7 Octubre de 2010; Publicado: 23 Noviembre 2010

Derechos de Autor © 2010 Quiding-Järbrink et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por el centro de miVac excelencia, financiado por la Fundación sueca para la Investigación estratégica, la Fundación de Investigación Adlerbert, Wilhelm & La fundación de Martina Lundgren, Inga-Britt & La fundación de Arne Lundberg, y el Hospital Universitario de Sahlgrenska. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Helicobacter pylori
colonizar el epitelio estomacal de más de la mitad de la población mundial [1]. La infección suele ser de por vida y provoca una inflamación crónica de la mucosa gástrica, que en aproximadamente el 1-2% de las personas infectadas con el tiempo se convierte en el adenocarcinoma gástrico [1]. Desarrollo de cáncer gástrico, en particular el tipo intestinal, es un proceso de múltiples pasos que avanza durante décadas a través de lesiones premalignas en la mucosa gástrica, tales como gastritis atrófica, la metaplasia intestinal y displasia [2]. El resultado de la infección depende de la virulencia de la infectar H. pylori
tensión, factores ambientales como el tabaquismo y la dieta, y el anfitrión de los factores genéticos que influyen en el tipo y la intensidad de la respuesta inflamatoria [1].

Una respuesta proinflamatoria fuerte se asocia con mayores niveles de de oxígeno y nitrógeno especies reactivas en la mucosa gástrica [3], que pueden promover el desarrollo del cáncer [4]. Por ejemplo, los ratones infectados con H. pylori Opiniones de seis meses, tienen una mayor frecuencia de mutaciones gástrico en comparación con los ratones no infectados [5]. Además, los ratones que son deficientes para la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) tienen una menor incidencia de cáncer gástrico después de H. infección y carcinógeno pylori
desafío en comparación con los ratones normales [6]. Mientras que la iNOS contribuye al desarrollo de cáncer gástrico, un alto nivel de la quimiocina CCL18 en tumores gástricos se asocia con una supervivencia prolongada de los pacientes con cáncer gástrico [7]. Curiosamente, la iNOS es producida por macrófagos activados clásicamente /M1, mientras que la producción de CCL18 es un sello distintivo de los macrófagos activados alternativamente /m2 [8]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la polarización de los macrófagos puede tener un papel importante en el desarrollo de H. pylori
cáncer gástrico -asociado.

macrófagos M1 normalmente participan en la respuesta inmune inicial a los microorganismos invasores y la promoción de T helper (Th) 1 inmunidad, mientras que los macrófagos M2 son inducidos durante la fase de resolución de la inflamación y están implicados en los basureros escombros, la remodelación de tejidos, y la promoción de la inmunidad Th2 [8], [9]. La polarización de los macrófagos está dirigida por el microambiente. macrófagos M1 son inducidos por interferón-gamma y microbianas productos tales como lipopolisacárido [9]. Por otro lado, los macrófagos M2 son inducidas por Th2 o citocinas antiinflamatorias y factores de crecimiento, incluyendo IL-4, IL-10 y factor de crecimiento transformante β [8], [9].

Durante H. pylori
infección, los macrófagos son reclutados a la mucosa gástrica, donde contribuyen a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Además, un estudio reciente mostró que el agotamiento mediada por liposomas de los macrófagos reduce la patología gástrica en H. pylori
ratones infectados [16]. A pesar de esto, la función de los macrófagos en vivo H en. pylori
infección sigue siendo relativamente mal definido. La función de los macrófagos está acoplada íntimamente a su estado de polarización, que también parece tener un papel en el desarrollo de cáncer gástrico [6], [7]. Por lo tanto, hemos examinado la polarización de los macrófagos en la mucosa gástrica de H. pylori
ratones y seres humanos infectados. Se demuestra que la vacunación de los ratones contra la H. pylori
velocidades y amplifica M1 polarización de macrófagos gástricos. Además, la gastritis atrófica lesión pre-cancerosa se caracteriza por un macrófago M1 polarización mejorada en seres humanos.

Resultados

Aumento de la frecuencia de los macrófagos, eosinófilos y neutrófilos en la mucosa gástrica después de MARIDO. pylori

El reclutamiento de células innatas al sitio de la infección es un requisito previo para el control infeccioso. No sólo puede innatas células, tales como macrófagos y neutrófilos, participar en la destrucción bacteriana; también producen mediadores inflamatorios, que establecen el escenario para la respuesta inmune subsiguiente. Para investigar la acumulación de células innatas en la mucosa gástrica durante la H. pylori
la infección, se infectaron ratones C57BL /6 con el H adaptada a ratón. sydney pylori cepa 1 (SS1), y después de cuatro, ocho y 26 semanas que analizó el infiltrado inflamatorio gástrico de los ratones individuales por múltiples colores citometría de flujo. El número total de células de la lámina propia aisladas desde el estómago no cambió durante las primeras cuatro semanas de infección, pero a las ocho semanas después de la infección se duplicó el número total de células aisladas, y a las 26 semanas de la infección había un aumento de ocho veces en el número total de células aisladas en comparación con ratones no infectados (Fig. 1A). Entre las células que están siendo reclutados para el estómago eran macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. macrófagos gástricos se identificaron como células que expresan CD11b y complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC-II), pero que carecen de expresión de Gr1 (marcador de neutrófilos), CD103 (expresado por un subconjunto de células dendríticas (DCs)) y de unión a ácido siálico immunoglobulin- como lectina (Siglec-M, marcador de eosinófilos) (fig. 1B). Estas células expresan el marcador macrófago F4 /80 (Fig. 1E), y sobre la base de la morfología celular se confirmaron como macrófagos (Fig. 1B). La frecuencia de los macrófagos en la mucosa gástrica se mantuvo sin cambios después de cuatro y ocho semanas de H. pylori
infección (Fig. 1F). Sin embargo, después de 26 semanas, la frecuencia de los macrófagos gástrico aumentó en comparación con los ratones no infectados (Fig. 1F).

Los eosinófilos se definen como CD11b ^{+ Siglec-F + células (Fig. 1C, [17]). Estas células expresaron niveles intermedios de F4 /80 y tenía un perfil de dispersión lado alto cuando se analizaron por citometría de flujo (Fig. 1E). Cresil violeta de tinción ordenados CD11b + Siglec-F + células morfología de eosinófilos confirmado (Fig. 1C). La frecuencia de los eosinófilos en la mucosa gástrica se duplicó después de ocho semanas y aumentó aún más después de 26 semanas de la infección (Fig. 1F).}

Los neutrófilos se definen como CD11b ^{+ Gr1 + células (Fig . 1D). Dado que el anticuerpo reconoce tanto Gr1 el epítopo Ly6C y Ly6G confirmamos que Gr1 + + todas las células CD11b expresan el marcador de neutrófilos específica Ly6G (Fig. 1D y E). La frecuencia de los neutrófilos aumentó 10 veces ocho semanas después de la infección y se incrementó aún más después de 26 semanas (Fig. 1F). De este modo, durante el H. pylori infección
hay una acumulación secuencial de neutrófilos y eosinófilos, seguido por los macrófagos en la lámina propia gástrico.}

Caracterización de los DC gástrica

Para la caracterización de los DC gástricos, que identificó por primera vez una población de CD11c ^{+ MHC-II + células (Fig. 2A). Cuando se analizaron adicionalmente estas células para la expresión de F4 /80 y la cadena αE integrina CD103, la mitad de la CD11c + MHC-II + células fueron identificados como F4 /80 + macrófagos (Fig. 2A ). Sin embargo, entre los CD11c + MHC-II + células que carecían de expresión de F4 /80, dos poblaciones de los países en desarrollo putativos con expresión diferencial de CD103 podían distinguirse (Fig. 2A). Debido a las muchas fluorocromos requeridos elegimos sólo para caracterizar el CD103 gástrica +
DC aún más, ya que estas células han sido implicados como antígeno de células presentadoras importante en los tejidos de la mucosa [18]. Gástrica CD103 + DC se identifica fácilmente por la tinción de CD11c y CD103 (Fig. 2B). El CD103 gástrica + DC expresaron altos niveles de MHC-II, y consistieron en una CD11b bajo y un CD11b alta subconjunto (Fig. 2C). En comparación, la gástrica CD103 - DC estaban todos CD11b alta (figura 2D.). Además, el CD103 + DCs carecía de expresión de CD8a y F4 /80 (Fig. 2C). Sin embargo, la frecuencia de CD103 + DC no cambió significativamente en la mucosa gástrica después de la infección (Fig. 2E).}

macrófagos gástrico y CD103 + DC no pueden regular positivamente las moléculas co-estimuladoras después de H. pylori

Con el fin de investigar los posibles efectos de los H. pylori
infección en la expresión de moléculas coestimuladoras y MHC-II por los macrófagos gástricas y CD103 ^{+ DCS, la expresión de estos marcadores se analizó por citometría de flujo después de cuatro, ocho y 26 semanas de infección. En el estado estacionario, macrófagos y CD103 + DCs en la lámina propia gástrico expresaban niveles similares de la molécula CD86 coestimuladora así como MHC-II (Fig. 3A). Sorprendentemente, la expresión de CD86 y MHC-II por cualquiera de los macrófagos gástricas o CD103 + DCs no aumentó después de la infección con H. pylori
en relación con los ratones no tratados previamente emparejados por edad analizados en paralelo (Fig. 3B). Por lo tanto, los macrófagos y CD103 + DC en la lámina propia gástrica no pueden regular positivamente CD86 y MHC-II después de H. pylori
infección, a pesar de la respuesta inflamatoria en curso.}

M1 polarización de los macrófagos gástricos durante el H. pylori
infección

Dado que nuestros resultados sugieren que los macrófagos gástricas podrían no estar totalmente activadas durante H. pylori
infección, que caracteriza estas células aún más mediante la investigación de su polarización M1 /​​M2. Para determinar la polarización de los macrófagos durante el H. pylori
infección, se utilizó PCR en tiempo real para medir la expresión de genes asociados con M1 o M2 polarización de macrófagos en el tejido gástrico [8], [9]. También se midió la expresión de IL-10, que puede ser producido por los macrófagos de regulación [9]. Ninguno de los marcadores analizados fueron expresados ​​diferencialmente cuatro semanas después de H. pylori
infección en relación con los ratones no tratados (Fig. 4A). A las ocho semanas después de la infección la expresión de la iNOS M1 marcadores y CXCL11 se incrementó significativamente, y estos marcadores se upregulated aún más a las 26 semanas de infección (Fig. 4A). Además, la expresión de IL-10 se upregulated en ocho y 26 semanas de infección en relación con los ratones no tratados (Fig. 4A). En contraste, los marcadores M2 encontrados en la zona inflamatoria 1 (FIZZ1) y la arginasa-1 no son expresados ​​diferencialmente en el estómago en cuatro, ocho o 26 semanas de infección en comparación con los ratones no tratados (Fig. 4A).

para identificar la fuente de la iNOS y CXCL11 en la mucosa gástrica, los macrófagos (CD11b ^{+ Gr1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinófilos (CD11b + Gr1 -Siglec-F + MHC-II -) y las células restantes después de Supresión macrófagos y eosinófilos (CD11b - y CD11b + Gr1 +) se ordenan del agrupada Las células de la lámina propia gástricos de ratones infectados con H. pylori
durante 26 semanas (Fig. 4B). La expresión de mRNA de iNOS y CXCL11 en las poblaciones de células clasificadas a partir de ratones infectados, así como en el total de las células gástricas de la lámina propia de los ratones tanto ingenuo y infectada continuación se determinó por PCR en tiempo real. Un número suficiente de macrófagos ordenados no se pudo obtener a partir de ratones naïve para el análisis fiable de la expresión de ARNm. macrófagos gástricos expresaron el nivel más alto de la iNOS y CXCL11 en comparación con las otras poblaciones de células ordenada y las células de la lámina propia gástricos totales antes de la clasificación (Fig. 4C). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que los macrófagos gástricos están polarizados a M1 durante el H. pylori
infección.}

La vacunación contra la H. pylori
amplifica macrófagos M1 polarización

inmunización protectora contra el H. pylori
se asocia generalmente con el rápido desarrollo de una respuesta Th1 gástrico [19]. Dado que la citocina Th1 interferón-γ induce la polarización de los macrófagos M1 [9], se analizó si la vacunación podría influir en la polarización de los macrófagos durante el H. pylori
infección. Con este fin, los ratones se inmunizaron por vía sublingual con H. pylori
lisado y la toxina del cólera adyuvante, y posteriormente desafiados con H. pylori SS1
. Este régimen de inmunización condujo a una reducción significativa de la carga bacteriana en el estómago cuatro semanas después de la exposición (Fig. 5A). Al mismo tiempo, la expresión de marcadores M1 y M2 en el estómago se analizó por PCR en tiempo real. En los ratones no inmunizados, sólo la expresión de CXCL11 se upregulated significativamente cuatro semanas después de la infección en comparación con ratones no tratados (Fig. 5B). En contraste, los ratones inmunizados mostraron un gran upregulation tanto de la M1 marcadores iNOS y CXCL11 mientras que la expresión de la M2 marcadores FIZZ1 y arginasa-1 no se ha cambiado, cuatro semanas después de la exposición (Fig. 5B). El aumento de la expresión de iNOS y CXCL11 en ratones inmunizados /impugnada no era debido a la inmunización solo, ya inmunizados pero ratones no-desafió no cambiaron la expresión de cualquiera de los marcadores M1 o M2 analizadas en comparación con ratones completamente sin tratar (datos no mostrados ).

Además, analizamos la frecuencia de los macrófagos en la mucosa gástrica de los ratones inmunizados y desafiados por citometría de flujo. En relación con los ratones infectados sólo para los ratones inmunizados tuvieron una frecuencia significativamente mayor de los macrófagos gástricos tres semanas después de la exposición (Fig. 5C). Sin embargo, a pesar de que los macrófagos fueron reclutados a la mucosa gástrica de los ratones inmunizados y desafiados, los macrófagos no upregulate la expresión de CD86 o MHC-II con respecto a sólo los ratones infectados (Fig. 5D). Estos resultados muestran que después de la vacunación con éxito H. pylori
lisado y la toxina del cólera, los macrófagos se acumulan en la mucosa gástrica y se polarizó rápidamente a M1 después de la infección.

Aumento de macrófagos M1 polarización en gastritis atrófica humano

A continuación se investigó el papel de H. pylori
la infección y la gastritis atrófica para la polarización de los macrófagos en la mucosa gástrica humana. Con este fin, la expresión de marcadores humanos M1 (iNOS, CXCL11) y M2 (CCL17, CCL18, CD206) se midió en biopsias de antro por PCR en tiempo real. H. pylori
individuos infectados con gastritis sin complicaciones mostraron una expresión significativamente elevados de mRNA tanto para M1 (iNOS, 8 veces; CXCL11, 20 veces) y los marcadores M2 (CCL17, 30 veces; CCL18, 70 veces, CD206 , 2 veces) en comparación con voluntarios no infectados (Fig. 6A). Sin embargo, los individuos con gastritis atrófica (4/6 tenían metaplasia intestinal además de atrofia) expresaron niveles más altos de ARNm de iNOS en comparación con aquellos con gastritis no complicada (20 veces), mientras que CXCL11 y marcadores de M2 ​​polarización se expresaron de manera similar (Fig. 6A). De hecho, la expresión de iNOS era 180 veces mayor en individuos con gastritis atrófica en comparación con los controles no infectados (Fig. 6A), lo que indica una polarización M1 mejorada de macrófagos gástrico en pacientes con gastritis atrófica.

Para investigar si la aumento de la expresión de ARNm de los marcadores M1 y M2 también se traduce en un aumento de los niveles de proteína, proteínas totales se extrajeron de las muestras de biopsia antrales y la concentración de iNOS y CCL18 se determinó por ELISA. biopsias gástricas de individuos con gastritis atrófica sólo estaba disponible para la extracción de proteína a partir de un voluntario, que se indica de forma diferencial en la Figura 6B. La mitad de la H. pylori
individuos infectados tenían niveles detectables de la proteína iNOS en el antro mientras que la concentración de iNOS estaba por debajo del límite de detección en todos los individuos no infectados (Fig. 6B). La expresión de iNOS mRNA y proteína iNOS se correlacionó significativamente (r ^{2 = 0,88, P Hotel < 0,01) que indica que el análisis de mRNA refleja la expresión de proteínas, incluso cuando los niveles de proteína son bajos. La concentración del marcador CCL18 M2 se incrementó en el tejido gástrico de H. pylori
individuos infectados en comparación con los controles no infectados (Fig. 6B). Por otra parte, la concentración de proteína CCL18 se correlacionó significativamente con la expresión de ARNm CCL18 (R 2 = 0,754, P Hotel < 0,01).}

En conjunto, estos hallazgos indican la presencia de ambos macrófagos M1 y M2 en la mucosa gástrica de H. pylori
individuos infectados. Además, gastritis atrófica está asociada con una fuerte amplificación de la expresión de iNOS en la mucosa gástrica, lo que indica una polarización M1 mejorada de los macrófagos.

Discusión

En este estudio, hemos investigado la polarización de gástrico macrófagos durante H crónica. pylori
infección. Se demuestra que H. pylori
individuos infectados expresan mRNA en la mucosa gástrica indicativo de una polarización mixta M1 /​​M2 de los macrófagos, y esto fue confirmado a nivel de proteínas. Sin embargo, en H. pylori
gastritis atrófica inducida hubo una marcada elevación en la expresión de iNOS en comparación con gastritis sin complicaciones. La gastritis atrófica confiere un mayor riesgo de desarrollar cáncer gástrico en relación con sencillo H. pylori
gastritis -asociado [20]. El aumento de la expresión de iNOS en la gastritis atrófica puede contribuir al desarrollo del cáncer gástrico a través de la producción de especies reactivas de nitrógeno, que pueden facilitar la carcinogénesis mediante inducción de daño en el ADN, la interrupción de la reparación del ADN, modificación post-traduccional de las proteínas, y las mutaciones de p53 [4]. De hecho, los ratones deficientes en iNOS tienen una menor incidencia de adenocarcinoma gástrico después de H. pylori
infección y desafío con un carcinógeno químico en comparación con los ratones normales [6]. Además, los polimorfismos en la región promotora de la iNOS, lo que lleva a una actividad transcripcional más alto, se correlacionan con una mayor incidencia del tipo intestinal de cáncer gástrico en las mujeres japonesas [21].

A diferencia de humano H . pylori
infección, infección por SS1 C57BL /6 ratones mostraron un perfil de expresión de genes en la mucosa gástrica indicativo de macrófagos M1 polarización. La expresión de genes de los macrófagos clasificadas aisladas de la mucosa gástrica de los ratones infectados confirmó que la expresión de la iNOS M1 marcadores y CXCL11 se enriquecen en la población de macrófagos ordenada. Además, la polarización de los macrófagos M1 gástricos se aceleró sustancialmente por la vacunación previa. Ya cuatro semanas después de la exposición, los ratones inmunizados upregulated la expresión de iNOS y CXCL11 a un nivel similar al que se observa después de 26 semanas en sólo para los ratones infectados. Los estudios de ratones deficientes en iNOS-han demostrado que la iNOS promueve el desarrollo de la atrofia y el cáncer en la mucosa gástrica durante Helicobacter
infección [6], [22]. Por otra parte, el despacho de H. pylori
después de la vacunación se produce independientemente de la iNOS [23]. Por lo tanto, iNOS parece contribuir a la sede de la patología en lugar de la protección durante la infección con H. pylori
. Por lo tanto, si la producción mejorada de iNOS en la mucosa gástrica se mantiene después de la vacunación, puede ser un efecto secundario no deseado que puede aumentar la gravedad de H. pylori
inflamación inducida y malignidad, a menos que se consigue la inmunidad estéril. Sin embargo, la contribución relativa de la iNOS será sede de la patología frente a protección durante las diferentes etapas de H. pylori
requiere investigación adicional.

Hemos observado un reclutamiento secuencial de células innatas a la mucosa gástrica de los ratones infectados con SS1, con los macrófagos acumular bastante tarde durante el curso de la infección (26 semanas). En contraste, las frecuencias de los neutrófilos gástricas y eosinófilos en la mucosa gástrica aumentaron ocho semanas después de la infección y se mantuvo elevada a las 26 semanas. La acumulación de macrófagos ocurrió mucho más rápido en los ratones vacunados, en cuyo caso la frecuencia de los macrófagos gástricos fue ya aumentado tres semanas después del desafío. Anteriormente, los neutrófilos se ha demostrado que ser reclutados a la mucosa gástrica de los ratones infectados con SS1 en dos fases, una fase temprana en horas pico 1-2 días después de la infección y una fase tardía a partir de las 2-3 semanas después de la infección [24]. Un patrón de reclutamiento, similar a la de los neutrófilos, también se ha descrito para los macrófagos gástricas [24]. Sin embargo, los macrófagos se definieron como CD11b ^{+ Gr1 - células [24], una población de células que en nuestras manos consiste principalmente de los eosinófilos (véase la figura 1 y 2).. Asim et al. macrófagos definidos como CD11b + F4 /80 + células, y se observa un pico temprano en número de macrófagos en la mucosa gástrica de 1-2 días después de la infección con H. pylori
[15]. Además, el número de macrófagos se aumentó de nuevo a los 60 y 120 días después de la infección con respecto a los ratones no tratados previamente [15]. Hacemos llegar estos resultados al mostrar que el reclutamiento de estas poblaciones de células innatas se mantiene hasta 26 semanas después de la infección. Además, se describe la acumulación de eosinófilos en la mucosa gástrica, una población de células que, con mucho más numerosos que los macrófagos y neutrófilos gástricas (Fig. 1). De hecho, el papel de los eosinófilos en H. pylori
gastritis inducida debe investigarse más. Los eosinófilos y macrófagos expresión participación de varios marcadores, incluyendo CD11b y F4 /80 (Fig. 1, [25]). Por lo tanto, múltiples marcadores deben ser analizados de forma simultánea con el fin de distinguir estas poblaciones de células innatas.}

Hemos sido capaces de identificar dos poblaciones de los países en desarrollo en la mucosa gástrica de los ratones. Ambos subconjuntos expresaron altos niveles de CD11c y MHC-II, carecían de expresión de los macrófagos marcador F4 /80, pero difieren con respecto a la expresión de CD103. La frecuencia de CD103 gástrica ^{+ DC no cambió después de cuatro, ocho o 26 semanas de H. pylori
infección. En contraste con nuestro estudio, un estudio reciente realizado por Kao et al. No se ha detectado CD103 + DC en la mucosa gástrica de los ratones no infectados [26]. Más bien, el CD103 + DC surgió 24 horas después de H. pylori
infección. Desde los tiempos de análisis difieren entre este estudio y nuestros experimentos, es difícil comparar directamente los resultados.}

A pesar de que los macrófagos M1 normalmente regulan al alza de MHC-II y moléculas co-estimuladoras, no hemos podido detectar un aumento de la expresión de MHC -II o CD86 en macrófagos gástricas o CD103 ^{+ países en desarrollo de cualquiera de los ratones no vacunados o inmunizados después de la infección. En contraste, la incubación in vitro de H. pylori
con monocitos humanos [27], las DC derivadas de monocitos humanos [28], [29], [30], [31], las DC derivadas de médula ósea murina [32], [33], o humano gástricos primaria los países en desarrollo [34], induce la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y MHC-II. Por lo tanto, el hecho de no regular al alza de MHC-II y CD86 en macrófagos gástricos y CD103 + DC de H crónica. pylori
infección puede ser causada por el medio inflamatorio y no por las bacterias por sí misma. De hecho, la interacción entre DCs y H. pylori
in vitro no refleja necesariamente lo que sucede in vivo, en el que el microambiente local en el lugar de la adquisición de antígeno y la presentación de antígenos, así como el subconjunto DC involucrados en la presentación de antígenos de H. pylori
, influirá en la respuesta. Por ejemplo, las células T reguladoras, que son frecuentes en el H. pylori
mucosa gástrica infectado con [35], [36], se puede evitar que la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y MHC-II en países en desarrollo [37]. Además, la IL-10 puede evitar que la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y MHC-II en los macrófagos y los países en desarrollo [38].}

Durante las respuestas inflamatorias agudas, los macrófagos son normalmente polarizada para M1 y ejercer efectos antimicrobianos potentes. Por ejemplo, la infección por Salmonella typhimurium
o Listeria monocytogenes
induce M1 polarización de los macrófagos, que se requiere para el control de la infección [39]. Resolución de la inflamación se caracteriza por un cambio en la polarización de los macrófagos a M2, que promueve la cicatrización de los tejidos. los pacientes con tuberculosis muestran un aumento de la producción de citocinas Th2 como la infección progresa [40], [41], lo que puede inducir M2 polarización de los macrófagos. En ratones, la polarización de los macrófagos M1 constituye la respuesta temprana a Mycobacterium tuberculosis
, mientras que los macrófagos alveolares están polarizados a M2 durante la infección etapa tardía [42]. Sin embargo, el cambio en la polarización de los macrófagos inducida por infecciones crónicas a menudo resulta en una capacidad reducida de los macrófagos para matar a las bacterias invasoras [39], [43]. Por otra parte, la inflamación crónica persistente con la polarización de los macrófagos M1 se asocia con un mayor riesgo de desarrollo de cáncer [4].

Haz macrófagos contribuyen a la defensa del huésped contra el H. pylori
? A diferencia de los neutrófilos, los macrófagos no se ven con frecuencia en la luz gástrica después de la translocación a través del epitelio [44]. Desde H. pylori
preferentemente residen en la capa mucosa gástrica o se unen a las células epiteliales gástricas, los macrófagos no pueden entrar en contacto directo con bacterias enteras. De hecho, el agotamiento de los macrófagos por liposomas cargados con el fármaco no tuvo efecto sobre H. pylori
la colonización [16], lo que sugiere que los macrófagos pueden no contribuir directamente a la defensa del huésped contra el H. pylori
. En contraste, los macrófagos pueden promover la patología gástrica. Por ejemplo, el agotamiento mediada por liposomas de los macrófagos mejorado la gastritis inducida por H. pylori
la infección [16]. Además, la supresión selectiva de β I-kappa B-quinasa en las células mieloides, lo que impide la activación de NF-kappa B en estas células, inhibe el desarrollo de atrofia gástrica después de H. felis
la infección [45]. Por lo tanto, no aparecen los macrófagos para contribuir a Helicobacter
despacho, sino que más bien pueden promover la patología gástrica.

En conclusión, este estudio muestra que la vacunación de los ratones contra la H. pylori
amplifica M1 polarización de macrófagos gástricos. Un fenómeno similar se observa en gastritis atrófica humana, donde la mezcla de M1 /​​M2 polarización presente en gastritis no complicada se sustituye por una polarización dominado-M1. Esto puede inducir un tumor de promoción de la inflamación, y el cambio de polarización de macrófagos de M1 a M2, por tanto, podría representar una diana terapéutica en H crónica. pylori
infección.

Materiales y Métodos

Ética declaración

El estudio fue aprobado por el comité de ética animal gobierno (Göteborgs djurförsöksetiska nämnd, 328/2008 y 254 /2009). El comité de ética regional humanos de Västra Götaland en Suecia (706/03 y 85/06) aprobó el estudio, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes. Esta es la única autoridad que da el permiso ético para la investigación en seres humanos en Suecia, y no está asociada directamente a los hospitales o universidades.

Ratones

hembra C57BL /6 ratones fueron adquiridos de Charles River Laboratories (Sulzfeld, Alemania), o en el caso de los experimentos de vacunación de Taconic (Ejby, Dinamarca). Los ratones fueron infectados a una edad de 8-12 semanas.

Las bacterias y la infección de ratones

H. pylori SS1
se cultivó en placas de agar Columbia ISO durante 2 días a 37 ° C, después de lo cual se transfirieron a caldo Brucella suplementado con 5% de suero de ternera fetal (FCS) y antibióticos (vancomicina, 10 mg /ml; polimixina B , 20 U /ml; trimetoprim, 5 mg /ml) y se incubó agitando durante la noche a 37 ° C bajo condiciones microaerofílicas. Antes de la infección, la motilidad de las bacterias se confirmó por microscopía. La concentración de bacterias se estimó espectrofotométricamente. Los ratones recibieron 3 × 10 ^{8 unidades formadoras de colonias de SS1 intragástrica.}

inmunización sublingual

Los ratones recibieron cuatro dosis de 10 l de 500 g H. pylori
lisado (preparada a partir de la cepa Hel305 como se describe anteriormente [46]) en combinación con 10 mg toxina del cólera (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ) por vía sublingual a intervalos de 1 semana [47], [48]. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron desafiados por vía intragástrica con 3 × 10 ^{8 unidades formadoras de colonias de H. pylori SS1
.}

Evaluación de la colonización bacteriana

Para la evaluación cuantitativa de la colonización bacteriana en experimentos de inmunización, una media del estómago se lavó suavemente con PBS y se homogeneizaron usando un homogeneizador Ultra Turrax ( IKA Laboratorio de Tecnología, Staufen, Alemania). Las diluciones en serie del homogeneizado se colocaron en placas en placas de agar Skirrow. Cuando se aislaron células de la lámina propia gástrica de todo el estómago una estimación cuantitativa de la carga bacteriana gástrica no se pudo realizar. En este caso, el estómago, que se corta a lo largo de la curvatura mayor y se lavó en PBS, se sembró en placas de agar suavemente Skirrow. La presencia de H. pylori
colonias fue confirmada por una prueba de ureasa. De esta manera, pudimos confirmar H. pylori
colonización y todavía utilizan todo el estómago para el aislamiento de células.

El aislamiento de las células de la lámina propia gástrica

El estómago glandular fue cortada en piezas de 5 mm y se incubó un total de tres veces con H.

• PLOS ONE: La precisión y los valores de corte de pepsinógenos I, II y gastrina 17 para el diagnóstico de atrofia gástrica fúndica: Influencia de la Gastritis
• PLOS ONE: Microbiota bacteriana de perfiles en la gastritis y sin infección por Helicobacter pylori o no esteroides anti-inflamatorios Uso de Drogas