PLoS ONE: Enhanced M1 makrofaagianalyysi polarisaatio Human Helikobakteeri-Associated atrofisen gastriitin ja rokotetun Hiiret

tiivistelmä

Background

Infektio Helicobacter pylori
laukaisee krooninen mahalaukun tulehdus, joka voi edetä surkastumista ja mahalaukun adenokarsinoomaa. Polarisaatio makrofagien on ominaista sekä syövän ja infektion, ja se voi edistää etenemistä tai resoluutio taudin. Kuitenkin rooli makrofagien ja niiden polarisaation aikana H. pylori
infektio ei ole hyvin määritelty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä hiirimallissa infektio ja mahalaukun koepaloja 29 yksilöitä, olemme analysoineet makrofagien rekrytointiin ja polarisaatio aikana H. pylori
infektio virtaussytometrialla ja reaaliaikaisella PCR: llä. Löysimme juokseva rekrytointi neutrofiilien, eosinofiilien ja makrofagien mahalaukun limakalvo tartunnan hiirillä. Geeniekspressioanalyysiä vatsan kudosta ja lajitellaan makrofagien paljasti, että mahalaukun makrofaagit polarisoitu M1 jälkeen H. pylori
infektio, ja tämä prosessi on huomattavasti nopeutettu etukäteen rokotusta. Ihmisen H. pylori
infektio leimasi sekoitettu M1 /​​M2 polarisaatio makrofagien. Kuitenkin H. pylori
-associated atrofinen gastriitti, indusoitavissa typpioksidisyntaasin oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna mutkaton gastriitti, osoittaa parannetun M1 makrofagin polarisaatio tässä premaligneja vaurio.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset osoittavat, että hiirten rokottaminen vastaan ​​ H. pylori
vahvistaa M1 polarisaatio mahalaukun makrofagien, ja että samanlainen parannettu M1 polarisaatio on läsnä ihmisen H. pylori
n aiheuttamaa atrofista gastriittia.

Citation: ohjaa niin yhtiön-Järbrink M, Raghavan S, Sundquist M (2010) Enhanced M1 makrofaagianalyysi polarisaatio Human Helicobacter pylori
-Associated atrofisen gastriitin ja rokotetut hiiret. PLoS ONE 5 (11): e15018. doi: 10,1371 /journal.pone.0015018

Editor: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Intia

vastaanotettu: 26 elokuu 2010; Hyväksytty: 07 lokakuu 2010; Julkaistu: 23 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 ohjaa niin yhtiön-Järbrink et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat osaamiskeskuksen MIVAC rahoittama Ruotsin Foundation for Strategic Research, The Adlerbert Research Foundation, Wilhelm & Martina Lundgrenin perusta, Inga-Britt & Arne Lundberg n perusta, ja Sahlgrenskan yliopistollisessa sairaalassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori
asuttaa vatsan epiteelin yli puolet maailman väestöstä [1]. Infektio on usein elinikäinen ja laukaisee krooninen tulehdus mahan limakalvon, joka noin 1-2% tartunnan yksilöiden lopulta kehittyy mahalaukun adenokarsinooman [1]. Kehittäminen mahasyöpä, erityisesti suoliston tyyppi, on monivaiheinen prosessi, joka etenee vuosikymmenten läpi syöpää edeltävät leesiot mahalaukun limakalvon, kuten atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa, ja dysplasia [2]. Tulos infektion riippuu virulenssi tartuttamisesta H. pylori
kanta, ympäristötekijät, kuten tupakointi ja ruokavalio, ja isäntä geneettiset tekijät, jotka vaikuttavat lajin ja intensiteetin tulehdusreaktion [1].

Vahva proinflammatoristen vaste liittyy kohonneeseen reaktiivisen hapen ja typen lajien mahalaukun limakalvon [3], jotka voivat edistää syövän kehitystä [4]. Esimerkiksi hiiret tartunnan H. pylori
kuusi kuukautta ovat useammin mahalaukun mutaatioiden verrattuna terveille hiirille [5]. Lisäksi hiiret, jotka ovat puutteellisia entsyymin indusoituvan typpioksidisyntaasin (iNOS) on vähentänyt mahalaukun syövän jälkeen H. pylori
infektio ja karsinogeeni haaste verrattuna normaaleihin hiiriin [6]. Vaikka iNOS edistää mahasyövän, korkea kemokiinin CCL18 mahalaukun kasvaimet liittyy pidensi elinaikaa mahasyövän potilailla [7]. Mielenkiintoista, iNOS tuotetaan klassisesti aktivoida /M1 makrofagit taas CCL18 tuotanto on tunnusmerkki vaihtoehtoisesti aktivoida /M2 makrofageissa [8]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että makrofagi polarisaatio voi olla tärkeä rooli kehittämisessä H. pylori
-associated mahasyövässä.

M1 makrofagit tyypillisesti osallistu alkuperäisen immuunivasteen hyökkääviä mikro-organismeja ja edistää T auttaja (Th) 1 koskemattomuus, kun taas M2 makrofagit indusoituvat resoluutiota vaiheen tulehduksen ja osallistuvat roskia puhdistusjärjestelmä, kudoksen uudelleen, ja edistäminen Th2 immuniteetti [8], [9]. Polarisaatio makrofagien ohjaa mikroympäristö. M1 makrofagit indusoi interferoni-γ ja mikrobien, kuten lipopolysakkaridi [9]. Toisaalta, M2 makrofagit indusoi Th2- tai anti-inflammatoristen sytokiinien ja kasvutekijöiden, mukaan lukien IL-4, IL-10 ja transformoiva kasvutekijä-β [8], [9].

aikana H. pylori
infektio, makrofageja rekrytoidaan mahan limakalvon, jossa ne edistävät tuotannon proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että liposomivälitteinen ehtyminen makrofagien vähennetään mahan patologian H. pylori
infektoiduista hiiristä [16]. Tästä huolimatta funktio makrofagien aikana in vivo H. pylori
infektio edelleen suhteellisen heikosti määritelty. Toiminta makrofagien on läheisesti kytketty niiden polarisaation tilan, joka näyttää myös olevan rooli mahasyövän [6], [7]. Siksi olemme tutkineet makrofagi polarisaatio mahalaukun limakalvo H. pylori
infektoiduista hiiressä ja ihmisessä. Osoitamme, että hiirten rokottaminen vastaan ​​ H. pylori
nopeudet ja vahvistaa M1 polarisaatio mahalaukun makrofageissa. Lisäksi syövän esiasteiden vaurio atrofinen gastriitti on ominaista makrofagien M1 polarisaatio ihmisillä.

Tulokset

tiheämmin makrofagien, eosinofiilien ja neutrofiilien mahalaukun limakalvon jälkeen H. pylori
infektio

rekrytointia luontaisia ​​solujen infektiokohtaa on edellytys tarttuvan valvontaa. Ei ainoastaan ​​synnynnäistä soluja, kuten makrofagien ja neutrofiilien, osallistuvat bakteerien tappamiseen; ne tuottavat myös tulehduksen välittäjäaineita, jotka loivat seurannut immuunivasteen. Tutkia kertyminen luontaisia ​​solujen mahalaukun limakalvon aikana H. pylori
infektio, me tartunnan C57BL /6-hiirten kanssa hiiren sovitettu H. pylori
Sydney kannan 1 (SS1), ja sen jälkeen neljä, kahdeksan ja 26 viikon aikana olemme analysoineet mahalaukun tulehdussuodoksen yksittäisten hiirien monivärinen virtaussytometria. Kokonaismäärä lamina propria solujen eristetty mahasta ei muutu ensimmäisen neljän viikon infektion, mutta kahdeksan viikon kuluttua infektion kokonaismäärä eristetyt solut oli kaksinkertaistunut, ja 26 viikkoa infektion oli kahdeksan-kertainen kokonaismäärässä solujen eristetty verrattuna infektoimattomiin hiiriin (Fig. 1A). Niistä solut rekrytoidaan vatsaan olivat makrofagit, eosinofiilit ja neutrofiilit. Mahalaukun makrofagit tunnistettiin soluja, jotka ilmentävät CD11 ja major histocompatibility complex class II (MHC-II), mutta josta puuttuu ilmentymistä Gr1 (neutrofiilien markkeri), CD103 (alaryhmä ekspressoi dendriittisolujen (DC)) ja sialihappoa sitovat immunoglobulin- kuten lektiini (Siglec-F, eosinofiilien merkki) (Fig. 1 B). Nämä solut ilmaisivat makrofagimarkkeri F4 /80 (Fig. 1 E), ja se perustuu solumorfologiaan vahvistettiin kuten makrofagit (Fig. 1 B). Taajuus makrofagien mahalaukun limakalvon pysyi muuttumattomana sen jälkeen, kun neljä ja kahdeksan viikon H. pylori
infektio (Fig. 1 F). Kuitenkin 26 viikon jälkeen taajuus mahalaukun makrofagien nostettiin verrattuna terveille hiiriä (Kuva. 1 F).

Eosinofiilejä määriteltiin CD11 ^{+ Siglec-F + soluissa (kuvio. 1C, [17]). Nämä solut ilmaisivat väliportaan F4 /80 ja oli suuri sivusirontavirtaussytometriaa profiilin, kun analysoitiin virtaussytometrialla (kuvio. 1 E). Kresyylivioletilla värjäys lajiteltu CD11 + Siglec-F + solujen vahvistanut eosinofiilien morfologia (Fig. 1 C). Taajuus eosinofiilien mahalaukun limakalvon kaksinkertaistui kahdeksan viikon kuluttua, ja kasvoi edelleen sen jälkeen, kun 26 viikkoa infektion (Fig. 1 F).}

Neutrofiilit määritellään CD11 ^{+ Gr1 + soluissa (kuvio . 1D). Koska Gr1 vasta-aine tunnistaa sekä Ly6C ja Ly6G epitooppi me vahvisti, että kaikki CD11 + Gr1 + solujen ilmaista erityiset neutrofiilien merkki Ly6G (Fig. 1 D ja E). Taajuus neutrofiilien kasvoi 10-kertaiseksi kahdeksan viikon kuluessa tartunnan ja lisättiin edelleen 26 viikon jälkeen (Kuva. 1 F). Siten aikana H. pylori
infektio on peräkkäinen neutrofiilien kerääntyminen ja eosinofiilien, jonka jälkeen makrofagit mahalaukun lamina propria.}

karakterisointi mahalaukun DC

Luonnehtia mahalaukun DC, ensin tunnistaa populaatio of CD11 c ^{+ MHC-II + soluissa (kuvio. 2A). Kun nämä solut analysoitiin edelleen ilmentymisen F4 /80 ja αE integriiniketjun CD103, puolet CD11 c + MHC-II + solut tunnistettiin F4 /80 + makrofagien (Fig. 2A ). Kuitenkin joukossa CD11 c + MHC-II + solut, joista puuttui ilmentyminen F4 /80, kahden populaation oletettujen DC: iden ero ilmaus CD103 voitiin erottaa (Fig. 2A). Koska monet fluorokromeja tarvitaan päätimme vain luonnehtia mahalaukun CD103 +
DC edelleen, koska nämä solut on liitetty tärkeänä antigeeniä esittelevien solujen limakalvon kudoksissa [18]. Mahalaukun CD103 + DC oli helppo tunnistaa värjäämällä varten CD11 c ja CD103 (Fig. 2B). Mahalaukun CD103 + DC ilmensivät runsaita tasoja MHC-II ja koostui CD11 alhainen ja CD11 korkea alaryhmä (Fig. 2C). Vertailun vuoksi mahalaukun CD103 - DC olivat kaikki CD11 korkea (Fig. 2D). Lisäksi CD103 + DC puuttui ilmentymisen CD8a ja F4 /80 (Fig. 2C). Kuitenkin taajuus CD103 + DC ei muuttunut merkittävästi mahalaukun limakalvon tartunnan jälkeen (Kuva. 2E).}

Mahalaukun makrofagien ja CD103 + DC: iden ei upregulate apustimulaatiomolekyylejä jälkeen H. pylori
infektio

Tutkiakseen mahdollisista vaikutuksista H. pylori
tartunnan ilmentymistä kostimulatorisia molekyylejä ja MHC-II mahalaukun makrofagien ja CD103 ^{+ DC: n ilmentyminen näiden markkereiden analysoitiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun neljä, kahdeksan ja 26 viikkoa infektion. Vakaassa tilassa, makrofagien ja CD103 + DC mahalaukun lamina propria ilmaistuna saman määrän kostimulatorista molekyyliä CD86 sekä MHC-II (Fig. 3A). Yllättäen ilmentymisen CD86 ja MHC-II: joko mahalaukun makrofagien tai CD103 + DC: iden ei lisääntynyt infektion jälkeen H. pylori
suhteessa samanikäisiin naiivi hiiret analysoitiin rinnakkain (Fig. 3B). Täten makrofagien ja CD103 + DC mahalaukun lamina propria eivät upregulate CD86 ja MHC-II jälkeen H. pylori
infektio huolimatta meneillään tulehdusreaktio.}

M1 polarisaatio mahalaukun makrofagien aikana H. pylori
infektio

Koska meidän tulokset ehdottivat, että mahalaukun makrofagit ehkä voida täysin aktivoida aikana H. pylori
infektio, me tunnettu nämä solut edelleen tutkimalla niiden M1 /​​M2 polarisaatio. Määrittämään makrofagi polarisaation aikana H. pylori
infektio, käytimme real-time PCR mitata geenien ilmentymistä, jotka liittyvät M1 tai M2 polarisaation makrofagien mahalaukun kudoksen [8], [9]. Myös mitattiin IL-10, joka voidaan valmistaa sääntely makrofagit [9]. Yksikään merkkiaineiden analysoitu oli ilmennetty eri neljän viikon kuluttua H. pylori
infektio suhteessa naiivi hiiret (Fig. 4A). Kahdeksan viikon kuluttua infektion ilmentymisen M1 markkereita iNOS ja CXCL11 oli merkittävästi lisääntynyt, ja nämä merkit olivat edelleen voimistunut on 26 viikkoa infektion (Fig. 4A). Lisäksi IL-10: n ilmentyminen lisääntyy kahdeksan ja 26 viikkoa infektion suhteen naiivi hiiret (Fig. 4A). Sen sijaan, M2 markkereita löytyy tulehduksellinen alueen 1 (FIZZ1) ja arginase-1 ei ole differentiaalisesti ilmaistut mahassa neljä, kahdeksan tai 26 viikkoa infektion verrattuna naiiveja hiiriä (Fig. 4A).

lähteen tunnistamiseen iNOS ja CXCL11 mahalaukun limakalvon, makrofagit (CD11 ^{+ Gr1 -Siglec-F -MHC-II +), eosinofiilien (CD11 + Gr1 -Siglec-F + MHC-II -) ja loput solut jälkeen gating ulos makrofageja ja eosinofiilit (CD11 - ja CD11 + Gr1 +) on lajiteltu yhteenkerätystä mahan lamina propria solut hiirten infektoitu H. pylori
26 viikon ajan (Fig. 4B). MRNA iNOS- ja CXCL11 in lajitellun solupopulaatioiden tartunnan hiiristä sekä yhteensä mahan lamina proprian solut molemmista naiiveja ja tartunnan saaneiden hiirien määritettiin sitten reaaliaikainen PCR. Riittävä määrä lajitellun makrofagien ei saa naiiveja hiiriä luotettavan analyysin mRNA ilmaisun. Mahalaukun makrofagit ilmaistiin korkein iNOS: n ja CXCL11 verrattuna muihin lajitellut solupopulaatioiden ja yhteensä mahan lamina propria soluja ennen lajittelua (Fig. 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että mahalaukun makrofageja polarisoitu M1 aikana H. pylori
infektio.}

Rokottaminen H. pylori
Voimistaa makrofagi M1 polarisaatio

Suojaava immunisaatioon H. pylori
liittyy yleensä nopea kehitys mahan Th1 vasteen [19]. Koska Th1 sytokiinien interferoni-γ indusoi makrofagi M1 polarisaatio [9], tutkimme onko rokotus voi vaikuttaa makrofagien polarisaation aikana H. pylori
infektio. Tätä varten hiiret immunisoitiin kielen alle, jossa H. pylori
lysaatti ja koleratoksiini adjuvanttia, ja tämän jälkeen altistettiin H. pylori
SS1. Tämä immunisointi hoito johti merkittävään vähenemiseen bakteerien määrää mahassa neljän viikon kuluttua haaste (Kuva. 5A). Samaan aikaan, ilmaus M1 ja M2 markkereita mahassa analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Immunisoimattomilla hiirillä, vain ilmentyminen CXCL11 oli merkittävästi voimistunut neljän viikon kuluttua infektion verrattuna naiiveja hiiriä (kuvio. 5B). Sen sijaan, immunisoiduista hiiristä osoittivat suurta säätelyä sekä M1-markkereita iNOS ja CXCL11 kun taas ilmentyminen M2 markkereita FIZZ1 ja arginase-1 ei ole muutettu, neljän viikon kuluessa haaste (Fig. 5B). Lisääntynyt ilmentyminen iNOS: n ja CXCL11 immunisoiduissa /altistetuissa hiirissä ei ollut, koska immunisaatioon yksin, sillä immunisoitiin mutta ei-altistetuissa hiirissä ei muuttanut ilmaus tahansa analysoitu M1 tai M2 markkereita verrattuna täysin käsittelemättömän hiiriin (tuloksia ei ole esitetty ).

lisäksi olemme analysoineet taajuus makrofagien mahalaukun limakalvon immunisoitujen ja hiiriin virtaussytometrialla. Suhteessa tartunnan vain hiiriä, immunisoiduista hiiristä oli huomattavasti useammin mahalaukun makrofagien kolmen viikon haaste (Fig. 5C). Huolimatta että makrofagit rekrytoitiin mahalaukun limakalvon immunisoitujen ja hiiriin, makrofagit eivät upregulate ilmentymistä CD86 tai MHC-II-suhteessa tartunnan vain hiirillä (Kuva. 5D). Nämä tulokset osoittavat, että onnistuneen rokotuksen H. pylori
lysaatti ja koleratoksiinin, makrofagit kerääntyä mahan limakalvoa ja nopeasti polarisoitunut M1 tartunnan jälkeen.

Augmentation makrofagien M1 polarisaation ihmisen atrofinen gastriitti

vieressä tutkineet rooli on H. pylori
infektion ja atrofisen gastriitin makrofagin polarisaatio ihmisen mahalaukun limakalvon. Tätä varten, ekspressiota ihmisen M1 (iNOS, CXCL11) ja M2-markkereita (CCL17, CCL18, CD206) mitattiin koepalat antrumissa by real-time PCR. H. pylori
infektoiduista yksilöiden mutkaton gastriitti oli merkittävästi kohonnut ilmentyminen mRNA sekä M1 (iNOS, 8-kertainen, CXCL11, 20-kertainen) ja M2 markkereita (CCL17, 30-kertainen, CCL18, 70-kertainen, CD206 , 2-kertainen) verrattuna terveille vapaaehtoisille (Fig. 6A). Kuitenkin yksilöiden atrofinen gastriitti (4/6 oli suoliston metaplasiaa lisäksi surkastumista) ilmaisi vielä korkeampi iNOS-mRNA verrattuna Komplisoitumatonta gastriitti (20-kertainen), kun taas CXCL11 ja merkkiaineita M2 polarisaation olivat samalla ilmaistiin (Fig. 6A). Todellakin, iNOS- oli 180-kertaisesti kasvanut yksilöiden atrofinen gastriitti verrattuna infektoimattomiin kontrolleihin (Fig. 6A), mikä osoittaa parannetun M1 polarisaation mahalaukun makrofagien potilailla, joilla on atrofinen gastriitti.

Sen tutkimiseksi, onko lisääntynyt mRNA: n ilmentymisen M1 ja M2 markkereita näkyy myös lisääntynyt proteiinin tasot, yhteensä proteiinit uutettiin antral biopsianäytteistä ja pitoisuus iNOS: n ja CCL18 määritettiin ELISA: lla. Mahalaukun koepalat yksilöiden atrofinen gastriitti oli olemassa vain proteiinin uuttamalla yksi vapaaehtoinen, joka on differentiaalisesti osoitettu kuviossa 6B. Puolet H. pylori
infektoiduista yksilöitä oli havaittavissa olevia iNOS proteiinin antrumiin taas pitoisuus iNOS oli alle määritysrajan kaikissa infektoitumattomilla henkilöillä (Fig. 6B). Ilmaisu iNOS-mRNA: n ja iNOS-proteiinin korreloi merkitsevästi (R ^{2 = 0,88, P
< 0,01), mikä osoittaa, että mRNA: n analyysi heijastaa proteiinin ilmentyminen, jopa silloin, kun proteiini on alhainen. Pitoisuus M2 markkeri CCL18 lisättiin mahalaukun kudoksen H. pylori
infektoiduista yksilöitä verrattuna terveille valvontaa (Fig. 6B). Lisäksi pitoisuus CCL18 proteiinin korreloi merkitsevästi ekspression CCL18 mRNA (R 2 = 0,754, P
< 0,01).}

Yhdessä nämä havainnot osoittavat läsnäolo sekä M1 ja M2 makrofagit mahalaukun limakalvo H. pylori
infektoiduista yksilöitä. Lisäksi atrofinen gastriitti liittyy voimakas vahvistus iNOS ilmaisun mahalaukun limakalvon, mikä osoittaa parannetun M1 polarisaatio makrofagien.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet polarisaatio mahalaukun makrofagit aikana krooninen H. pylori
infektio. Osoitamme, että H. pylori
infektoiduista yksilöiden ilmaista mRNA mahalaukun limakalvon osoittaa sekoitetun M1 /​​M2 polarisaatio makrofagien, ja tämä vahvistettiin lisäksi proteiinitasolla. Kuitenkin H. pylori
indusoimaan atrofinen gastriitti oli selvästi kohoamista iNOS- verrattuna yksinkertainen gastriitti. Atrofinen gastriitti antaa lisääntynyt riski sairastua mahalaukun syöpään nähden mutkaton H. pylori
-associated gastriitti [20]. Lisääntynyt ilmentyminen iNOS atrofinen gastriitti voi edistää mahalaukun syövän kehittymisen kautta reaktiivisten typen muotoja, jotka voivat edistää karsinogeneesiä induktiolla DNA-vaurion, häiriöitä DNA korjaukseen, translaation jälkeisen modifikaation proteiinien ja p53 mutaatioita [4]. Todellakin, iNOS-hiirillä on vähentänyt mahan adenokarsinooman jälkeen H. pylori
infektio ja haaste kemiallisella karsinogeeni verrattuna normaaleihin hiiriin [6]. Myös, polymorfismien promoottorialueen iNOS, mikä johtaa korkeampaan transkriptionaalista aktiivisuutta, korreloi esiintyi enemmän suolen tyyppiä mahasyövän japanilaiset naiset [21].

Toisin ihmisen H . pylori
infektio, SS1-tartunnan C57BL /6-hiiret osoittivat geeniekspressioprofiili mahalaukun limakalvon osoittaa makrofagien M1 polarisaatio. Geeniekspressioanalyysiä lajitellun makrofageja eristettiin mahan limakalvon tartunnan hiirillä vahvisti, että ilmaus M1 markkereita iNOS ja CXCL11 on rikastunut lajitellut rofagipopulaatio. Lisäksi M1 polarisaatio mahalaukun makrofagien oleellisesti kiihdyttää ennen rokotusta. Jo neljän viikon kuluttua haaste, immunisoiduista hiiristä upregulated ilmentymisen iNOS: n ja CXCL11 samalle tasolle kuin mitä havaittiin 26 viikon jälkeen in tartunnan vain hiirillä. Tutkimukset iNOS-hiirillä ovat osoittaneet, että iNOS edistää kehitystä surkastumista ja syövän mahalaukun limakalvon aikana Helicobacter
infektion [6], [22]. Lisäksi puhdistuma H. pylori
rokotuksen jälkeen tapahtuu riippumatta iNOS [23]. Siten iNOS näyttää osaltaan isännöidä patologian sijaan suojan infektion H. pylori
. Näin ollen, jos tehokkaaksi tuottamiseksi, iNOS mahalaukun limakalvon säilyy rokotuksen jälkeen, se voi olla ei-toivottu sivuvaikutus, joka voi lisätä vakavuus H. pylori
indusoimaan tulehdus ja maligniteetin, ellei steriili immuniteetti saavutetaan. Kuitenkin suhteellinen osuus iNOS isännöidä patologian vs. suojelu eri vaiheissa H. pylori
infektio optio lisätutkimuksia.

Havaitsimme peräkkäinen rekrytointi luontaisia ​​solujen mahalaukun limakalvo SS1-tartunnan hiiriä, jossa makrofagien kertyy varsin myöhään aikana infektion (26 viikkoa). Sen sijaan, taajuudet mahalaukun neutrofiilien ja eosinofiilien mahalaukun limakalvon kasvoi kahdeksan viikon kuluessa tartunnan ja pysyivät kohonneina 26 viikkoa. Kertyminen makrofagien tapahtui paljon nopeammin rokotetuilla hiirillä, jolloin taajuus mahalaukun makrofagien lisättiin jo kolmen viikon kuluttua haaste. Aiemmin neutrofiilit on osoitettu rekrytoidaan mahalaukun limakalvo SS1-tartunnan hiirillä kahdessa vaiheessa, yksi varhainen vaihe korkeimmillaan 1-2 päivää tartunnan jälkeen ja yhden myöhäinen vaihe alkaa 2-3 viikkoa tartunnan jälkeen [24]. Työhönottojärjestelmä kuvio, joka on samanlainen kuin neutrofiilien, kuvattiin myös mahalaukun makrofagien [24]. Kuitenkin makrofagit määriteltiin CD11 ^{+ Gr1 - soluja [24], solupopulaation, joka meidän käsissämme koostuu pääasiassa eosinofiilien (kts. 1 ja 2). Asim et ai. määritellään makrofageja kuten CD11 + F4 /80 + soluja, ja havaittiin varhaisessa huippu makrofaagien numero mahalaukun limakalvon 1-2 päivää tartunnan jälkeen H. pylori
[15]. Lisäksi, makrofagien määrä lisääntyi jälleen 60 ja 120 päivää infektion jälkeen suhteessa naiiveja hiiriä [15]. Osoitamme nämä tulokset osoittavat, että rekrytointi tätä sisäistä solupopulaatioiden säilyy jopa 26 päivään viikkoa tartunnan jälkeen. Lisäksi kuvaamme eosinofiilien kerääntyminen mahalaukun limakalvon, solupopulaatio, että huomattavasti enemmän kuin mahalaukun makrofagien ja neutrofiilien (Fig. 1). Itse asiassa rooli eosinofiilien H. pylori
indusoimaan gastriitti olisi tutkittava edelleen. Eosinofiilien ja makrofagien osuus ilmentyminen useiden merkkiaineiden, kuten CD11 ja F4 /80 (Fig. 1, [25]). Siksi useita markkereita on analysoitava samanaikaisesti, jotta voidaan erottaa tätä sisäistä solupopulaatioiden.}

Pystyimme tunnistamaan kaksi populaatioiden DC mahalaukun limakalvon hiirillä. Molemmat osajoukot ilmaisivat korkeita CD11 c ja MHC-II puuttui ilmaus makrofagimarkkeri F4 /80, mutta erosivat suhteen ilmaus CD103. Taajuus mahalaukun CD103 ^{+ DC ei muuttunut neljän, kahdeksan tai 26 viikon H. pylori
infektio. Toisin kuin Tutkimuksessamme tuoreessa tutkimuksessa Kao et al. ei havainnut CD103 + DC mahalaukun limakalvon infektoitumattomien hiirten [26]. Pikemminkin CD103 + DC syntyi 24 tunnin jälkeen H. pylori
infektio. Koska Analyysiaikoihin eroavat että tutkimus ja meidän kokeita, on vaikea suoraan verrata tuloksia.}

Tästä huolimatta M1 makrofagit tyypillisesti upregulate MHC-II ja kostimulatorista molekyyliä, emme voineet havaita lisääntynyttä MHC -II tai CD86 mahalaukun makrofageissa tai CD103 ^{+ DC: iden joko immunisoimattomien tai immunisoitujen hiirien infektion jälkeen. Sen sijaan in vitro inkubaatio H. pylori
ihmisen monosyyttien [27], ihmisen monosyyteistä peräisin DC [28], [29], [30], [31], hiiren luuytimestä peräisin DC [32], [33], tai ihmisen ensisijainen mahalaukun DC: [34], indusoi säätelyä kostimulatorisia molekyylejä ja MHC-II. Siksi epäonnistuminen upregulate MHC-II ja CD86 mahalaukun makrofagien ja CD103 + DC kroonisen H. pylori
infektio voi johtua tulehduksellinen miljöö ei bakteerien sinänsä. Todellakin, vuorovaikutusta DC ja H. pylori
in vitro ei välttämättä mitä tapahtuu in vivo, jossa paikallinen mikroympäristö paikalla antigeenin hankintaa ja antigeenin esittelyä sekä DC osajoukko liittyvät antigeenin esittely H. pylori
, vaikuttaa vastauksen. Esimerkiksi säätelevien T-solut, jotka ovat yleisiä H. pylori
infektoiduista mahalaukun limakalvon [35], [36], voidaan estää säätely Apustimulaatiomolekyylien ja MHC-II DC [37]. Lisäksi, IL-10 voi estää säätelyä kostimulatorisia molekyylejä ja MHC-II makrofagien ja DC: [38].}

äkillinen tulehdusvasteet, makrofagit tyypillisesti polarisoitu M1 ja käyttää voimakas anti-mikrobi vaikutuksia. Esimerkiksi infektio Salmonella typhimurium
tai Listeria monocytogenes
indusoi M1 polarisaatio makrofagien, joka vaaditaan valvonta-infektion [39]. Tarkkuus tulehdus on ominaista siirtymä makrofagien polarisaatio M2, joka edistää kudosten paranemista. Tuberkuloosipotilaille näyttää lisääntyneen Th2 sytokiinien kuten infektion edetessä [40], [41], mikä voi aiheuttaa M2 polarisaatiota makrofagien. Hiirillä, M1 polarisaatio makrofagien muodostaa aikaisin vastaus Mycobacterium tuberculosis
, kun taas keuhkorakkuloiden makrofageja polarisoitu M2 aikana myöhäisessä vaiheessa infektion [42]. Kuitenkin muutos makrofagien polarisaatio aiheuttama krooninen infektio johtaa usein heikentynyt kapasiteetti makrofagien tappaa hyökkääviä bakteerit [39], [43]. Toisaalta, krooninen tulehdus pysyviä M1 makrofagien polarisaatio liittyy lisääntynyt riski syövän kehittymisen [4].

Onko makrofageja edistää isäntä vastustuskykyä H. pylori
? Toisin kuin neutrofiilit, makrofagit eivät usein nähty mahan onteloon jälkeen yli siirtymisen epiteelin [44]. Koska H. pylori
ensisijaisesti asuvat mahalaukun limakerroksessa tai liitetään mahan epiteelisolujen makrofagit ei saa tulla suoraan kosketukseen koko bakteereja. Todellakin, ehtyminen makrofagien huumeiden liposomit ollut vaikutusta H. pylori
kolonisaation [16], mikä viittaa siihen, että makrofagit eivät saa suoraan edistävät isäntä vastustuskykyä H. pylori
. Sen sijaan, makrofagit voivat edistää mahalaukun patologia. Esimerkiksi, liposomivälitteistä ehtyminen makrofagien lievittää gastriitti aiheuttama H. pylori
infektio [16]. Lisäksi, valikoiva poistaminen I-KB-kinaasin β valkosoluissa, joka estää NF-KB: n näissä soluissa, esti kehittäminen mahalaukun surkastuminen jälkeen H. felis
infektio [45]. Siten makrofagit eivät näytä osallistumaan Helicobacter
välys, vaan saattaa pikemminkin edistää mahalaukun patologian.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että hiirten rokottaminen vastaan ​​ H. pylori
vahvistaa M1 polarisaatio mahalaukun makrofageissa. Samanlainen ilmiö nähdään ihmisen atrofinen gastriitti jossa sekoitettu M1 /​​M2 polarisaatio läsnä mutkaton gastriitti korvataan M1 hallitsemassa polarisaatio. Tämä voi aiheuttaa kasvaimen edistää tulehdusta, ja siirtää makrofagi polarisaatio M1 ja M2 voisi näin ollen edustaa terapeuttinen kohde kroonisen H. pylori
infektio.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hallituksen hyväksymiä eläinten eettisen komitean (Göteborgs djurförsöksetiska nämnd, 328/2008 ja 254 /2009). Alueelliset Ihmisen eettisen komitean Länsi-Götanmaan lääni Ruotsissa (706/03 ja 85/06) hyväksyi tutkimuksen ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Tämä on ainoa viranomainen antaa eettinen lupa tutkimusta ihmisillä Ruotsissa, ja se ei liity suoraan sairaaloihin tai yliopistoihin.

Hiiret

Nainen C57BL /6-hiiriä ostettiin Charles River Laboratories (Sulzfeld, Saksa), tai jos kyseessä on rokotuksen kokeiden Taconic (Ejby, Tanska). Hiiret infektoitiin iässä 8-12 viikkoa.

Bakteerit ja infektio hiirillä

H. pylori
SS1 kasvatettiin Columbia ISO-agarmaljoille ja 2 päivää 37 ° C: ssa, minkä jälkeen ne siirrettiin Brucella liemi, johon on lisätty 5% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja antibiootteja (vankomysiiniä, 10 ug /ml; polymyksiini B , 20 U /ml; trimetopriimi, 5 ug /ml) ja inkuboitiin ravistellen yön yli 37 ° C: ssa mikroaerofiilisissä olosuhteissa. Ennen infektiota, motiliteettia bakteerit vahvistettiin mikroskopialla. Bakteeripitoisuutta arvioitiin spektrofotometrisesti. Hiiret saivat 3 x 10 ^{8 pesäkettä muodostavaa yksikköä SS1 mahansisäisesti.}

Sublingual immunisaation

Hiirille annettiin neljä 10 ui annosta 500 ug H. pylori
lysaatti (valmistettu kannasta Hel305 kuten aikaisemmin on kuvattu [46]), yhdistettiin 10 ug: koleratoksiinin (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ), kielen alle 1 viikon välein [47], [48]. Kaksi viikkoa viimeisen immunisoinnin jälkeen, hiiret altistettiin mahalaukunsisäisesti 3 x 10 ^{8 pesäkettä muodostavaa yksikköä H. pylori
SS1.}

arviointi bakteerikolonisaation

kvantitatiivinen arviointi bakteerikolonisaatiota immunisaatiota kokeissa puolet mahan varovasti pestiin PBS: llä ja homogenoitiin käyttäen Ultra Turrax homogenisaattorilla ( IKA Laboratory Technology, Staufen, Saksa). Sarjalaimennoksia homogenaattia maljattiin Skirrow-agarmaljoille. Kun mahalaukun lamina proprian solut eristettiin koko mahan määrällinen arvio mahalaukun bakteerien kuormitus ei voitu suorittaa. Tässä tapauksessa, vatsa, joka on leikattu pitkin suurempaa kaarta ja pestiin PBS: ssä, oli varovasti siveltiin Skirrow-agarmaljoilla. Läsnäolo H. pylori
pesäkkeet varmistettiin ureaasin testi. Tällä tavoin voitaisiin vahvistaa H. pylori
kolonisaation ja silti käyttää koko mahan solujen eristykseen.

eristäminen mahan lamina proprian solujen

rauhas vatsa leikattiin 5 mm paloiksi ja inkuboitiin kaikkiaan kolme kertaa H.

• PLoS ONE: Tarkkuus ja raja-arvot on Pepsinogeenit I, II ja gastriini 17 Diagnoosi Mahalaukun Fundic surkastuminen: Influence of Gastritis
• PLoS ONE: Bakteeri Microbiota Profilointi gastriitti ilman helikobakteeri-infektion tai steroideihin tulehduskipulääke Use