PLoS Pathogens: Caveolin-1 skyddar B6129 Möss mot Helicobacter pylori Gastritis

Abstrakt

Caveolin-1 (Cav1) är en byggnadsställning protein och patogen-receptor i slemhinnan i mag-tarmkanalen. Kronisk infektion av gastric epitelceller genom Helicobacter pylori
( H. Pylori
) är en viktig riskfaktor för human magcancer (GC) där Cav1 ofta nedregleras. Men funktion Cav1 i H. pylori
infektion och patogenes av GC förblev okänd. Vi visar här att Cav1-brist möss, infekterades under 11 månader med CagA-leverans bristfällig H. pylori
stam SS1, utvecklat mer allvarlig gastrit och vävnadsskador, inklusive förlust av parietalcellerna och foveolar hyperplasi, och visade lägre kolonisering av magslemhinnan än vildtyp B6129 kullsyskon. Cav1-null-möss uppvisade förbättrad infiltrering av makrofager och B-celler och utsöndring av kemokiner (RANTES) men hade minskade nivåer av CD25 ^{+ regulatoriska T-celler. Cav1-brist humana GC-celler (AGS), infekterade med CagA-leverans skickliga H. pylori
stam G27, var känsligare för CagA relaterade cytoskeletala spännings morfologier ( "humming fågel") jämfört med AGS-celler stabilt transfekterade med Cav1 (AGS /Cav1). Infektion av AGS /Cav1 celler utlöste rekryteringen av P120 RhoGTPase-aktiverande protein /borttagna i levercancer-1 (p120RhoGAP /DLC1) till Cav1 och motverkas CagA-inducerad cytoskelettala omdisponeringar. I humana GC cellinjer (MKN45, N87) och mus mage vävnad, H. pylori
nedregleras endogena uttrycket av Cav1 oberoende av CagA. Mekanistiskt, H. pylori
aktiverad sterol-responsiva elementet bindande protein-1 (SREBP1) för att undertrycka transkription av den humana Cav1 genen från sterol-responsiva element (SREs) i den proximala Cav1 promotorn. Dessa data antydde en skyddande roll Cav1 mot H. pylori
inducerad inflammation och vävnadsskada. Vi föreslår att H. pylori
bedrifter nedreglering av Cav1 att undergräva värdens immunsvar och att främja signalering av sina virulensfaktorer i värdceller.}

Författare Sammanfattning

Infektion med bakterien Helicobacter pylori
( H. pylori
) främst drabbar barn i utvecklingsländerna som riskerar att gå vidare till magcancer (GC) som vuxna efter många år av ihållande infektion, särskilt med stammar som är positiva för den onkogen virulensfaktorn CagA. Utrotning av H. pylori Musik av antibiotika är en behandling av val, men kan också förändra känsligheten för allergier och andra tumörtyper. Således är nya diagnostiska eller prognostiska markörer behövs som upptäcka tidiga molekylära förändringar i magslemhinnan under övergången av kronisk inflammation till cancer. I vår studie fann vi att tumörsuppressor caveolin-1 (Cav1) reduceras vid infektion med H. pylori
och CagA var tillräcklig men inte nödvändigt för denna nedreglering. Förlust av Cav1 orsakades av H. pylori
-beroende aktivering av sterol-responsiva elementet bindande protein-1 (SREBP1), och denna händelse avskaffade interaktionen av Cav1 med P120 RhoGTPase-aktiverande protein /deleterad i levercancer-1 (p120RhoGAP /DLC1), en andra bona fide
tumörsuppressorgen i gastrisk vävnad. Slutgiltigt kan Cav1 och DLC1 utgör nya molekylära markörer i H. pylori
infekterade magslemhinnan innan neoplastisk transformation av epitelet

Citation:. Hitkova I, Yuan G, Anderl F, Gerhard M, Kirchner T, Regu S, et al. (2013) Caveolin-1 skyddar B6129 möss mot Helicobacter pylori
gastrit. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. doi: 10.1371 /journal.ppat.1003251

Redaktör: Steven R. Blanke, University of Illinois, USA

emottagen: 23 maj, 2012; Accepteras: 4 februari 2013, Publicerad: 11 april 2013

Copyright: © 2013 Hitkova et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie stöddes av bidrag till EB och MPAE från Deutsche Krebshilfe (108.287) och DFG (BU-2285). MPAE stöds också av bidrag från Deutsche Krebshilfe (107.885), DFG (SFB 824, TP B1), Else Kröner Stiftung (Nr P14 /07 //A104 /06) och BMBF (Mobimed 01EZ0802,. KMU-innovativ Ingen 0315116B Den finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

konkurrerande intressen:.. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori
( H. pylori
) är en gramnegativ bakterie som koloniserar magsäcken på ca. 50% av världens befolkning och ökar risken för utveckling av kronisk gastrit, magsår, magslemhinnan associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom, slemhinneatrofi och magcancer (GC) [1], [2]. Baserat på denna etiologi, H. pylori
har klassificerats som en klass i cancerframkallande ämne av Världshälsoorganisationen (WHO) 1994 [3].

de två stora H. pylori
gifter [4], CagA och VacA är internaliseras i magsäcken epitelceller genom injektion via den bakteriella typ IV sekretionssystem (CagA) [5] eller genom direkt insättning i lipidaggregat (VacA) [6], [7]. Lipidaggregat är kolesterol och sfingolipid rika mikrodomäner av plasmamembranet [8], [9], som utnyttjas av många patogener, inklusive virus, parasiter och bakterier, för att underlätta upptagningen av hela organismer och /eller internalisering av gifter i värdceller [ ,,,0],10], [11], [12]. Till exempel, Neisseria spec
. använder lipidaggregat och Rho-förmedlad signalering av aktincytoskelettet att få tillträde till cytosolen [13]. Pseudomonas aeruginosa
exploits lipidaggregat associerade Toll-like receptors 2 för infektion av lungepitelceller [14].

Caveolin-1 (Cav1) är den 21-24 kDa stora och väsentliga strukturella proteinet av caveolae, en specialiserad form av lipidaggregat mikroområden. Caveolae är 50-100 nm kolv /tubformade invaginationer av plasmamembranet rikligt i makrofager, endotelceller och glatta muskelceller, typ I pneumocyter och adipocyter, där de deltar i cellulära transportprocesser inklusive endocytos, kolesterol utflödet och membrantrafik [15] [16]. I detta sammanhang kan Cav1 också fungera som en hämmare av clathrin oberoende endocytos och blockera patogen /toxin upptagning [17], [18]. Genom att binda till sin byggnadsställningar domän, Cav1 hämmar direkt en uppsjö av receptorer och enzymer inklusive tyrosinkinaser i Src och Ras familj, G-proteiner och kväveoxidsyntaser [15]. I tillägg till en roll i membrantrafik, Cav1 utgör således en styrplattform för reglering av cellproliferation och överlevnad [19]. Cav1 utövar också en viktig funktion i cellrörlighet och migration och inom epitel, stromala och endotelceller vävnader, genom att tillämpa cell-cellkontakter, cellmatris adhesion och immunsvar [20], [21], [22], [23] .

Cav1 binder direkt kolesterol, och transkription av Cav1 regleras negativt av transkriptionsfaktorn sterol-responsiva elementet bindande protein-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 är bunden till det endoplasmatiska retiklet (ER) som en inaktiv 125 kDa prekursor och aktiveras under betingelser av kolesterol-brist genom proteolytisk klyvning i Golgi-apparaten. Denna klyvning följs av translokation av den aktiva kDa SREBP1 68 in i kärnan där det binder till sterol-responsiva element (SREs) av målgener, inklusive Cav1, som deltar i syntesen av kolesterol och fettsyror [25]. H. pylori
har visats att metabolisera kolesterol från värdcellmembranet, och värd kolesterol förändrar de onkogena egenskaperna hos CagA [26], [27].

hypothesized Vi därför att kolesterol bindande proteiner SREBP1 och Cav1 är mål för H. pylori
infektion och /eller effektorfunktioner. Specifikt frågade vi om (i) H. pylori
utnyttjar Cav1 att underlätta injektion och nedströms signalering av CagA i gastric epitelceller eller (ii) Cav1 fungerar som ett skyddande "barriär-driva" protein som motverkar sjukdom framkallad av H. pylori
. För att testa detta, fenotyperna som resulterar från H. pylori
infektion studerades i Cav1-brist möss och humana GC cellinjer. Våra data visar att Cav1 skyddade B6129 möss mot H. pylori
-relaterade gastrit och vävnadsskada In vivo
oberoende av CagA. H. pylori
också aktiveras SREBP1 och nedreglerade expression av mus och human Cav1 oberoende av CagA. Dessutom Cav1 motverkas CagA-beroende cytoskelettala omdisponeringar In vitro Musik av rekryteringen av tumörsuppressor bort i levercancer-1 (DLC1).

Material och metoder

Etik uttalande

djur~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP genomfördes i samförstånd med de etiska riktlinjerna för Technische Universität München (tyska djurskyddslagen, Deutsches Tierschutzgesetz) och hade godkänts (7.2-1-54-2531-74-08) av regering Bayern

Djur

Homozygot Cav1 knockout (Cav1-KO) (stam Cav1tm1Mls /J, lagernummer 004.585) (Regierung von Obb, München, Tyskland.). och matchad kontrollgrupp vilda -typ (WT) (stam B6129SF2 /J, lagernummer 101045) möss (8 veckor) erhölls från Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) och hölls på en blandad bakgrund i en patogen-fri mus anläggning [28], [ ,,,0],29]. Experimentell magsår utfördes med indometacin som publicerats före [30]. Infektion av möss med mus-anpassad CagA /VacA-leverans bristfällig H. pylori
stam SS1 utfördes genom oral sondmatning som beskrivits [31]. Den genomsnittliga tiden möss från olika genetiska bakgrunder (C57BL /6, B6129, BALB /c) tar att gå vidare till kronisk gastrit och bortom (gastric atrofi, hyperplasi, dysplasi) [32] varierar mellan 10 och 15 månader efter infektion med standardiserade referens stam SS1 [28], [33], [34], [35]. Vi bestämde oss därför för att utföra vår analys inom denna tidsram.

Reagens

kemikalier var från Merck (Darmstadt, Tyskland) eller Sigma (Taufkirchen, Tyskland). Polyklonala antisera var SREBP1 (# PA1-46142, Thermofisher Scientific, Waltham, MA), Cav1 (N-20, sc-894), SREBP1 (C-20, sc-366), CagA (b-300, SC-25766) , FAK (A-17, SC-557), fosfor-FAK (Tyr-397, SC-11765), Hsp90 alfa /beta (H-114, SC-7947), Lamin A /C (H-110, SC- 20681, allt från Santa Cruz Biotech., CA), allmän och fosfor ERK1 /2 (P44 /P42), p38, JNK (alla från Cell Signaling, Danvers, MA) och Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Hamburg, Tyskland ). Musmonoklonala antikroppar var Cav1 (ɢ406) och fosfo-Cav1 (pY14,ɣ338) (båda från BD /Transduction Lab., San José, CA), DLC-1 (C-12, sc-271915) och beta-aktin (AC-15, sc-69879) (båda från Santa Cruz Biotech.). Makrofagen specifika rått-anti-mus-F4 /80-antikropp (# MF48000) erhölls från Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). Kyckling anti- H. pylori
polyklonal Ab användes såsom beskrivits [36]. Serum cytokiner mättes med ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) enligt tillverkarens anvisningar. Pull-down-analyser för de små GTPases Rho /Rac /Cdc42 köptes från BIOCAT (Heidelberg, Tyskland).

Cellodling

humana embryonala njur (HEK293), Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK), föräldra humana GC cellinjer (AGS, MKN45, N87) (alla från American Type Culture Collection, Rockville, MD) och stabilt transfekterade kloner genererade detta bibehölls såsom beskrivits tidigare [37]. Infektion av celler med cellanpassade CagA-leverans skickliga H. pylori
stam G27 utfördes som tidigare [36].

DNA-konstruktioner

Expressionsplasmiden pEGFP-CagA nämndes någon annanstans [38]. Den ~800 bp fragment av den proximala human Cav1 promotorn (AF019742, Läge 69-859) [24] amplifierades genom PCR från genomiskt DNA från human normal lever och klonades in i Kpnl /Hindlll-ställena i pGL3-luc luciferas reporterplasmid ( Promega GmbH, Mannheim, Tyskland). Isoform 4 av den humana DLC1 mRNA [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) amplifierades från humana hepatom HepG2-celler och sattes in i BamHI /Notl-ställena i uttrycksvektorn pTARGET (pT, Promega GmbH). Övergående transfektion och luciferas analyser utfördes som tidigare [37]

Bakteriell kultur

H.. pylori
SS1 och G27 bakterier utvanns från -80 ° C glycerolstamlösningar och odlas på Wilkins-Chalgren (WC) blodagarplattor enligt mikroaerob betingelser (10% CO2, 5% O2, 85% N2; 37 ° C) för 2-3 dagar. Musen anpassade H. pylori
SS1 skördades från agarplattor för In vivo
infektioner som tidigare [31] publicerades. SS1 stammen var PCR-positiva för cagA
genen och mRNA men inte injicera funktionellt CagA protein [40] som framgår av frånvaron av "nynna fågel" fenotyp i infekterade AGS-celler (data visas ej) . Cellanpassade H. pylori
bakterier CagA-leverans skickliga G27 wt och sälja den CagA-deletionsmutant G27 Delta cagA
skördades från agarplattor och därefter odlas i kontinuerlig samodling med MDCK-celler som beskrivs [36].

Ex vivo
kvantifiering av kolonibildande enheter (CFU) katalog

Hela magar skars ut från möss, och kolonibildning bestämdes väsentligen såsom beskrivits [31] . En antral remsa av magen vägdes, placerades i 5 ml Brucella-buljong och virvlades under 10 min. Utspädningar av 1:10, 1:100 och 1:1000 framställdes och 100 pl av varje spädning ströks ut på H. pylori
-selektiv WC blodagarplattor. Antalet bakteriekolonier bestämdes efter 5 dagar och normaliserad till vikten av motsvarande magen bitar.

Behandling av mus gastric vävnads

Den återstående magen tvättades med sterilt vatten. En antral remsa skars, frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C tills RNA-extraktion. Resten av magen placerades i 3 ml av 4% (vikt /volym) paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkuberades under 24 h vid 4 ° C. Därefter magen skärs längs den större och mindre krökning i två halvor, följt av dehydrering och inbäddning i paraffin för histologisk analys.

Gentamycin skyddsanalys

Celler infekterades med H. pylori
G27 stam i 2 till 24 h vid en infektionsmultiplicitet (MOI) på 500:1. Därefter tvättades cellerna tre gånger med PBS för att avlägsna kvarvarande bakterier och var dessutom inkuberades under 2 h vid 37 ° C i en fuktig atmosfär i DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella-buljong) kompletterad med gentamycin (200 | ig /ml ), penicillin /streptomycin (100 | ig /ml) och kloramfenikol (100 | ig /ml). Avsaknad av extracellulära bakterier bekräftades under mikroskop, och cellerna därefter lyser för detektion av intracellulär CagA med Western blöt (WB).

Coimmunoprecipitation (CoIP) och Western blot (WB) Review

detektion av immunoprecipiterade proteiner genom SDS-PAGE och WB utfördes såsom tidigare [41]. Matrix-assisted Laser Desorption /lonization masspektrometri (MALDI-MS) beskrevs i detalj i [29].

Immunofluorescens

färgning utfördes i trippelfärgläge visualisera 4,6- diamidino-2-fenylindol (DAPI), Alexa-488 och -594 använder en digitalkamera ansluten (AxioVision släpp 4,4) fluorescensmikroskop (Axiovert 200M, Carl Zeiss GmbH, Hallbergmoos, Tyskland). Konfokalmikroskopi (Axiovert 40, Zeiss) och 3D-rekonstruktion av H. pylori
infekterade celler med LSM510 (Zeiss) och Volocity (Improvisation, Tübingen, Tyskland) gjordes som tidigare [37].

Histopatologisk utvärdering och immunohistokemi (IHC) Review

Kronisk aktiv gastrit definierades av den samtidiga närvaron av både neutrofil polymorphnuclear (PMN) och mononukleära celler (lymfocyter och plasmaceller) i magslemhinnan. Aktiv (PMN) och kronisk (mononukleära) infiltrat bedömdes enligt följande: Paraffininbäddade gastric vävnad skars i 3 pm sektioner med hjälp av en halvautomatisk mikrotom (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland). Sektionerna färgades sedan med hjälp av Hematoxylin & Eosin (H & E) lösningar. Den histopatologiska analyser genomfördes av tre patologer (CR, SR, TK) blinda för studie setup. Morfologiska förändringar i magslemhinnan klassificerades enligt det uppdaterade Sydney systemet [32], [42]. Graden av gastrit poängsattes baserat på tätheten av intramucosal inflammatoriska infiltrat från mononukleära och PMN-celler som offentliggjorts före [43]: ingen (0), mild (1+), måttlig (2+) och svår (3+). Dessutom, hyperplastisk eller regenerativ epitelceller förändringar, var förlusten av parietalcellerna och frekvensen av lymfoida folliklar eller lymfoida aggregat noteras. Intensiteten i H. pylori
kolonisering i magslemhinnan registrerades som mild (få och enkla bakterier i en slumpmässig fördelning), måttlig (singel och klustrade bakterier i en diskontinuerlig fördelning) och allvarliga (täta bakteriekluster som täcker magslemhinnan i kontinuerliga skikt). Flera tiotals olika regioner i magen bestämdes. Immunohistokemi (IHC) utfördes på paraffinsektioner som beskrivits tidigare [44].

Elektro rörlighet shift assay (EMSA), kromatin immunoprecipitation (chip), omvänd transkription PCR (RT-PCR) och kvantitativ PCR (qPCR)

ChIP (Kit från Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Tyskland) och alla andra metoder utfördes såsom beskrivits tidigare [45]. Oligonukleotider är listade i tabell S1.

cellulära analyser

Viabiliteten av vidhäftande celler mättes med 1- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) 3,5-difenyl-formazan (MTT ) analys (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) såsom rekommenderas av tillverkaren. För att bestämma celladhesion, var 1 x 10 ^{4-celler såddes i sex cm cellodlingsskålar för en till 6 timmar följt av upprepad tvättning med PBS. De återstående vidhäftande cellerna fixerades med 4% (vikt /volym) PFA i PBS, färgades med kristallviolett och därefter räknades med användning av ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Sårläknings analyser utfördes väsentligen såsom beskrivits i [46]. I korthet odlades celler till konfluens i 6 cm skålar och en 5 mm scratch infördes i monoskiktet med ett inverterat blå spets följt av inkubation av cellodlingsplattor för ytterligare 24, 48 och 72 h. Sårtillslutning övervakades vid fixering och färgning av celler med kristallviolett använder ljusfältsmikroskopi (Axiovert 200M, Carl Zeiss GmbH).}

Statistik

Resultat är medelvärden ± S.E. från minst 5 djur per genotyp eller 3 oberoende experiment från olika cellpassager. Mjukvaran GraphPad Prism (version 4,0, La Jolla, CA) användes för att analysera data. P-värden (* p < 0,05) beräknades med användning av Students t och Fisher Exakta test

numren

Human: Cav1. NM_001753.4, Q03135; B2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta-aktin: P60709; Lamin A: P02545; Lamin C: P02545; Hsp90 alpha: P07900; Hsp90 beta: P08238; ERK1 (p44): P27361; ERK2 (p42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Mus: Cav1: NM_007616.4, P49817; B2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNFalpha: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Hund: B2M: NC_006612, XP_850148; H. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB. YP_626814.1, Q1CV82

Resultat

Cav1-brist möss visar förbättrad gastrit vid infektion med CagA-leverans inkompetent H. pylori
SS1

För att bedöma de histologiska förändringar som induceras i gastrisk vävnad på H. pylori
infektion, B6129 WT och Cav1-KO-möss infekterades med musen anpassade och CagA-leverans bristfällig H. pylori
stam SS1. Mössen avlivades 11 månader senare, och H. pylori
isolerades från opererande magen vävnad [31]. Cav1-KO möss visade mindre bakteriell kolonisering av magslemhinnan än WT möss (7,3 ± 2,4 WT kontra
1,6 ± 0,5 KO × 10 ^{3 CFU /mg mage vävnad, * p = 0,0141; n = 15 per genotyp) (Fig. 1A). Histopatologisk analys visade att både WT och Cav1-KO möss utvecklade aktiv kronisk gastrit åtföljas av infiltration av mononukleära och polymorphnuclear (PMN) celler i magslemhinnan (Fig. 1B). I kontrast, oinfekterade WT- och Cav1-KO-möss hade ingen intramucosal inflammation (data ej visade). I stället var gastrit markant förbättras i H. pylori
infekterade Cav1-KO-möss jämfört med infekterade WT möss (Fig. 1C). I Cav1-KO möss, den genomsnittliga poängen för gastrit (0,7 ± 0,2 WT kontra
1,7 ± 0,1 KO, * p = 0,0002, n = 15 per genotyp) var allvarligare (tabell 1) än i WT möss och magslemhinnan uppvisade intramucosal B-cells folliklar, foveolar hyperplasi och förlust av parietalceller. Dessa data tyder på att Cav1-brist är förknippad med en ökad inflammatorisk reaktion i magslemhinnan och en mindre effektiv kolonisering av H. pylori
.}

Cav1-brist främjar rekryteringen av makrofager i den infekterade magslemhinnan

För att bedöma identiteten av immunceller som bidrar till H. pylori
-relaterade inflammation i Cav1-KO möss, RT-qPCR analys av utvalda cytokiner, ytmarkörer och kemokiner utfördes (Fig. 2A). I överensstämmelse med den observerade inflammation, H. pylori
SS1 inducerat uttryck av TNFalpha och IFNgamma i magslemhinnan av både WT och KO-möss. Dessutom konstaterade vi en ökad mRNA-uttryck av CD19 (B-celler) (1,6 ± 0,3 WT kontra
3,3 ± 0,9 KO, p = 0,0512, n = 15 per genotyp) och RANTES (CCL5) (1,3 ± 0,2 WT kontra
2,1 ± 0,6 KO, p = 0,0449, n = 15 per genotyp) i gastric vävnad H. pylori
infekterade Cav1-KO-möss jämfört med infekterade WT möss. I motsats härtill var mRNA-nivåer av CD4 (T-hjälparceller), CD25 (T-regulatoriska celler) och CD86 (antigenpresenterande celler) undertrycks av H. pylori
oberoende av Cav1 status. Immunohistokemi (IHC) upptäckt en markant ökning av intramucosal F4 /80-positiva makrofager i gastric vävnad av infekterade Cav1-KO-möss jämfört med WT syskon (Fig. 2B). CD3-positiva lymfocyter var belägna runt och inom intramucosal folliklar (data ej visade).

Liknande resultat erhölls från experiment som inför snabb gastrisk skada i möss genom injektion av indometacin [30] (Fig.S1). I överensstämmelse med den förbättrade vävnadsskador i Cav1-KO magar (* p = 0,0161, WT kontra
KO, n = 9 per genotyp), som kännetecknas av inflammation, erosion och sår, Cav1-brist möss uttryckte också högre belopp av mRNA som kodar för såret att läka proteiner trefoil faktor-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT kontra
2,3 ± 0,4 KO, * p = 0,0048, n = 9 per genotyp) och peroxisom proliferator-aktiverad receptor gamma (PPARG) (0,6 ± 0,2 WT kontra
2,5 ± 0,5 KO, * p = 0,0008, n = 9 per genotyp). Sammanfattningsvis dessa data indikerade att förlusten av Cav1 ökar mottagligheten hos möss till gastric inflammation och vävnadsskada.

Cav1 varken förändrar vidhäftning av H. pylori
stammar till eller överlevnad av humana GC celler

För att bedöma funktionen hos Cav1 under H. pylori
infektion In vitro
den humana gastriska epitelceller linje AGS användes som hade transfekterats stabilt med Cav1 expressionsplasmiden (AGS /Cav1) eller tom vektor (AGS /EV) [37]. Först undersökte vi om Cav1 påverkar cellöverlevnad på H. pylori
infektion (Fig. 3A). AGS-kloner med och utan Cav1 infekterades under 48 timmar med cellanpassade CagA-leverans kompetent H. pylori
stam G27 vid olika multipliciteter av infektion (MOI) som sträcker sig från 1:100 till 1:2000. Kolorimetriska MTT-analyser visade att Cav1 hade ingen effekt på total överlevnad av AGS-celler på H. pylori
infektion. Liknande resultat erhölls med CagA-leverans inkompetent H. pylori
SS1 och med Western blöt (WB) analys att detektera uttrycket och fosforyleringen av överlevnads kinaser (AKT /PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (data visas ej). Eftersom båda H. pylori Mössor och Cav1 samverkar inom lipidaggregat, frågade vi om vidhäftning av bakterier till celler beror på närvaron av Cav1. AGS /Cav1 och AGS /EV-celler infekterades (MOI = 10) med G27 (fig. 3B, C) eller SS1 (data ej visade) bakterier under 30 min, följt av tvättning och efterföljande inkubering i färskt medium under 2 timmar. Därefter färgades cellerna för immunfluorescensmikroskopi, och antalet bakterier som vidhäftade till Cav1-uttryckande eller tom vektor-transfekterade celler räknades (Fig. 3B, C). Inga skillnader i vidhäftning observerades mellan AGS /Cav1 och AGS /EV-celler, vilket antyder att Cav1 inte påverkar vidhäftningen av H. pylori
bakterier till värdceller.

Cav1 skyddar humana GC-celler mot CagA-inducerad omlagring av cytoskelettet

Bildandet av nålliknande utsprång ( "humming fågel") är ett typiskt morfologisk fenotyp av AGS-celler som svar på infektion med CagA-leverans skickliga H. pylori
stammar och translokation av CagA i cytosolen [47]. Att undersöka betydelsen av Cav1 i denna stress-inducerad ombildning av aktin cytoskelettet, var AGS /Cav1 och AGS /EV infekterade under 16 timmar med H. pylori
G27 wt
eller isogena mutant Delta cagA
(MOI = 100). Infekterade celler färgades såsom beskrivits ovan, och antalet långsträckta AGS celler bestämdes (Fig. 4A, B). Cav1-brist AGS celler visade betydligt mer långsträckta morfologier än Cav1-uttryckande celler (11 ± 0,8% AGS /EV kontra iPhonen 4 ± 0,8% AGS /Cav1; * p = 1,1 x 10 ^{-8; n = 3 per klon). Som väntat var ingen "surrfågel" fenotyp som erhållits i celler infekterade med CagA-leverans bristfällig SS1 eller CagA-deletionsmutant G27 Delta CagA
stammar som är både oförmögen att injicera funktionellt CagA-protein i värdceller (data ej visade). AGS /EV-celler producerade också mer IL8 mRNA på H. pylori
G27 infektion än AGS /Cav1 celler (64 ± 19 EV kontra
19 ± 6 Cav1; * p = 0,0176, n = 3 per klon) (Fig. 4C). Dessa data indikerade att Cav1 skyddar mot CagA relaterad cell stress.}

Till stöd för dessa resultat, celladhesion och lindade stängning var mer uttalad i AGS /Cav1 jämfört med AGS /EV-celler (Fig.S2). I överensstämmelse med dess funktion som ett målprotein för CagA och komponent av fokala sammanväxningar [48], WB analyser (fig. 4D) detekterade också högre nivåer (0,4 ± 0,1 AGS /EV kontra
1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 * p = 0,0012, n = 3 per klon) av fosforylerad fokaladhesion kinas (FAK) i Cav1-uttryckande celler infekterade med H. pylori
G27. Dessa data bekräftade att AGS /Cav1 celler infekterade med CagA-leverans kompetent H. pylori
behållit sin utspridda epitelial form jämfört med det stressade avlånga fenotypen av Cav1 /EV-celler.

CagA-leverans kompetent H. pylori
G27 utlöser bindning av p120RhoGAP /DLC1 till Cav1 i humana GC celler

Cav1 har visat sig fosforyleras av cytosoliska tyrosinkinaser (Src, Abl) vid tyrosin 14 [49], och fosforylerad Cav1 och src båda aktivera de små GTPases Rho /Rac /cdc42 som reglerar cytoskelettala funktioner [13], [50]. För att identifiera den underliggande molekylära mekanismen hur Cav1 skyddar mot CagA relaterad cellstress, bedömde vi de signalvägar som initierats av CagA-leverans skickliga H. pylori
G27. Infektion av AGS-celler framkallade en snabb fosforylering av Cav1 i AGS /Cav1 cellerna och av Src i båda AGS /Cav1 och AGS /EV-celler. Detta resultat indikerade att Cav1 agerar nedströms om CagA beroende Src-aktivering men uppströms om aktivering av de små GTPaser (Fig. 5A, B). I överensstämmelse med denna slutsats, proteinnivåer av fosforylerad JNK, som är bosatt Nedan Src, var högre i AGS /EV-celler jämfört med AGS /Cav1 celler.

Vi kunde inte upptäcka en direkt interaktion eller kvantitativ samlokalisering av CagA protein eller H. pylori
G27 bakterier med Cav1 i CoIP eller immunfluorescensexperiment (Fig. 6A, B). Gentamycin analyser skydd visade att den totala mängden insprutat intracellulär CagA var också oberoende av Cav1 närvaro (Fig. 6C). Således Cav1 varken hämmade adhesion av H. pylori
bakterier till eller injektion av CagA i värdcellen, utan snarare minskat nedströms effekterna av CagA på intracellulär signalering.

För att identifiera en kandidat protein som ger skydd mot CagA i en Cav1 beroende sätt framställdes en proteininteraktion skärm baserat på MALDI-MS utfördes (fig. 7A). AGS /Cav1 celler infekterades under 16 timmar med H. pylori
G27 (MOI = 100) följt av lys av cellerna vid rumstemperatur i MES-buffrad 1% (vol /vol) Triton-X100. Proteinband utfällda genom Cav1 antiserum visualiserades genom silverfärgning, och peptider identifierades genom MALDI-MS som tidigare [29] publicerats. En proteinfragment av ~95 kDa innehöll peptider motsvarande variant 4 av P120 Rho GTPas-aktiverande protein /raderas i levercancer-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], en tumörsuppressor i samband med fokala sammanväxningar och caveolae /lipidaggregat [53]. DLC1 variant 4 (DLC1v4) har en förutsagd storlek på ~110 kDa och anrikades i prover från celler som hade infekterats med H. pylori
G27 jämfört med oinfekterade celler (Tabell S2). Dessa resultat bekräftades genom CoIP av Cav1 och endogent DLC1 protein i AGS /Cav1-celler (fig. 7B), vilket indikerar att H. pylori
G27 framkallade en specifik rekrytering av DLC1 till Cav1 i infekterade humana gastriska epitelceller.

Detta resultat fick oss att amplifiera cDNA av variant 4 av humant DLC1 [39] från humant hepatom HepG2-celler (Fig . 7C). CDNA sattes in i expressionsvektorn pTargeT (pT-DLC1v4) följt av övergående transfektion in i föräldra AGS eller HEK293-celler för 24 timmar. WB-analyser detekterades uttryck av ett protein ~110 kDa, i överensstämmelse med den förutsagda storleken för DLC1v4 [39]. Transient transfekterade AGS-celler infekterades sedan med H. pylori
G27 (MOI = 100) för ytterligare 16 timmar. Immunofluorescensfärgning avslöjade att DLC1 i sig
hämmade inte bildandet av CagA-inducerade "surrfågel" fenotyp (19 ± 2% AGS /DLC1 kontra
19 ± 2% AGS /EV; n = 3 per klon) jämfört med tom vektor-transfekterade celler (Fig. 8A, B). Istället DLC1 främjade cellspridning (20 ± 3% AGS /DLC1 kontra
11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067, n = 3 per klon) som överensstämmer med dess roll i regleringen av fokala sammanväxningar [ ,,,0],pylori
stammar. H. H. pylori
infektion. pylori
.

• PLOS ONE: Förhöjda Interleukin-32 Expression är associerad med Helicobacter pylori-Related gastrit
• PLOS ONE: Riktad Radering av Kcne2 orsakar gastrit cystica profunda och Gastric neoplasi