PLoS Pathogens: Caveolin-1 beschermt B6129 muizen tegen Helicobacter pylori Gastritis

Samenvatting

Caveolin-1 (Cav1) een scaffold eiwit en pathogeen receptor in het slijmvlies van het maagdarmkanaal. Chronische infectie van de maag epitheelcellen door Helicobacter pylori
( H. Pylori
) is een belangrijke risicofactor voor menselijke maagkanker (GC), waar Cav1 vaak down-gereguleerd. De functie van Cav1 in H. pylori
infectie en pathogenese van GC bleef onbekend. We tonen hier dat Cav1-deficiënte muizen, geïnfecteerd gedurende 11 maanden met de CagA-delivery deficiënte H. pylori
stam SS1, ontwikkeld meer ernstige gastritis en weefselschade, met inbegrip van het verlies van de pariëtale cellen en foveolar hyperplasie, en weergegeven lager kolonisatie van het maagslijmvlies dan wild-type B6129 nestgenoten. Cav1-null muizen vertoonden verhoogde infiltratie van macrofagen en B-cellen en uitscheiding van chemokines (RANTES), maar had niveaus verlaagd van CD25 ^{+ regulatoire T-cellen. Cav1-deficiënte menselijke GC cellen (AGS), besmet met het CagA-delivery bedreven H. pylori
stam G27, waren gevoeliger voor-CagA gerelateerde cytoskelet spanning morfologie ( "zoemende vogel") in vergelijking met AGS-cellen die stabiel getransfecteerd met Cav1 (AGS /Cav1). Infectie van AGS /Cav1 cellen leidde tot de recrutering van p120 RhoGTPase-activerend eiwit /verwijderd in leverkanker-1 (p120RhoGAP /DLC1) naar Cav1 en tegengewerkt-CagA geïnduceerde herschikkingen van het cytoskelet. In de menselijke GC cellijnen (MKN45, N87) en de maag muis weefsel, H. pylori
down-gereguleerd endogene expressie van Cav1 onafhankelijk van CagA. Mechanistisch, H. pylori
geactiveerde sterol-responselement-bindend eiwit-1 (SREBP1) om transcriptie van het humane gen van Cav1 sterol-reagerende elementen (SRE) in de proximale Cav1 promoter onderdrukken. Deze data suggereerde een beschermende rol van Cav1 tegen H. pylori
geïnduceerde ontstekingen en weefselschade. Wij stellen voor dat H. pylori
exploits down-regulatie van Cav1 om de immuunrespons van de gastheer te ondermijnen en signalering van de virulentie factoren in gastheercellen te promoten.}

Auteur Samenvatting

Besmetting met de bacterie Helicobacter pylori
( H. pylori
) treft vooral kinderen in de ontwikkelingslanden, die het risico lopen op weg naar maagkanker (GC) als volwassenen na vele jaren van aanhoudende infectie, vooral met stammen die positief zijn voor zijn de oncogene virulentie factor CagA. Uitroeiing van H.
pylori met antibiotica is een voorkeursbehandeling maar ook de gevoeligheid voor allergieën en andere tumorsoorten veranderen. Aldus worden nieuwe diagnostische of prognostische merkers vereist die vroege moleculaire veranderingen in het maagslijmvlies bij de overgang van chronische ontsteking kanker te ontdekken. In onze studie vonden we dat de tumor suppressor caveolin-1 (Cav1) gereduceerd na infectie met H. pylori
en CagA was voldoende maar niet noodzakelijk voor deze neerwaartse regulatie. Verlies van Cav1 werd veroorzaakt door H. pylori
afhankelijke activering van sterol-responsief element-bindend eiwit-1 (SREBP1) en deze gebeurtenis schafte de interactie van Cav1 met p120 RhoGTPase-activerend eiwit /geschrapt leverkanker-1 (p120RhoGAP /DLC1), een tweede bona fide
tumor suppressor in de maag weefsel. Overtuigend, kan Cav1 en DLC1 nieuwe moleculaire markers in de H vormen. pylori
geïnfecteerde maagslijmvlies vóór neoplastische transformatie van het epitheel

Visum:. Hitkova I, Yuan G, Anderl F, Gerhard M, Kirchner T, Reu S, et al. (2013) Caveolin-1 Beschermt B6129 muizen tegen Helicobacter pylori
Gastritis. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. doi: 10.1371 /journal.ppat.1003251

Redactie: Steven R. Blanke, Universiteit van Illinois, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 23 mei 2012; Aanvaard: 4 februari 2013; Gepubliceerd: 11 april 2013

Copyright: © 2013 Hitkova et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies aan EB en MPAE van de Deutsche Krebshilfe (108.287) en DFG (BU-2285). MPAE wordt ook ondersteund door subsidies van de Deutsche Krebshilfe (107.885), DFG (SFB 824, TP B1), Else Kröner Stiftung (Nr P14 /07 //A104 /06) en BMBF (Mobimed 01EZ0802;. KMU-innovativ No 0315116B The financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Helicobacter pylori
( H. pylori
) is een Gram-negatieve bacterie die magen van ong. 50% van de wereldbevolking koloniseert en verhoogt het risico op ontwikkeling van chronische gastritis, maagzweren, gastrische mucosa-geassocieerde lymfeweefsel (MALT) lymfomen, mucosale atrofie en maagkanker (GC) [1], [2]. op basis van deze etiologie H. pylori
is ingedeeld als een klasse I carcinogeen door de World Health Organisation (WHO) in 1994 [3].

de twee belangrijkste H. pylori
giftige stoffen [4], CagA en Vaca worden geïnternaliseerd in de maag epitheelcellen door injectie via het bacteriële type IV secretie systeem (CagA) [5] of door directe insertie in lipide rafts (VacA) [6], [7]. Lipide vlotten zijn cholesterol en sfingolipide-rijke microdomeinen van het plasmamembraan [8], [9], die worden geëxploiteerd door vele pathogenen, waaronder virussen, parasieten en bacteriën, om opname van hele organismen en /of internalisering van toxine in gastheercellen vergemakkelijken [ ,,,0],10], [11], [12]. Bijvoorbeeld, Neisseria spec
. gebruikt lipid rafts en Rho-gemedieerde signalering van het actine cytoskelet om toegang tot het cytosol [13] te verkrijgen. Pseudomonas aeruginosa
exploits lipide-raft geassocieerd toll-like receptor 2 voor infectie van de longen epitheelcellen [14].

Caveolin-1 (Cav1) is het 21-24 kDa grote en essentiële structurele eiwit van caveolae, een gespecialiseerde vorm van lipid raft microdomeinen. Caveolae zijn 50-100 nm kolf /buisvormige instulpingen van de plasmamembraan rijk aan macrofagen, endotheelcellen en gladde spiercellen, type I pneumocyten en adipocyten, waar zij deelnemen aan cellulaire transportprocessen waaronder endocytose, cholesterol efflux en membraan verkeer [15] , [16]. In dit verband kan Cav1 ook fungeren als een remmer van clathrine afhankelijke endocytose en blok pathogeen /toxine opname [17], [18]. Door binding aan de steigers domein, Cav1 direct remt een overvloed aan receptoren en enzymen zoals tyrosine kinasen van de Src en de Ras familie G-proteïnen en stikstofoxide synthase [15]. Naast een rol in membraan verkeer, Cav1 vormt dus een controle platform voor regulering van celproliferatie en overleving [19] cellen. Cav1 oefent ook een belangrijke rol in celmotiliteit en migratie en binnen epitheliale, stromale en endotheliale weefsels, door het handhaven cel-cel contacten, cel-matrix adhesie en immuunreacties [20], [21], [22], [23] .

Cav1 direct bindt cholesterol en transcriptie van Cav1 wordt negatief gereguleerd door de transcriptiefactor sterol-responsief element-bindend eiwit-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 is gebonden aan het endoplasmatisch reticulum (ER) als een inactieve precursor 125 kDa en onder omstandigheden van cholesterol deficiëntie wordt geactiveerd door proteolytische splitsing in het Golgi-apparaat. Deze splitsing wordt gevolgd door translocatie van het actieve 68 kDa SREBP1 naar de kern waar het bindt aan sterol-reagerende elementen (SRE) van doelgenen, waaronder Cav1 betrokken bij de synthese van cholesterol en vetzuren [25]. H. pylori
is aangetoond dat cholesterol metaboliseren van het gastheercelmembraan en gastheercellen cholesterol verandert de oncogene eigenschappen van CagA [26], [27].

Daarom veronderstelden dat de cholesterol-bindende eiwitten en SREBP1 Cav1 zijn doelwit van H.
pylori infectie en /of effectorfuncties. In het bijzonder, we vroegen of (i) H. pylori
exploits Cav1 injectie en stroomafwaartse signalering van CagA in maagepitheelcellen of (ii) Cav1 fungeert als een beschermende "barrière handhaving" eiwit dat ziekten opgewekt door H tegengaat vergemakkelijken. pylori
. Wordt de fenotypes die resulteren uit H testen.
pylori infectie werden bestudeerd in Cav1-deficiënte muizen en humane cellijnen GC. Onze gegevens bleek dat Cav1 beschermd B6129 muizen tegen H. pylori
gerelateerde gastritis en weefselschade In vivo
onafhankelijk van CagA. H. pylori
ook geactiveerd SREBP1 en down-gereguleerde expressie van muizen en menselijke Cav1 onafhankelijk van CagA. Bovendien Cav1 tegengegaan CagA-afhankelijke herschikkingen van het cytoskelet in vitro
door rekrutering van de tumor suppressor geschrapt leverkanker-1 (DLC1).

Materialen en Werkwijzen

Ethics statement

Animal studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Technische Universität München (Duitse Animal Welfare Act, Deutsches Tierschutzgesetz) en was goedgekeurd (7.2-1-54-2531-74-08) door de regering van Beieren

Dieren

Homozygote Cav1 knockout (Cav1-KO) (stam Cav1tm1Mls /J; voorraad nummer 004.585) (Regierung von Obb, München, Duitsland.). en gematchte controlegroep wild type (WT) (stam B6129SF2 /J; voorraadnummer 101.045) muizen (8 weken) werden verkregen van het Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) en gehandhaafd op een gemengde achtergrond in een pathogeenvrije muis faciliteit [28], [ ,,,0],29]. Experimentele maagzweren werd uitgevoerd met indomethacine zoals gepubliceerd vóór [30]. Infectie van muizen met de muis aangepaste CagA /VacA-delivery deficiënte H.
pylori stam SS1 werd uitgevoerd door orale gavage zoals beschreven [31]. De gemiddelde tijd muizen uit verschillende genetische achtergronden (C57BL /6, B6129, BALB /c) te nemen om de voortgang tot chronische gastritis en daarbuiten (maagatrofie, hyperplasie, dysplasie) [32] varieert tussen de 10 en 15 maanden na besmetting met het gestandaardiseerde referentie stam SS1 [28], [33], [34], [35]. We hebben daarom besloten om onze analyse binnen dit tijdsbestek uit te voeren.

reagentia

Chemicals waren van Merck (Darmstadt, Duitsland) of Sigma (Taufkirchen, Duitsland). Polyklonale antisera waren SREBP1 (# PA1-46142, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), Cav1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (b-300, SC-25766) , FAK (A-17, sc-557), fosfo-FAK (Tyr-397, SC-11765), Hsp90 alpha /beta (H-114, SC-7947), Lamin A /C (H-110, SC 20681, allemaal uit Santa Cruz Biotech., CA), algemene en fosfo ERK1 /2 (p44 /p42), p38, JNK (allen van Cell Signaling, Danvers, MA) en Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Hamburg, Duitsland ). Muis monoklonale antilichamen Cav1 (ɢ406) en fosfo-Cav1 (pY14,ɣ.338) (beide van BD /Transductie Lab., San Jose, CA), DLC-1 (C-12, sc-271.915) en beta-actine (AC-15, SC-69879) (beide van Santa Cruz Biotech.). De macrofaag-specifieke rat anti-muis F4 /80 antilichaam (# MF48000) werd verkregen van Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Duitsland). Chicken anti- H. pylori
polyklonaal Ab werd gebruikt zoals beschreven [36]. Serum cytokinen werden gemeten door ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) volgens de instructies van de fabrikant. Pull-down assays voor de kleine GTPases Rho /Rac /Cdc42 werden gekocht van Biocat (Heidelberg, Duitsland).

Cell cultuur

Humane embryonale nier (HEK293), Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK), ouderlijke GC humane cellijnen (AGS, MKN45, N87) (alle van de American Type Culture Collection, Rockville, MD) en stabiel getransfecteerde klonen daarvan gegenereerd werden gehandhaafd zoals eerder [37] beschreven. Infectie van cellen met de cel aangepast CagA-delivery bedreven H. pylori
stam G27 werd uitgevoerd zoals eerder [36].

DNA-constructen

De expressie plasmide pEGFP-CagA werd elders genoemd [38]. De ~800 bp fragment van de menselijke proximale Cav1 promoter (AF019742, positie 69-859) [24] werd geamplificeerd met PCR uit het genomische DNA van humane normale lever en gekloneerd in de KpnI /HindIII-plaatsen van pGL3 luc-luciferase reporterplasmide ( Promega GmbH, Mannheim, Duitsland). 4 isovorm van menselijk DLC1 mRNA [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) werd geamplificeerd uit humane lever HepG2 cellen en ingevoegd in de BamHI /NotI-plaatsen van de expressievector pTARGET (pT, Promega GmbH). Voorbijgaande transfectie en luciferase werden uitgevoerd zoals eerder [37].

bacteriecultuur

H. pylori
SS1 en G27 bacteriën werden uit -80 ° C glycerol voorraad gewonnen en gekweekt op Wilkins-Chalgren (WC) agarplaten onder microaerobic condities (10% CO2, 5% O2, 85% N2, 37 ° C) 2-3 dagen. De muis-aangepaste H. pylori
SS1 werd geoogst uit agar platen voor In vivo
infecties zoals eerder [31] gepubliceerd. SS1 stam werd PCR-positief voor de cagA
gen en mRNA maar niet injecteren functioneel eiwit CagA [40] zoals blijkt door de afwezigheid van de "kolibrie" fenotype in geïnfecteerde AGS cellen (data niet getoond) . De cel aangepaste H. pylori bacterie
CagA-levering bedreven G27 gew
en de CagA-deletiemutant G27 Delta cagA
van agar platen werden geoogst en vervolgens gekweekt in een continue co-cultuur met MDCK cellen zoals beschreven [36].

Ex vivo
kwantificatie kolonievormende eenheden (CFU)

Totaal magen werden uit muizen en kolonievorming werd in hoofdzaak bepaald zoals beschreven [31] . Een antrale strook van de maag werd gewogen, geplaatst in 5 ml Brucella bouillon en gevortext 10 min. Verdunningen van 1:10, en 1:100 1:1000 bereid, en 100 pl van elke verdunning werd uitgeplaat op H. pylori
selectieve WC bloed agar platen. Het aantal bacteriekolonies werd na 5 dagen en genormaliseerd op het gewicht van de overeenkomstige stukken maag.

Verwerking van muis maagweefsel

De resterende maag werd gewassen met steriel water. Een antrale strook werd gesneden, ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA-extractie. De rest van de maag werd in 3 ml 4% (w /v) paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gedurende 24 uur bij 4 ° C. Vervolgens werd de maag langs de grotere kromming en klein gesneden in twee helften, gevolgd door dehydratatie en inbedden in paraffine voor histologische analyse.

gentamycine bescherming assay

De cellen werden geïnfecteerd met H. pylori
G27 soort voor 2 tot 24 uur bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 500:1. Daarna werden de cellen driemaal met PBS om resterende bacteriën te verwijderen gewassen en werden bijkomend gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer in DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella-bouillon), aangevuld met gentamycine (200 ug /ml ), penicilline /streptomycine (100 ug /ml) en chlooramfenicol (100 pg /ml). Afwezigheid van extracellulaire bacteriën werd bevestigd onder de microscoop, en de cellen werden vervolgens gelyseerd voor de detectie van intracellulaire CagA door Western Blot (WB).

co-immunoprecipitatie (Coip) en Western Blot (WB)

detectie van immunologisch neergeslagen eiwitten door SDS-PAGE en WB werd uitgevoerd zoals eerder [41]. Matrix-geassisteerde laserdesorptie /ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS) is in detail beschreven in [29].

Immunofluorescentie

De kleuring werd uitgevoerd in drievoudige-kleurenmodus visualiseren 4,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), Alexa-488 en -594 met een digitale camera aangesloten (AxioVision loslaten 4,4) fluorescentiemicroscoop (Axiovert 200M, Carl Zeiss microimaging GmbH, Hallbergmoos, Duitsland). Confocale microscopie (Axiovert 40, Zeiss) en 3D-reconstructie van H. pylori
geïnfecteerde cellen met LSM510 (Zeiss) en Volocity (Improvision, Tübingen, Duitsland) werd uitgevoerd zoals eerder [37].

Histopathologische evaluatie en immunohistochemie (IHC)

Chronic actief gastritis werd gedefinieerd door de gelijktijdige aanwezigheid van zowel polymorphnuclear neutrofiele (PMN) en mononucléaire cellen (lymfocyten en plasmacellen) in het maagslijmvlies. Paraffine-ingebedde maagweefsel werd in 3 urn secties met een semi-automatische microtoom (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Duitsland) geknipt: actieve (PMN) en chronische (mononucleaire) infiltraat werd als volgt bepaald. De coupes werden vervolgens gekleurd met behulp van hematoxyline & Eosine (H &E) oplossingen. De histopathologische analyse werd uitgevoerd door drie pathologen (CR, SR, TK) blind voor de studie setup uitgevoerd. Morfologische veranderingen in het maagslijmvlies werden geclassificeerd volgens de bijgewerkte Sydney stelsel [32], [42]. Het cijfer van gastritis werd gescoord op basis van de dichtheid van het darmslijmvlies inflammatoire infiltraten van mononucleaire en PMN cellen zoals gepubliceerd vóór [43]: geen (0), mild (1+), matig (2+) en ernstige (3+). Bovendien, hyperplastische of regeneratieve epitheliale veranderingen, verlies van pariëtale cellen en de frequentie van lymfoïde follikels of lymfoïde aggregaten werden genoteerd. De intensiteit van de H. pylori
kolonisatie in het maagslijmvlies werd geregistreerd als mild (weinig en enkele bacteriën in een willekeurige verdeling), matig (enkel en geclusterd bacteriën in een discontinue verdeling) en ernstige (dichte bacteriële clusters die het maagslijmvlies in continue lagen). Meerdere tientallen verschillende gebieden van het maag bepaald. Immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd op paraffinecoupes zoals eerder beschreven [44].

elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA), chromatine immunoprecipitatie (ChIP), reverse transcriptie PCR (RT-PCR) en kwantitatieve PCR (qPCR)

ChIP (Kit van Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Duitsland) en alle andere werkwijzen werden uitgevoerd zoals eerder [45] beschreven. Oligonucleotiden zijn weergegeven in Tabel S1.

Cellular assays

Levensvatbaarheid van hechtende cellen werd gemeten door 1- (4,5-dimethyl-2-yl) 3,5-difenyl-formazan (MTT ) assay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland) zoals aanbevolen door de fabrikant. Celadhesie bepalen werden 1 x 10 ^{4 cellen gezaaid in 6 cm celcultuurschalen 1 tot 6 uur, gevolgd door herhaalde wassen met PBS. De overblijvende hechtende cellen werden gefixeerd met 4% (w /v) PFA in PBS, gekleurd met kristalviolet en vervolgens geteld met behulp ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Wondgenezing assays werden in hoofdzaak uitgevoerd zoals beschreven in [46]. In het kort werden cellen gekweekt tot confluentie in 6 cm schalen en een 5 mm kras werd in de monolaag met een omgekeerde blue tip gevolgd door incubatie van de celcultuur platen voor extra 24, 48 en 72 uur. Wondsluiting werd gecontroleerd op fixatie en kleuring van cellen met kristalviolet met behulp van helderveld microscopie (Axiovert 200M, Carl Zeiss microimaging GmbH).}

Statistieken

De resultaten zijn gemiddelden ± S.E. uit ten minste 5 dieren per genotype of 3 onafhankelijke experimenten uit andere cel passages. De software GraphPad Prism (versie 4,0, La Jolla, CA) werd gebruikt om de gegevens te analyseren. P-waarden (* p < 0,05) werden berekend met behulp van Student's t en Fisher Exact test

nummers voor de toetreding

Mens: Cav1:. NM_001753.4, Q03135; B2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta-actine: P60709; Lamin A: P02545; Lamin C: P02545; Hsp90 alpha: P07900; Hsp90 beta: P08238; ERK1 (p44): P27361; ERK2 (p42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Muis: Cav1: NM_007616.4, P49817; B2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNFalpha: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Hond: B2M: NC_006612, XP_850148; H. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB:. YP_626814.1, Q1CV82

Resultaten

Cav1-deficiënte muizen weer te geven verbeterde gastritis na infectie met CagA-levering incompetent H. pylori
SS1

Om de histologische veranderingen geïnduceerd in de maag weefsel op H beoordelen. pylori
infectie, B6129 WT en Cav1-KO muizen werden geïnfecteerd met de muis aangepast en CagA-delivery deficiënte H. pylori
stam SS1. De muizen werden 11 maanden later gedood, en H. pylori
werd geïsoleerd uit uitgesneden maag weefsel [31]. Cav1-KO muizen vertoonden minder bacteriële kolonisatie van het maagslijmvlies dan WT muizen (7,3 ± 2,4 WT versus
1,6 ± 0,5 KO × 10 ^{3 CFU /mg maag weefsel; * p = 0,0141; n = 15 per genotype) (figuur 1A.). Histopathologische analyse bleek dat zowel WT en Cav1-KO muizen ontwikkelden actieve chronische gastritis vergezeld door infiltratie van mononucleaire en polymorphnuclear (PMN) cellen in het maagslijmvlies (fig. 1B). Daarentegen ongeïnfecteerde WT en Cav1-KO muizen hadden geen darmslijmvlies ontsteking (gegevens niet getoond). In plaats daarvan, werd de gastritis aanzienlijk verbeterd in H. pylori
geïnfecteerde Cav1-KO muizen in vergelijking met besmette WT muizen (afb. 1C). In Cav1-KO muizen, de gemiddelde score van gastritis (0,7 ± 0,2 WT versus
1,7 ± 0,1 KO; * p = 0,0002, n = 15 per genotype) was ernstig (tabel 1) dan in WT-muizen en het maagslijmvlies tentoongesteld darmslijmvlies B-cel follikels, foveolar hyperplasie en het verlies van de pariëtale cellen. Deze gegevens geven aan dat Cav1-deficiëntie is geassocieerd met een verhoogde ontstekingsreactie in het maagslijmvlies en een minder efficiënte kolonisatie door H. pylori
.}

Cav1-deficiëntie bevordert rekrutering van macrofagen in de geïnfecteerde maagslijmvlies

De identiteit van immuuncellen die bijdragen tot H beoordelen. pylori
gerelateerde ontsteking Cav1-KO muizen, RT-qPCR analyse van een aantal cytokinen, oppervlaktemerkers en chemokines werd uitgevoerd (fig. 2A). In overeenstemming met de waargenomen ontsteking, H. pylori
SS1 geïnduceerde expressie van TNFa en IFNgamma in het maagslijmvlies van zowel WT en KO muizen. Daarnaast hebben we gezegd een verhoogde mRNA expressie van CD19 (B-cellen) (1,6 ± 0,3 WT versus
3,3 ± 0,9 KO; p = 0,0512; n = 15 per genotype) en RANTES (CCL5) (1.3 ± 0,2 WT versus
2,1 ± 0,6 KO; p = 0,0449; n = 15 per genotype) in de maag weefsel van H. pylori
geïnfecteerde Cav1-KO muizen in vergelijking met besmette WT muizen. Daarentegen werden mRNA niveaus van CD4 (T-helpercellen), CD25 (T-regulerende cellen) en CD86 (antigeenpresenterende cellen) onderdrukt door H. pylori
onafhankelijk van de Cav1-status. Immunohistochemie (IHC) ontdekte een duidelijke toename van het darmslijmvlies F4 /80-positieve macrofagen in maagweefsel van geïnfecteerde Cav1-KO muizen in vergelijking met WT nestgenoten (fig. 2B). CD3-positieve lymfocyten werden langs en binnen het darmslijmvlies follikels (gegevens niet getoond).

Soortgelijke resultaten werden verkregen uit experimenten invoering snelle gastrische schade bij muizen door injectie indomethacine [30] (Fig.S1). Consistent met de verbeterde weefselschade in Cav1-KO magen (* p = 0,0161, WT versus
KO, n = 9 per genotype), gekenmerkt door ontsteking, erosie en ulceratie, Cav1-deficiënte muizen drukte ook grotere hoeveelheden van mRNA's die coderen voor de zweer helende eiwitten Trefoil factor-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT versus
2,3 ± 0,4 KO; * p = 0,0048; n = 9 per genotype) en peroxisoom proliferator geactiveerde receptor gamma (PPARg) (0,6 ± 0,2 WT versus
2,5 ± 0,5 KO; * p = 0,0008; n = 9 per genotype). Kortom, deze gegevens blijkt dat het verlies van Cav1 verhoogt de gevoeligheid van muizen voor maagontsteking en weefselschade.

Cav1 noch verandert hechting van H. pylori
stammen noch overleven van de menselijke GC cellen

Om de functie van Cav1 beoordelen tijdens de H. pylori
infectie In vitro
, het menselijke maag-epitheliale cellijn AGS werd gebruikt die stabiel was getransfecteerd met Cav1 expressieplasmide (AGS /Cav1) of lege vector (AGS /EV) [37]. Ten eerste hebben we onderzocht of Cav1 invloed op overleving van de cel op H.
pylori infectie (Fig. 3A). AGS klonen met en zonder Cav1 werden gedurende 48 uur met de cellen aangepaste CagA leverende bevoegde H. pylori
stam G27 op verschillende veelvouden van infectie (MOI), variërend van 1:100 naar 1:2000. Colorimetrische MTT-testen bleek dat Cav1 geen effect op de totale overleving van AGS cellen na H had. pylori
infectie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met CagA leverende incompetente H. pylori
SS1 en door Western blot-analyse (WB) het detecteren van de expressie en fosforylering van overleving kinases (AKT /PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (gegevens niet getoond). Aangezien beide H. pylori Kopen en Cav1 interactie binnen lipide rafts, vroegen we of hechting van bacteriën aan cellen afhankelijk van de aanwezigheid van Cav1. AGS /Cav1 en AGS /ES-cellen werden geïnfecteerd (MOI = 10) met G27 (fig. 3B, C) of SS1 (gegevens niet getoond) bacteriën gedurende 30 minuten, gevolgd door wassen en vervolgens incuberen in vers medium gedurende 2 uur. Daarna werden de cellen gekleurd voor immunofluorescentie microscopie, en het aantal bacteriën die gehecht aan het Cav1-expressie of lege-vector getransfecteerde cellen werden geteld (fig. 3B, C). Geen verschillen in de hechting waargenomen tussen AGS /Cav1 en AGS /EV cellen, wat suggereert dat Cav1 niet hechting van H beïnvloedt. pylori
bacteriën aan gastheercellen.

Cav1 beschermt de menselijke cellen tegen GC-CagA geïnduceerde herschikking van het cytoskelet

De vorming van naaldachtige uitsteeksels ( "zoemende vogel") is een typische morfologisch fenotype van AGS cellen in reactie op infectie met CagA leverende bedreven H. pylori
stammen en translocatie van CagA in het cytosol [47]. Om de rol van Cav1 deze stress geïnduceerde herschikking van het actine cytoskelet onderzocht AGS /Cav1 en AGS /EV werden gedurende 16 uur onder H. pylori
G27 gew golfreizen of de isogene mutant Delta cagA
(MOI = 100). Geïnfecteerde cellen werden gekleurd zoals hierboven beschreven, en het aantal langgerekte AGS cellen werden bepaald (fig. 4A, B). Cav1-deficiënte AGS cellen vertoonden aanzienlijk meer langwerpige morfologie dan Cav1 expressie cellen (11 ± 0,8% AGS /EV versus verhuur 4 ± 0,8% AGS /Cav1; * p = 1,1 × 10 ^{-8; n = 3 per kloon). Zoals verwacht, werd er geen "kolibrie" fenotype verkregen in cellen geïnfecteerd met het CagA aflevering Deficient SS1 of CagA-deletiemutant G27 Delta cagA
stammen die zowel niet functioneel eiwit CagA injecteren in de gastheercellen (data niet weergegeven). AGS /EV cellen produceerde ook meer IL8 mRNA op H. pylori
G27-infectie dan AGS /Cav1 cellen (64 ± 19 EV versus
19 ± 6 Cav1; * p = 0,0176; n = 3 per kloon) (afb. 4C). Deze gegevens gaven aan dat Cav1 beschermt tegen-CagA gerelateerde cel stress.}

Ter ondersteuning van deze bevindingen, celadhesie en wondsluiting tarieven waren meer uitgesproken in AGS /Cav1 vergelijking met AGS /EV-cellen (Fig.S2). Consistent met zijn functie als doeleiwit van CagA en component van focale adhesies [48], WB analyse (Fig. 4D) gedetecteerd hogere niveaus (0,4 ± 0,1 AGS /EV
versus 1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 , * p = 0,0012, n = 3 per kloon) gefosforyleerd focale adhesie kinase (FAK) in Cav1-exprimerende cellen geïnfecteerd met H. pylori
G27. Deze gegevens bevestigd dat AGS /Cav1 cellen geïnfecteerd met CagA-levering bevoegde H. pylori
behielden hun spread-out epitheliale vorm ten opzichte van de beklemtoonde langwerpige fenotype van Cav1 /EV-cellen.

CagA-levering bevoegde H. pylori
G27 veroorzaakt binding van p120RhoGAP /DLC1 te Cav1 in menselijke cellen GC

Cav1 is aangetoond dat gefosforyleerd door cytosolische tyrosinekinasen (Src, Abl) bij tyrosine 14 [49], en gefosforyleerd en Cav1 src zowel het activeren van de kleine GTPases Rho /Rac /Cdc42 die cytoskelet functies [13] te reguleren, [50]. Om de onderliggende moleculaire mechanisme hoe Cav1 beschermt tegen-CagA gerelateerde celstress identificeren, onderzochten we de signaleringsroutes geïnitieerd door CagA-delivery bedreven H. pylori
G27. Infectie van AGS cellen opgeroepen een snelle fosforylering van Cav1 in AGS /Cav1 cellen en Src in zowel AGS /Cav1 en AGS /EV-cellen. Dit resultaat gaf aan dat Cav1 handelt stroomafwaarts van CagA-afhankelijke Src activatie maar stroomopwaarts van de activering van de kleine GTPases (fig. 5A, B). In overeenstemming met deze conclusie, eiwit niveaus van gefosforyleerd JNK, die woont hieronder van Src, waren hoger in AGS /EV-cellen in vergelijking met AGS /Cav1 cellen.

We waren niet in staat om een ​​directe interactie of kwantitatieve colocalization van CagA detecteren eiwit of H. pylori
G27 bacteriën Cav1 in Coip of immunofluorescentie experimenten (Fig. 6A, B). Gentamycine bescherming assays bleek dat de totale hoeveelheid ingespoten intracellulair CagA ook onafhankelijk van Cav1 aanwezigheid (Fig. 6C). Zo Cav1 noch remde de hechting van H.
pylori bacteriën of injectie van CagA in de gastheercel, maar verminderde de stroomafwaartse effecten van CagA op intracellulaire signalering.

Een kandidaat eiwit dat bescherming tegen CagA verleent in een Cav1-afhankelijke identificatie manier, een eiwit interactie scherm op basis van MALDI-MS werd uitgevoerd (figuur 7A.). AGS /Cav1 cellen werden gedurende 16 uur onder H. pylori
G27 (MOI = 100), gevolgd door lysis van de cellen bij kamertemperatuur in MES-buffer 1% (v /v) Triton-X100. Eiwitbanden geprecipiteerd door Cav1 antiserum werden gevisualiseerd door zilverkleuring en peptiden werden geïdentificeerd door MALDI-MS zoals eerder [29] gepubliceerd. Een eiwit fragment van -95 kDa bevatte peptiden die overeenkomen met variant 4 van p120 Rho GTPase-activerend eiwit /verwijderd in leverkanker-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], een tumor suppressor geassocieerd met focale adhesies en caveolae /lipid rafts [53]. DLC1 variant 4 (DLC1v4) een voorspelde grootte van ~110 kDa en is verrijkt in monsters uit cellen die waren geïnfecteerd met H. pylori
G27 vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen (tabel S2). Deze resultaten werden bevestigd door Coip van Cav1 en endogene DLC1 eiwit in AGS /Cav1 cellen (Fig. 7B), wat aangeeft dat H. pylori
G27 opgeroepen een specifieke werving van DLC1 om Cav1 in geïnfecteerde menselijke maag epitheelcellen.

Dit resultaat voor ons aanleiding om de cDNA versterken van variant 4 van menselijke DLC1 [39] uit menselijke lever HepG2 cellen (Fig . 7C). Het cDNA werd geïnsereerd in de expressievector pTARGET (pT-DLC1v4) gevolgd door voorbijgaande transfectie in ouderlijke AGS of HEK293 cellen gedurende 24 uur. WB analyses gedetecteerde expressie van een ~110 kDa eiwit, consistent met de voorspelde grootte van DLC1v4 [39]. AGS tijdelijk getransfecteerde cellen werden vervolgens geïnfecteerd met H. pylori
G27 (MOI = 100) voor nog eens 16 uur. Immunofluorescentiekleuring bleek dat DLC1 per se
heeft de vorming van de CagA geïnduceerde "zoemende vogel" fenotype (19 ± 2% AGS /DLC1 versus
19 ± 2% AGS /EV niet te remmen; n = 3 per kloon) in vergelijking met lege-vector getransfecteerde cellen (Fig. 8A, B). In plaats daarvan, DLC1 bevorderd cel verspreiden (20 ± 3% AGS /DLC1 versus
11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067; n = 3 per kloon) in overeenstemming met haar rol in de regulering van focale adhesies [ ,,,0], H. H. pylori
infectie. pylori
.

• PLoS ONE: Verhoogde Interleukine-32 Expression wordt geassocieerd met Helicobacter pylori-gerelateerde Gastritis
• PLoS ONE: Gerichte Schrapping van KCNE2 Oorzaken Gastritis cystica Profunda en Gastric neoplasie