PLoS Возбудители: Кавеолин-1 защищает мышей от B6129 хеликобактерной Gastritis

Абстрактный
<р> Кавеолин-1 (CAV1) представляет собой белок, подмости и рецептор патоген в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Хроническая инфекция эпителиальных клеток желудка с помощью хеликобактерной
( H. Пилори
) является основным фактором риска развития рака желудка человека (GC), где CAV1 часто подавляется. Тем не менее, функция CAV1 в H. пилори
инфекции и патогенез GC оставалась неизвестной. Здесь мы покажем, что CAV1-дефицитных мышей, инфицированных в течение 11 месяцев с CagA-доставки дефицитных H. Pylori
штамм SS1, разработанный более тяжелый гастрит и повреждения тканей, в том числе потерю париетальных клеток и foveolar гиперплазии, и отображается нижний колонизация слизистой оболочки желудка, чем B6129 однопометные дикого типа. CAV1-нулевые мыши обнаруживают расширение инфильтрацию макрофагов и В-клеток и секрецию хемокинов (RANTES) но пониженные уровни CD25 ^{+ регуляторных Т-клеток. CAV1-дефицитные клетки человека GC (AGS), инфицированных CagA-доставки опытным H. штамм Pylori
G27, были более чувствительны к CagA связанных цитоскелета стресс морфологией ( "колибри") по сравнению с AGS клеток, стабильно трансфицированных CAV1 (AGS /CAV1). Инфицирование клеток AGS /CAV1 вызвало набор p120 RhoGTPase-активирующих белков /удаленных при раке печени-1 (p120RhoGAP /DLC1) к CAV1 и противодействовали CagA индуцированных цитоскелета перестроек. В линиях человека ГХ клеток (MKN45, N87) и ткани желудка мыши, H. пилори
понижающей регуляции экспрессии эндогенного CAV1 независимо от CagA. Механически, H. пилори
активированный стерин реагирующих элемент-связывающий белок-1 (SREBP1), чтобы репрессировать транскрипцию гена человека CAV1 из стеролов реагирующих элементов (SRES) в проксимальном отделе промотора CAV1. Эти данные свидетельствуют о защитной роли CAV1 против H. пилори
-индуцированное воспаление и повреждение тканей. Мы полагаем, что H. Pylori
эксплойты понижающей регуляции CAV1 подорвать иммунную реакцию хозяина и содействовать сигнализации его вирулентных факторов в клетках-хозяевах.}

Автор Резюме
<р> Инфекция бактерии Helicobacter пилори
( H. пилори
) поражает главным образом детей в развивающихся странах, которые подвергаются риску прогрессировать до рака желудка (GC), как и взрослые после многих лет упорной инфекции, особенно штаммов, которые являются положительными для онкогенная фактор вирулентности CagA. Искоренение H. пилори
антибиотиками является препаратом выбора, но может также изменить восприимчивость к аллергии и других типов опухолей. Таким образом, необходимы новые диагностические или прогностические маркеры, которые обнаружить ранние молекулярные изменения в слизистой оболочке желудка при переходе хронического воспаления к раку. В нашем исследовании мы обнаружили, что опухоль супрессор кавеолин-1 (CAV1) снижается при инфицировании H. пилори
, и CagA было достаточно, но не обязательно для этого понижающей регуляции. Потеря CAV1 была вызвана H. Pylori
-зависимая активация стеролов реагирующих элементов-связывающий белок-1 (SREBP1), и это событие отменено взаимодействие CAV1 с p120 RhoGTPase-активирующего белка /удален в рак печени 1 (p120RhoGAP /DLC1), второй добросовестным
супрессоров опухолей желудка в ткани. Окончательно, CAV1 и DLC1 могут представлять собой новые молекулярные маркеры в H. пилори
-infected слизистую оболочку желудка перед малигнизации эпителия
<р> Цитирование:. Hitkova I, Юань G, Anderl F, Gerhard M, Киршнер T, Reu S, и др. (2013) Кавеолин-1 защищает мышей от B6129 хеликобактерной
гастрита. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. DOI: 10.1371 /journal.ppat.1003251
<р> Редактор: Стивен Р. Бланке, Университет штата Иллинойс, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 23 мая 2012 года; Принято: 4 февраля 2013 года; Опубликовано: 11 апреля 2013
<р> Copyright: © 2013 Hitkova и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была поддержана грантами ЕВ и MPAE из Deutsche Krebshilfe (108287) и DFG (BU-2285). MPAE также поддерживается за счет субсидий из Deutsche Krebshilfe (107885), DFG (SFB 824, TP B1), в противном случае Kröner Stiftung (Nr P14 /07 //A104 /06) и BMBF (Mobimed 01EZ0802;. KMU-инновативный Нет 0315116B The спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что никакие конкурирующие интересы не существуют

Введение

хеликобактерной
( H. пилори
) является грамотрицательная бактерия, которая колонизирует желудки ок. 50% населения мира и увеличивает риск развития хронического гастрит, язвенная болезнь, слизистой оболочки желудка-ассоциированной лимфоидной ткани (MALT) лимфома, атрофии слизистой оболочки и рак желудка (GC) [1], [2]. на основании этой этиологии, <ЕМ> Н. пилори
классифицирован как класс I канцероген Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 1994 году [3].
<р> два основных H. пилори
токсинов [4], CagA и Вака, усваиваются в желудка эпителиальные клетки путем инъекции через систему секреции IV типа бактериального (CagA) [5] или путем прямого введения в липидных рафтах (Вака) [6], [7]. Жировые плоты холестерина и сфинголипидов богатые микродомены мембраны плазмы [8], [9], которые эксплуатируются многими патогенными микроорганизмами, в том числе вирусов, паразитов и бактерий, чтобы облегчить усвоение целых организмов и /или интернализации токсинов в клетки-хозяева [ ,,,0],10], [11], [12]. Например, Neisseria спецификации
. использует липидные рафты и Rho-опосредованного сигнализацию цитоскелета, чтобы получить доступ к цитозоле [13]. синегнойной
эксплойты липидные рафты ассоциированных Толл-подобные рецепторы 2 для инфекции легких эпителиальных клеток [14].
<р> Кавеолин-1 (CAV1) является 21-24 кД основным и существенным структурным белок кавеол, специализированная форма липидные рафты микродоменов. Кавеол 50-100 нм колбу /трубчатые впячивания плазматической мембраны в обильной макрофаги, эндотелиальные и гладкомышечные клетки, я пневмоцитах типа и адипоциты, где они участвуют в клеточных процессах транспорта, включая эндоцитоз, отток холестерина и мембранного трафика [15] , [16]. В этом контексте CAV1 может также выступать в качестве ингибитора клатрин-независимого эндоцитоза и блок возбудителя /поглощение токсина [17], [18]. Посредством связывания с его подмостей доменом, CAV1 непосредственно ингибирует множество рецепторов и ферментов, в том числе тирозинкиназ ДЗО и Рас семьи, G-белки и синтаза оксида азота [15]. В дополнение к роли в мембранном трафике, CAV1, таким образом, представляет собой платформу управления для регулирования пролиферации клеток и выживаемости [19]. CAV1 оказывает также важную функцию в подвижности клеток и миграции и, в эпителиальные, стромальные и эндотелиальные ткани, путем применения межклеточных контактов, клетка-матрица адгезии и иммунные реакции [20], [21], [22], [23] .
<р> CAV1 непосредственно связывает холестерин и транскрипция CAV1 негативно регулируется с помощью фактора транскрипции стеролов реагирующих элементов-связывающий белок-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 связан с эндоплазматический ретикулум (ER) в виде неактивного предшественника 125 кД и активируется в условиях дефицита холестерина путем протеолитического расщепления в аппарате Гольджи. Это расщепление следует транслокация активного 68 кДа SREBP1 в ядро, где он связывается с стеролов реагирующих элементов (SRES) генов-мишеней, в том числе CAV1, участвует в синтезе холестерина и жирных кислот [25]. H. пилори
Было показано, что усваивать холестерин из мембраны клетки-хозяина, и холестерин хост изменяет онкогенные свойства CagA [26], [27].
<р> Поэтому мы предположили, что холестерин-связывающих белков SREBP1 и CAV1 являются объектами H. пилори
инфекции и /или эффекторные функции. В частности, мы спросили ли (I) H. Pylori
эксплойты CAV1 для облегчения инъекции и вниз по течению сигнализацию CagA в эпителиальных клеток желудка или (II) CAV1 выступает в качестве защитного барьера "по принуждению" белка, который противодействует болезнь вызываемую H. пилори
. Чтобы проверить это, фенотипы, которые являются результатом H. Pylori
инфекции были изучены в CAV1-дефицитных мышей и в линиях клеток человека GC. Наши данные показали, что CAV1 защищенные B6129 мышей против H. Pylori
гастрит и о связанных ткани повреждения В естественных условиях
независимо от CagA. H. пилори
также активируется SREBP1 и понижающей регуляции экспрессии мышиного и человеческого CAV1 независимо от CagA. Кроме того, CAV1 противодействует CagA-зависимые цитоскелета перегруппировки в пробирке
наймом супрессора опухоли удален в печени рака-1 (DLC1).

Материалы и методы

Этика утверждение

исследования на животных были проведены в соответствии с этическими руководящими принципами Technische Universität München (Закон о немецком благосостояния животных, Deutsches Tierschutzgesetz) и был утвержден (7.2-1-54-2531-74-08) по правительство Баварии

Животные

Гомозиготными CAV1 нокаут (CAV1-KO) (штамм Cav1tm1Mls /J; инвентарный номер 004585) (Regierung фон ÖBB, Мюнхен, Германия.). и соответствует контроль дикого -типа (WT) (штамм B6129SF2 /J; инвентарный номер 101045) мышей (8 недель) были получены из лаборатории Джексона (Bar Harbor, Maine) и поддерживается на смешанном фоне в патогена объекта мыши [28], [ ,,,0],29]. Экспериментальная изъязвления желудка проводили с индометацином, опубликованной ранее [30]. Заражение мышей с помощью мыши адаптированный CagA /Вака-доставки дефицитных H. Pylori
штамм SS1 проводили через желудочный зонд, как описано [31]. Средние мышей время из разных генетических фонов (C57BL /6, B6129, BALB /с) принять для перехода к хроническим гастритом и за ее пределами (желудочной атрофии, гиперплазии, дисплазии) [32] в диапазоне от 10 до 15 месяцев после заражения стандартизированной ссылки штамм SS1 [28], [33], [34], [35]. Поэтому мы решили провести наш анализ в течение этого времени.

Реагенты
<р> Химические вещества были из Merck (Дармштадт, Германия) или Sigma (Тауфкирхен, Германия). Поликлональные антисыворотки SREBP1 (# PA1-46142, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), CAV1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (б-300, SC-25766) , ФСП (А-17, SC-557), фосфо-ФСП (Тир-397, SC-11765), Hsp90, альфа /бета (H-114, SC-7947), ламина А /С (Н-110, SC- 20681, все из Santa Cruz Biotech., CA), общие и фосфо ERK1 /2 (p44 /p42), р38, JNK (все от Cell Signaling, Danvers, MA) и Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Гамбург, Германия ). Мышиные моноклональные антитела были CAV1 (ɢ406) и фосфо-CAV1 (pY14,ɣ338) (оба из BD /трансдукции Lab., Сан-Хосе, Калифорния), DLC-1 (С-12, SC-271915) и бета-актина (АС-15, SC-69879) (оба из Santa Cruz Biotech.). Макрофаг-специфические анти-мышиных F4 /80 антител (# MF48000) был получен из компании Invitrogen (Life Technologies, Дармштадт, Германия). Куриное анти H. Pylori
поликлональными Ab использовали, как описано [36]. Сыворотка цитокинов измеряли с помощью ELISA (R &Amp; D Systems, Minneapolis, MN) в соответствии с инструкциями изготовителя. Спускающее анализы для маленьких ГТФаз Rho /Rac /Cdc42 были приобретены у Biocat (Гейдельберг, Германия).

Культура клеток
<р> эмбриональной почки человека (HEK293), Madin-Darby собачьи почки ( MDCK), родительские линии GC клеток человека (АГС, MKN45, N87) (все из американской коллекции типовых культур, Rockville, MD) и стабильно трансфецированных клонов их сгенерированных поддерживались как описано ранее [37]. Инфицирование клеток с клетками адаптированы CagA-доставки опытным H. штамм Pylori
G27 проводили, как и ранее [36].

ДНК-конструкции
<р> Выражение плазмиду pEGFP-CagA было упомянуто в другом месте [38]. Фрагмент ~800 п.о. проксимального человеческого промотора CAV1 (AF019742, позиция 69 до 859) [24], амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК человека нормальной печени и клонировали в KpnI /HindIII сайты pGL3-Luc люциферазы плазмиды ( Promega GmbH, Mannheim, Германия). Изоформы 4 мРНК человеческого DLC1 [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) амплифицировали из клеток гепатомы HepG2 человека и вставлены в сайты BamHI /NotI вектора экспрессии pTarget (ЭИ, Promega GmbH). Переходные трансфекции и люциферазы анализы проводили как и ранее [37].

Бактериальные культуры

H. пилори
SS1 и G27 бактерии извлекали из -80 ° С запасов глицерина и выращивали на Wilkins-Chalgren (WC) чашках с кровяным агаром в условиях микроаэробных (10% СО2, 5% О2, 85% N 2, 37 ° С) 2-3 дня. Мышь адаптированный H. пилори
SS1 собирали из чашек с агаром для В естественных условиях
инфекций, опубликованных ранее [31]. Штамм SS1 был ПЦР-положительными для ген CagA
и мРНК, но не впрыскивать функциональный белок CagA [40], как видно по отсутствию фенотипа "колибри" в инфицированных клетках AGS (данные не показаны) , Ячейка адаптированный H. Pylori
бактерии CagA доставки опытным G27 вес
и CagA-мутант с делецией G27 Delta CaGa
собирали из чашек с агаром и затем выращивали в непрерывном взаимодействии культуры с MDCK клетками, как описано [36].

Экс естественных
количественное колониеобразующих единиц (КОЕ)
<р> целые желудки были вырезаны из мышей, и образование колоний определяли в основном, как описано [31] , Антрального полоса желудка взвешивали, помещали в 5 мл бульона Brucella и встряхивают в течение 10 мин. были подготовлены Разведения 1:10, 1:100 и 1:1000, и 100 мкл каждого разбавленного раствора наносили на H. пилори
-селективной WC чашках с кровяным агаром. Число колоний бактерий определяли через 5 дней и нормированные на массу соответствующих частей желудка.

Обработка мыши желудочной ткани
<р> Оставшийся желудок промывали стерильной водой. Антрального полоса была вырезана, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до экстракции РНК. Остальная часть желудка помещали в 3 мл 4% (вес /объем) параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном растворе (PBS) и инкубировали в течение 24 ч при температуре 4 ° С. Затем желудок разрезают вдоль большей и малой кривизны на две половины, с последующей дегидратацией и встраивания в парафин для гистологического анализа.

гентамицин анализ защиты
<р> Клетки были заражены с ЧАС. пилори
штамма G27 для 2 до 24 ч при множественности инфекции (MOI) из 500:1. После этого клетки трижды промывали PBS для удаления остаточных бактерий и дополнительно инкубировали в течение 2 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере в среде DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella бульон) с добавлением гентамицина (200 мкг /мл ), пенициллин /стрептомицин (100 мкг /мл) и хлорамфеникол (100 мкг /мл). Отсутствие внеклеточного бактерий было подтверждено под микроскопом, и клетки лизируют впоследствии для обнаружения внутриклеточных CagA с помощью Вестерн-блоттинга (WB).

коиммунопреципитации (COIP) и Вестерн-блот (ВБ)
<р> Обнаружение иммунопреципитированных белков с помощью SDS-PAGE и ВБ проводили как и ранее [41]. Матричный с лазерной десорбцией /ионизацией масс-спектрометрии (MALDI-MS) была подробно описана в [29].

Иммунофлуоресценции
<р> Окрашивание проводили в режиме тройного цвета визуализации 4,6- диамидино-2-фенилиндола (DAPI), Alexa-488 и -594 с помощью цифровой камеры, подключенных (AxioVision, релиз 4.4) флуоресцентного микроскопа (AXIOVERT 200м, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Hallbergmoos, Германия). Конфокальной микроскопии (Axiovert 40, Zeiss) и 3D-реконструкция H. Pylori
-infected клетки с LSM510 (Цейс) и Volocity (Improvision, Тюбинген, Германия) было сделано, как и раньше [37].

Гистопатологическая оценка и иммуногистохимии (IHC)
<р> Хронический активный гастрит определяется одновременным присутствием обоих нейтрофильного polymorphnuclear (ПМН) и мононуклеарных клеток (лимфоциты и плазматические клетки) в пределах слизистой оболочки желудка. Активный (ПМН) и хронический (мононуклеарных) инфильтрат оценивали следующим образом: Парафиновые ткани желудка разрезали на 3 мкм секций при помощи полуавтоматического микротома (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Германия). Затем срезы окрашивали с помощью гематоксилин &Amp; Эозином (Н &Amp; E) решения. Гистопатологическая анализ проводился тремя патологи (CR, SR, ТЗ), ослепленных к настройке исследования. Морфологические изменения в слизистой оболочке желудка были классифицированы в соответствии с обновленной системой Сиднея [32], [42]. Степень гастрита оценивали на основании плотности intramucosal воспалительных инфильтратов из одноядерных и клеток ПМН, как опубликовано ранее [43]: нет (0), умеренный (1+), умеренное (2+) и тяжелой (3+). Кроме того, гиперпластические или регенеративный эпителиальных изменений, отмечались потери париетальных клеток и частота лимфоидных фолликулов или лимфоидных агрегатов. Интенсивность H. пилори
колонизация в слизистой оболочке желудка регистрировали как мягкая (несколько и одиночных бактерий в случайном распределении), умеренные (одно- и кластерные бактерии в прерывистое распределение) и тяжелой (плотных бактериальных кластеров, покрывающих слизистую оболочку желудка в непрерывных слоев). Определены несколько десятков различных областей желудка. Иммуногистохимия (IHC) проводили на парафиновых срезах, как описано ранее [44].

Электрофорезная сдвиг подвижности анализ (EMSA), иммунопреципитация хроматина (ЧИП), ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) и количественный ПЦР (КПЦР)
<р> чИП (комплект из Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Германия) и все другие методы были выполнены, как описано ранее [45]. Олигонуклеотиды приведены в таблице S1.

Cellular анализы
<р> Жизнеспособность адгезивных клеток измеряли с помощью 1- (4,5-диметилтиазол-2-ил) 3,5-дифенил-формазана (МТТ ) анализ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Для определения адгезии клеток, 1 × 10 4 клетки высевают в 6 см чашки для культивирования клеток в течение от 1 до 6 часов с последующим повторным промыванием PBS. Оставшиеся прилипшие клетки фиксировали 4% (вес /объем) ПФА в PBS, окрашивали кристаллическим фиолетовым, а затем подсчитывали с использованием ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Заживление ран анализы проводили по существу, как описано в [46]. В кратком изложении, клетки выращивали до слияния в 6-см чашки, и 5 мм царапины был введен в монослое с использованием инвертированного синий наконечник с последующей инкубацией клеточных культур пластин для дополнительного 24, 48 и 72 ч. Закрытие ран контролировали при фиксации и окрашивания клеток с кристаллическим фиолетовым с использованием светлого поля микроскопии (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH).

Статистика

Результаты средние значения ± С.Э. по меньшей мере, 5 животных на генотип или 3 независимых экспериментов из различных пассажей клеток. Программное обеспечение GraphPad Prism (версия 4.0, La Jolla, CA) использовали для анализа данных. Р-значения (* р ≪ 0,05) были рассчитаны с использованием т Стьюдента и Фишера точные тесты

Присоединение числа
<р> Человеческий: CAV1:. NM_001753.4, Q03135; В2т: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; бета-актина: P60709; Ламин A: P02545; Ламин C: P02545; Hsp90 альфа: P07900; Hsp90 бета: P08238; ERK1 (p44): P27361; ERK2 (p42): P28482; ФСП: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Мышь: CAV1: NM_007616.4, P49817; В2т: NM_009735.3, Q91XJ8; TNF альфа: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Собака: В2т: NC_006612, XP_850148; H. пилори
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB:. YP_626814.1, Q1CV82

Результаты

CAV1-дефицитные мыши обнаруживают повышенную гастрит при инфицировании CagA-доставки некомпетентным H. пилори
SS1
<р> Для оценки гистологических изменений, вызванных в желудочном ткани при H. Pylori
инфекции, B6129 и WT мышей CAV1-KO были заражены с помощью мыши районированных и CagA-доставки дефицитных H. Pylori
штамм SS1. Мыши были умерщвлены через 11 месяцев, и H. пилори
был выделен из ткани желудка резекцию [31]. CAV1-KO мыши показали меньше бактериальной колонизации слизистой оболочки желудка, чем у мышей дикого типа (7.3 ± 2.4 WT по сравнению с
1,6 ± 0,5 × 10 KO ^{3 КОЕ /мг ткани желудка; * р = 0,0141; п = 15, на генотип) (рис. 1А). Гистопатологические анализ показал, что как WT и CAV1-KO мыши развивали активный хронический гастрит сопровождается инфильтрацией одноядерных и polymorphnuclear (ПМН) клеток в слизистой оболочке желудка (рис. 1В). В отличие от этого, неинфицированных мышей WT и CAV1-KO не имели intramucosal воспаление (данные не показаны). Вместо этого, гастрит заметно усиливается в H. пилори
-infected мышей CAV1-KO по сравнению с зараженных мышей WT (рис. 1в). У мышей CAV1-KO, средний балл гастритом (0,7 ± 0,2 WT по сравнению с 1,7 ±
0,1 КО; * р = 0,0002, п = 15 в генотипе) была более тяжелой (таблица 1), чем у мышей WT , и желудок слизистая выставлены intramucosal в-клеточных фолликулов, foveolar гиперплазии и потерей париетальных клеток. Эти данные указывают на то, что CAV1-недостаток связан с повышенным воспалительной реакции в слизистой оболочке желудка и менее эффективной колонизации H. пилори
.}

CAV1-дефицит способствует набору макрофагов в инфицированной слизистой оболочки желудка
<р> Для оценки идентичности иммунных клеток, которые способствуют H. Pylori
воспаление о связанных мышей CAV1-KO, анализ RT-КПЦР выбранных цитокинов, поверхностных маркеров и хемокинов была выполнена (рис. 2А). В соответствии с наблюдаемым воспаления, H. пилори
SS1 индуцированную экспрессию TNF альфа и IFNgamma в слизистой оболочке желудка обоих мышей WT и KO. Кроме того, мы уже отмечали повышенную экспрессию мРНК CD19 (B-клетки) (1,6 ± 0,3 WT по сравнению с
3,3 ± 0,9 КО; р = 0,0512; п = 15 в генотипе) и RANTES (CCL5) (1.3 ± 0,2 WT по сравнению с
2,1 ± 0,6 КО; р = 0.0449; п = 15 в генотипе) в желудочном ткани H. пилори
-infected мышей CAV1-KO по сравнению с инфицированными WT мышей. В противоположность этому, уровни мРНК CD4 (Т-клетки-хелперы), CD25 (T-регуляторные клетки) и CD86 (антиген-представляющих клеток) были подавлены H. пилори
независимо от статуса CAV1. Иммуногистохимия (IHC) обнаружено заметное увеличение intramucosal F4 /80-положительных макрофагов в желудочной ткани инфицированных мышей CAV1-KO по сравнению с WT однопометные (рис. 2В). CD3-позитивных лимфоцитов были расположены вокруг и внутри intramucosal фолликулов (данные не показаны).
<Р> Аналогичные результаты были получены из экспериментов, внедряющих быстрое повреждение желудка у мышей путем инъекции индометацина [30] (Fig.S1). В соответствии с повышенной повреждения тканей в CAV1-KO желудков (* р = 0,0161, WT по сравнению с
KO, п = 9 в генотипе), характеризуется воспалением, эрозии и изъязвления, CAV1-дефицитных мышей также выразили большее количество мРНК, кодирующих для заживления язвы белков трилистник фактор-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 мас в сравнении с
2,3 ± 0,4 КО; * р = 0,0048; п = 9, на генотип) и активатора пролиферации пероксисом рецептор гамма (PPARG) (0,6 ± 0,2 WT по сравнению с
2,5 ± 0,5 КО; * р = 0,0008; п = 9 в генотипе). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что потеря CAV1 повышает восприимчивость мышей к действию желудочного воспаления и повреждения тканей.

CAV1 ни изменяет адгезию H. Pylori
штаммы, ни выживание клеток GC человека
<р> Для оценки функции CAV1 во время H. Pylori
инфекции в пробирке
, человеческий эпители желудка клеточная линия была использована AGS, которая была стабильно трансфицированных плазмиды экспрессии CAV1 (AGS /CAV1) или пустого вектора (AGS /EV) [37]. Во-первых, мы исследовали, влияет ли CAV1 выживаемость клеток при H. пилори
инфекции (рис. 3А). AGS клоны с и без CAV1 инфицировали в течение 48 ч с клеточным адаптированный CagA-доставки компетентного H. пилори
штамма G27 при различной кратности инфекции (MOI) в диапазоне от 1:100 до 1:2000. Колориметрические МТТ анализы показали, что CAV1 не оказывает влияния на общую выживаемость клеток AGS при H. пилори
инфекции. Аналогичные результаты были получены с CagA-доставки некомпетентным H. пилори
SS1 и Вестерн-блот-(WB) анализа, детектирующего экспрессию и фосфорилирование киназ выживаемости (РКВ /Akt, ERK1 /2, р38МАРК) (данные не показаны). Так как H. пилори
и CAV1 взаимодействуют в липидных рафтах, мы попросили, зависит ли адгезию бактерий к клеткам на присутствии CAV1. АГС /CAV1 и /EV клетки AGS были заражены (MOI = 10) с G27 (рис. 3б, в) или SS1 (данные не показаны) бактерий в течение 30 мин, с последующим промыванием и последующей инкубации в свежей среде в течение 2 ч. Затем клетки окрашивали для иммунофлуоресценции микроскопии, а количество бактерий, которые приклеивают к CAV1 экспрессирующие или пустой вектор трансфицируют клетки подсчитывали (рис. 3б, в). Не было обнаружено различий в адгезии между AGS /CAV1 и АГС /EV клеток, предполагая, что CAV1 не влияет на адгезию Н. Pylori
бактерии к клеткам-хозяевам.

CAV1 защищает клетки человека от GC CagA-индуцированной перестройкой цитоскелета
<р> Формирование игольчатых выступов ( "колибри") является типичным морфологическое фенотип клеток AGS в ответ на инфекцию с CagA-доставки опытным H. Pylori
штаммов и транслокация CagA в цитозоле [47]. Для изучения роли CAV1 в этом стресс-индуцированной перестройки цитоскелета, AGS /CAV1 и AGS /EV были инфицированы в течение 16 ч с H. Pylori
G27 вес
или изогенных мутанта Delta CaGa
(MOI = 100). Инфицированные клетки окрашивали, как описано выше, и количество удлиненных AGS клеток определяли (рис. 4, В). CAV1-дефицитные AGS клетки показали значительно более удлиненные морфологию, чем CAV1-экспрессирующих клеток (11 ± 0,8% AGS /EV по сравнению с
4 ± 0,8% AGS /CAV1; * р = 1,1 × 10 ^{-8; п = 3 на клон). Как и следовало ожидать, никакой "колибри" фенотип не был получен в клетках, инфицированных CagA-доставки с дефицитом SS1 или CagA-делеционного мутанта G27 Delta CaGa
штаммы, которые оба не вводить функциональный белок CagA в клетки-хозяева (данные не показаны). AGS /EV клетки также получают больше мРНК IL8 на H. Pylori
G27 инфекция, чем клетки AGS /CAV1 (64 ± 19 EV по сравнению с
19 ± 6 CAV1; * р = 0,0176; п = 3 на клона) (. Рис 4C). Эти данные свидетельствуют о том, что CAV1 защищает от CagA связанных клеток стресса.
<Р> В подтверждение этих выводов, клеточную адгезию и раневые темпы закрытия были более выражены в AGS /CAV1 по сравнению с AGS /EV клеток (Fig.S2). В соответствии со своей функцией в качестве целевого белка CagA и компонента координационных спаек [48], ВБ анализа (рис. 4D) также обнаружены более высокие уровни (0,4 ± 0,1 AGS /EV по сравнению с
1,4 ± 0,1 AGS /CAV1 , * р = 0,0012; п = 3 на клона) фосфорилированного фокальной адгезии киназы (FAK) в CAV1-экспрессирующих клеток, инфицированных H. пилори
G27. Эти данные подтверждают, что АГС /CAV1 клетки, инфицированные CagA-доставки компетентным H. пилори
сохранили свою вытянутую форму эпителиальной по сравнению с удлиненным напряженном фенотипа CAV1 /EV клеток.}

CagA доставки компетентный H. Pylori
G27 вызывает связывание p120RhoGAP /DLC1 к CAV1 в клетках человека GC
<р> CAV1 Было показано, что фосфорилироваться цитозольной тирозинкиназ (Src, ABL) на тирозин 14 [49], и фосфорилируется CAV1 и Src как активировать малые GTPases Rho /Rac /Cdc42, которые регулируют функции цитоскелета [13], [50]. Для того, чтобы идентифицировать основную молекулярный механизм, как CAV1 защищает от CagA связанных клеток стресса, мы оценивали сигнальные пути, инициируемые CagA-доставки опытным H. пилори
G27. Инфекция AGS клеток вызывала быстрое фосфорилирование CAV1 в клетках AGS /CAV1 и Src в обоих AGS /CAV1 и AGS /EV клеток. Этот результат показал, что CAV1 действует ниже CagA-зависимой активации Src, но выше по потоку от активации малых ГТФ-аз (рис. 5А, В). В соответствии с этим выводом, уровни белка фосфорилированного JNK, который находится ниже ЦСИ, были выше в AGS EV клеток /по сравнению с клетками AGS /CAV1.
<Р> Нам не удалось обнаружить прямое взаимодействие или количественное колокализации CagA белок или H. пилори
G27 бактерии с CAV1 в COIP или иммунофлуоресценции экспериментов (рис. 6А, В). Гентамицин анализа защиты показали, что общее количество впрыскиваемого внутриклеточного CagA также не зависит от присутствия CAV1 (рис. 6в). Таким образом, ни CAV1 тормозится адгезия H. Pylori
бактериям, ни инъекции CagA в клетку-хозяина, а уменьшил вниз по течению эффекты CagA на внутриклеточной сигнализации.
<р> Чтобы идентифицировать белок-кандидат, который обеспечивает защиту от CagA в CAV1-зависимой манера, проводили экран взаимодействия белка на основе MALDI-MS (рис. 7А). клетки AGS /CAV1 были инфицированы в течение 16 ч с H. пилори
G27 (MOI = 100), с последующим лизисом клеток при комнатной температуре в MES-буферном 1% (об /об) Тритон-X100. Белковые полосы, осаждающиеся CAV1 антисыворотки визуализировали путем окрашивания серебром, и были идентифицированы пептиды с помощью MALDI-MS, как описано ранее [29]. Фрагмент белка ~95 кДа содержала пептиды, соответствующие варианту 4 p120 Rho ГТФ-активирующего белка /удален в рак печени-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], супрессоров опухоли, связанный с координационными спаек и кавеол /липидные рафты [53]. DLC1 вариант 4 (DLC1v4) имеет предсказанную размер ~110 кДа и была обогащена в пробах из клеток, которые были инфицированы H. пилори
G27 по сравнению с неинфицированных клеток (таблица S2). Эти результаты были подтверждены COIP из CAV1 и эндогенного белка DLC1 в клетках AGS /CAV1 (рис. 7б), указывая, что H. Pylori
G27 вызвала определенный набор DLC1 к CAV1 в инфицированных эпителиальных клеток желудка человека.
<р> Этот результат побудило нас усилить кДНК варианта 4 человека DLC1 [39] из клеток HepG2 гепатомы человека (рис . 7С). КДНК встраивали в вектор экспрессии pTarget (ЭИ-DLC1v4) с последующим транзиторной трансфекции в родительских АГС или клетки HEK293 в течение 24 ч. WB анализа обнаружено экспрессию ~110 кДа белка, в соответствии с предсказанным размером DLC1v4 [39]. Трансфицированы клетки AGS затем были заражены H. пилори
G27 (MOI = 100) в течение еще 16 ч. Иммунофлуоресценции окрашивание показало, что DLC1 сами по себе
не ингибирует образование CagA-индуцированной "Колибри" фенотипа (19 ± 2% AGS /DLC1 по сравнению с
19 ± 2% AGS /EV; п = 3 на клон) по сравнению с пустыми векторно-трансфицированных клеток (фиг. 8А, в). Вместо этого DLC1 способствовало распространения клеток (20 ± 3% AGS /DLC1 против
11 ± 2% AGS /EV; * р = 0,0067; п = 3 на клон) в соответствии с его ролью в регуляции координационных спаек [ ,,,0], H. H. пилори
инфекции. пилори
.

• PLoS ONE: Повышенные интерлейкин-32 экспрессия связана с Helicobacter Pylori Связанного Гастрит
• PLoS ONE: Targeted Удаление Kcne2 Причины гастрита Cystica Profunda и неоплазии желудка