PLoS Pathogens: Caveolin-1 Beskytter B6129 Mus mot Helicobacter pylori gastritt

Abstract

Caveolin-en (Cav1) er et stillas protein og patogen reseptor i slimhinnene i mage-tarmkanalen. Kronisk infeksjon i mage epitelceller av Helicobacter pylori product: ( H. Pylori
) er en viktig risikofaktor for human magekreft (GC) hvor Cav1 er ofte nedregulert. Men funksjonen Cav1 i H. pylori
infeksjon og patogenesen av GC forble ukjent. Vi viser her at Cav1-mangelfull mus, infisert i 11 måneder med CagA-levering mangel H. pylori
belastning SS1, utviklet mer alvorlig gastritt og vevsskade, inkludert tap av parietal celler og foveolar hyperplasi, og viste lavere kolonisering av mageslimhinnen enn villtype B6129 kullsøsken. Cav1-null mus viste forbedret infiltrasjon av makrofager og B-celler og sekresjon av kjemokiner (RANTES), men hadde reduserte nivåer av CD25 ^{+ regulatoriske T-celler. Cav1-manglende menneske GC-celler (AGS), infisert med CagA-levering dyktig H. pylori
belastning G27, var mer følsomme for CagA relaterte cytoskeletal spennings morfologi ( "humming bird") sammenlignet med AGS celler stabilt transfektert med Cav1 (AGS /Cav1). Infeksjon av AGS /Cav1 celler utløst rekruttering av P120 RhoGTPase-aktiverende protein /slettet i leveren kreft-en (p120RhoGAP /DLC1) til Cav1 og motvirket CagA-indusert cytoskeletal rearrangements. I menneskelige GC cellelinjer (MKN45, N87) og mus magen vev, H. pylori
nedregulert endogen uttrykk for Cav1 uavhengig av CagA. Mekanistisk, H. pylori
aktivert sterol-reagerende element-bindingsprotein-1 (SREBP1) for å undertrykke transkripsjon av det humane Cav1 genet fra sterol-responsive elementer (SRE) i den proksimale Cav1 promoteren. Disse dataene foreslått en beskyttende rolle Cav1 mot H. pylori
indusert betennelser og vevsskade. Vi foreslår at H. pylori
utnytter nedregulering av Cav1 å styrte vertens immunrespons og for å fremme signalisering av sine virulensfaktorer i vertsceller.}

Forfatter Oppsummering

Infeksjon med bakterien Helicobacter pylori product: ( H. pylori
) hovedsakelig rammer barn i utviklingslandene som står i fare for å gå videre til magekreft (GC) som voksne etter mange år med vedvarende infeksjon, spesielt med stammer som er positive for den onkogene virulens faktor CagA. Utrydding av H. pylori
av antibiotika er en behandling av valg, men kan også endre mottakelighet for allergi og andre krefttyper. Således blir nye diagnostiske eller prognostiske markører er nødvendig som oppdage tidlig molekylære forandringer i mageslimhinnene ved overgangen av kronisk betennelse til kreft. I vår studie fant vi at tumor suppressor caveolin-en (Cav1) reduseres ved infeksjon med H. pylori
, og CagA var tilstrekkelig, men ikke nødvendig for denne nedregulering. Tap av Cav1 ble forårsaket av H. pylori
-avhengig aktivering av sterol-reagerende element-bindingsprotein-1 (SREBP1), og denne hendelsen avskaffet interaksjonen av Cav1 med P120 RhoGTPase-aktiverende protein /slettes i leverkreft-1 (p120RhoGAP /DLC1), en annen bona fide
tumor suppressor i mage vev. Sikkert, kan Cav1 og DLC1 utgjør nye molekylære markører i H. pylori
-infected mageslimhinnen før neoplastisk transformasjon av Epitel

Citation. Hitkova jeg, Yuan G, Anderl F, Gerhard M, Kirchner T, Reu S, et al. (2013) Caveolin-1 Beskytter B6129 Mus mot Helicobacter pylori
gastritt. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. doi: 10,1371 /journal.ppat.1003251

Redaktør: Steven R. Blanke, University of Illinois, USA

mottatt: May 23, 2012; Godkjent: 04.02.2013; Publisert: 11 april 2013

Copyright: © 2013 Hitkova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd til EB og MPAE fra Deutsche Krebshilfe (108 287) og DFG (BU-2285). MPAE er også støttet med tilskudd fra Deutsche Krebshilfe (107 885), DFG (SFB 824, TP B1), Else Kröner Stiftung (Nr P14 /07 //A104 /06) og BMBF (Mobimed 01EZ0802;. KMU-innovativ Ingen 0315116B The funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Helicobacter pylori product: ( H. pylori
) er en Gram-negativ bakterie som koloniserer mager av ca. 50% av verdens befolkning, og øker risikoen for utvikling av kronisk gastritt, magesår sykdom, mage mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT) lymfom, slimhinnene atrofi og magekreft (GC) [1], [2]. Basert på denne etiologi, H. pylori
har blitt klassifisert som en klasse jeg karsinogen av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 1994 [3].

de to store H. pylori
giftstoffer [4], CagA og Vaca, blir internalisert i mage epitelceller ved injeksjon via IV sekresjon system (CagA) bakterietype [5] eller ved direkte innsetting i lipid flåter (Vaca) [6], [7]. Lipid flåter er kolesterol og sfingolipid-rike mikroområder av plasmamembranen [8], [9], som er utnyttet av mange patogener, inkludert virus, parasitter og bakterier, for å lette opptak av hele organismer og /eller internaliseringen av giftstoffer i vertsceller [ ,,,0],10], [11], [12]. For eksempel Neisseria spec
. benytter lipid flåter og Rho-mediert signalisering av aktin cytoskjelettet for å få tilgang til cytosol [13]. Pseudomonas aeruginosa
utnytter lipid flåte-assosiert toll-like receptor 2 for infeksjon i lungene epitelceller [14].

Caveolin-en (Cav1) er 21-24 kDa store og viktige strukturelle protein av caveolae, en spesialisert form for lipid flåte mikroområder. Caveolae er 50-100 nm kolbe /rør-formede invaginations av plasmamembranen rikt på makrofager, endotel og glattmuskelceller, type I pneumocytes og adipocytter, hvor de deltar i cellulære transportprosesser inkludert endocytose, kolesterol efflux og membranen trafikk [15] [16]. I denne sammenheng kan Cav1 også fungere som en inhibitor av clathrin-uavhengig endocytose og blokk patogen /toksin-opptak [17], [18]. Gjennom binding til sin stillas domene, Cav1 direkte hemmer en mengde reseptorer og enzymer inkludert tyrosin kinaser av Src og Ras familie, G-proteiner og nitrogenoksid synthases [15]. I tillegg til en rolle i membran trafikk, utgjør Cav1 således et kontrollplattform for regulering av celleproliferasjon og overlevelse [19]. Cav1 utøver også en viktig funksjon i cellen motilitet og migrering og, innenfor epitelial, stromal og endoteliale vev, ved å håndheve celle-celle-kontakter, celle-matrise-adhesjon og immunresponser [20], [21], [22], [23] .

Cav1 binder direkte kolesterol, og transkripsjon av Cav1 er negativt regulert av transkripsjonsfaktor sterol-responsive element-bindende protein-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 er bundet til det endoplasmatiske retikulum (ER) som en inaktiv 125 kDa-forløper og aktiveres under betingelser av kolesterol mangel ved proteolytisk spaltning i Golgi-apparatet. Denne spaltingen etterfulgt av translokasjon av den aktive 68 kDa SREBP1 inn i cellekjernen hvor det bindes til sterol-responsive elementer (SRE) av målgener, inkludert Cav1, som er involvert i syntese av kolesterol og fettsyrer [25]. H. pylori
har vist seg å forbrenne kolesterol fra vertscellemembranen, og vert kolesterol endrer onkogene egenskaper CagA [26], [27].

Vi har derfor hypotesen om at den kolesterol-bindende proteiner og SREBP1 Cav1 er mål for H. pylori
infeksjon og /eller effektorfunksjoner. Spesielt vi spurte om (i) H. pylori
exploits Cav1 å lette injeksjon og ned-stream signaler CagA i mage epitelceller eller (ii) Cav1 fungerer som et beskyttende "barriere-håndheve" protein som motvirker sykdom fremkalt av H. pylori
. For å teste dette, fenotyper som følge av H. pylori
infeksjon ble undersøkt i Cav1-mangelfull mus og humane GC cellelinjer. Våre data viste at Cav1 beskyttet B6129 mus mot H. pylori
-relaterte gastritt og vevsskade in vivo
uavhengig av CagA. H. pylori
også aktivert SREBP1 og nedregulert uttrykk for murine og humane Cav1 uavhengig av CagA. I tillegg Cav1 motvirket CagA-avhengige cytoskeletal rearrangements in vitro
av rekruttering av svulst suppressor slettet leverkreft-en (DLC1).

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP ble utført i samsvar med de etiske retningslinjene for Technische Universität München (tysk dyrevernloven, Deutsches Tierschutzgesetz) og hadde blitt godkjent (7.2-1-54-2531-74-08) etter regjeringen i Bayern

Dyr

Homozygot Cav1 knockout (Cav1-KO) (belastningen Cav1tm1Mls /J; lager nummer 004 585) (Regierung von OBB, München, Tyskland.). og matchet kontrollgruppe vill -type (WT) (stamme B6129SF2 /J; lager nummer 101 045) mus (8 uker) ble innhentet fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) og vedlikeholdes på en blandet bakgrunn i et patogen-frie mus anlegget [28], [ ,,,0],29]. Eksperimentell magesår ble utført med indometacin som er publisert før [30]. Infeksjon av mus med musen tilpassede CagA /Vaca-levering mangel H. pylori
belastning SS1 ble utført ved oral sonde som beskrevet [31]. Den gjennomsnittlige tiden mus fra ulike genetiske bakgrunn (C57BL /6, B6129, BALB /c) ta å utvikle seg til kronisk gastritt og utover (gastrisk atrofi, høyt blodtrykk, dysplasi) [32] varierer mellom 10 og 15 måneder etter infeksjon med standardiserte referanse belastning SS1 [28], [33], [34], [35]. Vi bestemte oss derfor for å utføre analysen innenfor denne tidsrammen.

Reagenser

Kjemi var fra Merck (Darmstadt, Tyskland) eller Sigma (Taufkirchen, Tyskland). Polyklonale antisera var SREBP1 (# PA1-46142, Thermofisher Scientific, Waltham, MA), Cav1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (b-300, sc-25766) , FAK (A-17, SC-557), fosfor-FAK (Tyr-397, sc-11765), HSP90 alpha /beta (H-114, sc-7947), Lamin A /C (H-110, SC- 20 681, alt fra Santa Cruz Biotech., CA), generell og fosfor ERK1 /2 (P44 /P42), p38, JNK (alt fra Cell Signaling, Danvers, MA) og Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Hamburg, Tyskland ). Muse monoklonale antistoffer var Cav1 (ɢ406) og fosfor-Cav1 (pY14,ɣ338) (begge fra BD /Transduksjon Lab., San Jose, CA), DLC-en (C-12, sc-271915) og beta-Actin (AC-15, SC-69879) (begge fra Santa Cruz Biotech.). Den makrofag-spesifikk rotte-anti-muse-F4 /80-antistoff (# MF48000) ble oppnådd fra Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). Kylling anti- H. pylori
polyklonale Ab ble anvendt som beskrevet [36]. Serum cytokiner ble målt med ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) i henhold til produsentens instruksjoner. Pull-down-analyser for de små GTPases Rho /Rac /Cdc42 ble kjøpt fra Biocat (Heidelberg, Tyskland).

Cell kultur

humane embryonale nyre (HEK293), Madin-Darby canine nyre ( MDCK), sperre humane GC-cellelinjer (AGS, MKN45, N87) (alle fra American Type Culture Collection, Rockville, MD) og stabilt transfekterte kloner ble generert derav ble opprettholdt som tidligere beskrevet [37]. Infeksjon av celler med celletilpassede CagA-levering dyktig H. pylori
belastning G27 ble utført som før [36].

DNA-konstruksjoner

Uttrykket plasmid pEGFP-CagA ble nevnt andre steder [38]. Den ~800 bp fragment av den proksimale human Cav1 promoter (AF019742, posisjon 69-859) [24] ble amplifisert ved PCR fra genomisk DNA av human normal lever og klonet inn i Kpnl /Hindlll setene til pGL3-luc luciferase reporter-plasmid ( Promega GmbH, Mannheim, Tyskland). Isoform 4 av det humane DLC1 mRNA [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) ble amplifisert fra humane hepatom HepG2 celler og innsatt i BamHI /NotI områder av ekspresjonsvektoren pTarget (PT, Promega GmbH). Forbigående transfeksjon og luciferase analysene ble utført som før [37].

Bakteriell kultur

H. pylori
SS1 og G27 bakterier ble gjenvunnet fra -80 ° C glyserol aksjer og dyrket på Wilkins-Chalgren (WC) blodagarplater henhold microaerobic betingelser (10% CO2, 5% O2, 85% N2; 37 ° C) for 2-3 dager. Musen tilpassede H. pylori
SS1 ble høstet fra agarskåler for in vivo
infeksjoner som er publisert tidligere [31]. SS1 stammen var PCR-positive for CagA
genet og mRNA, men ikke injisere funksjonell CagA protein [40] som tydelig ved fravær av "humming bird" fenotype i infiserte AGS celler (data ikke vist) . Cellen tilpassede H. pylori
bakterier CagA-levering dyktig G27 wt
og CagA-sletting mutant G27 Delta CagA
ble høstet fra agarplater og deretter dyrket i kontinuerlig co-kultur med MDCK celler som beskrevet [36].

Ex vivo
kvantifisering av kolonidannende enheter (CFU)

Hele magen ble skåret ut fra mus, og kolonidannelse ble bestemt vesentlige som beskrevet [31] . En antral strimmel av magen ble veid, plassert i 5 ml Brucella buljong og vortex-blandet i 10 min. Fortynninger av 01:10, 1:100 og 1:1000 var forberedt, og 100 ul av hver fortynning ble sådd ut H. pylori
selektive WC blodagarplater. Antallet bakteriekolonier ble bestemt etter 5 dager og normalisert til vekten av de tilsvarende magen stykker.

Behandling av mus gastrisk vev

Den gjenværende Magen ble vasket med sterilt vann. En antral strimmel ble skåret, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Resten av magen ble plassert i 3 ml 4% (w /v) paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS) og inkubert i 24 timer ved 4 ° C. Deretter ble magen skåret langs større og liten krumning i to halvdeler, etterfulgt av dehydrering og innebygging i parafin for histologisk analyse.

Gentamycin beskyttelsestest

Celler ble infisert med H. pylori
G27 belastning i 2 til 24 timer ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 500:1. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS for å fjerne gjenværende bakterier og i tillegg ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktig atmosfære i DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella medium) supplert med gentamycin (200 ug /ml ), penicillin /streptomycin (100 ug /ml) og kloramfenikol (100 ug /ml). Fravær av ekstracellulære bakterier ble bekreftet under mikroskop, og cellene ble deretter lysert for påvisning av intracellulær CagA av Western blot (WB).

Coimmunoprecipitation (CoIP) og Western blot (WB)

påvisning av immunpresipiterte proteiner ved SDS-PAGE og WB ble utført som før [41]. Matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering massespektrometri (MALDI-MS) ble beskrevet i detalj i [29].

Immunofluorescence

Fargingen ble utført i tre-fargemodus visualisering 4,6- diamidino-to-phenylindole (DAPI), Alexa-488 og -594 bruke et digitalt kamera koblet (Axiovision, slipper 4.4) fluorescens mikroskop (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Hallbergmoos, Tyskland). Konfokalmikroskopi (Axiovert 40, Zeiss) og 3D-rekonstruksjon av H. pylori
-infected celler med LSM510 (Zeiss) og Volocity (Impro, Tübingen, Tyskland) ble gjort som før [37].

Histopatologisk evaluering og immunhistokjemi (IHC)

Kronisk aktiv gastritt ble definert ved den samtidige tilstedeværelse av både neutrofil polymorphnuclear (PMN) og mononukleære celler (lymfocytter og plasmaceller) i mageslimhinnen. Aktiv (PMN) og kronisk (mononukleær) infiltrat ble vurdert som følger: parafininnstøpte gastrisk vev ble kuttet i 3 um seksjoner ved hjelp av en halvautomatisk mikrotom (Leica Micro GmbH, Wetzlar, Tyskland). Seksjonene ble deretter farget ved hjelp av Hematoxylin & Eosin (H & E) løsninger. Den histopatologiske analyser ble utført av tre patologer (CR, SR, TK) blindet til studiet oppsettet. Morfologiske endringer i den gastriske slimhinne ble klassifisert i henhold til det oppdaterte Sydney system [32], [42]. Karakteren av gastritt ble scoret basert på tettheten av intramucosal inflammatoriske infiltrater fra mononukleære og PMN celler som er publisert før [43]: ingen (0), mild (1+), moderat (2+) og alvorlig (3+). I tillegg, hyperplastisk eller regenerative epiteliale endringer, var tapet av parietal-celler og hyppigheten av lymfoide follikler eller lymfoide aggregater notert. Intensiteten av H. pylori
kolonisering i mageslimhinnen ble registrert som mild (få og enkle bakterier i en tilfeldig fordeling), moderat (single og gruppert bakterier i en usammenhengende distribusjon) og alvorlige (tette bakterielle klynger som dekker mageslimhinnen i kontinuerlig lag). Flere score til ulike regioner i magen ble bestemt. Immunhistokjemi (IHC) ble utført på parafinsnitt som tidligere beskrevet [44].

Elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA), kromatin immunoutfelling (chip), revers transkripsjon PCR (RT-PCR) og kvantitativ PCR (qPCR)

brikke (Kit fra Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Tyskland) og alle andre metoder ble utført som beskrevet tidligere [45]. Oligonukleotider som er oppført i tabell S1.

Cellulære analyser

Levedyktighet av adherente celler ble målt ved hjelp av 1- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) 3,5-difenyl-formazan (MTT ) analyse (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) som anbefalt av produsenten. For å bestemme celle adhesjon, ble 1 × 10 ^{4 celler sådd ut i 6 cm cellekultur retter for 1 til 6 timer fulgt av gjentagende vask med PBS. De gjenværende festede celler ble fiksert med 4% (w /v) PFA i PBS, farget med krystallfiolett og deretter telt ved bruk av ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Sårheling analyser ble utført i det vesentlige som beskrevet i [46]. I korthet ble cellene dyrket til konfluens i 6 cm skåler, og en 5 mm ripe ble ført inn i monolaget ved å bruke en invertert blå spiss, etterfulgt av inkubering av cellekulturplater for ytterligere 24, 48 og 72 timer. Sårheling ble overvåket ved fiksering og farging av celler med krystallfiolett ved hjelp av lyse felt mikroskopi (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH).}

statistikker

Resultatene er midler ± S.E. fra minst 5 dyr pr genotype eller 3 uavhengige eksperimenter fra forskjellige celle passasjer. Programvaren GraphPad Prism (versjon 4.0, La Jolla, CA) ble benyttet for å analysere dataene. P-verdier (* p < 0,05) ble beregnet ved hjelp av Student t og Fisher Exact tester

deponeringsnummer

Menneskelig: Cav1. NM_001753.4, Q03135; B2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta-Actin: P60709; Lamin A: P02545; Lamin C: P02545; HSP90 alfa: P07900; HSP90 beta: P08238; ERK1 (P44): P27361; ERK2 (P42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Mus: Cav1: NM_007616.4, P49817; B2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNFa: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Dog: B2M: NC_006612, XP_850148; H. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB. YP_626814.1, Q1CV82

Resultater

Cav1-mangelfull mus viser forbedret gastritt ved infeksjon med CagA-levering inhabil H. pylori
SS1

Å vurdere histologiske endringer indusert i mage vev på H. pylori
infeksjon, B6129 WT og Cav1-KO mus ble infisert med musen-tilpasset og CagA-levering mangel H. pylori
belastning SS1. Musene ble avlivet 11 måneder senere, og H. pylori
ble isolert fra resected mage vev [31]. Cav1-KO mus viste mindre bakteriell kolonisering av mageslimhinnen enn WT mus (7,3 ± 2,4 WT versus
1,6 ± 0,5 KO × 10 ^{3 CFU /mg magen vev; * p = 0,0141; n = 15 per genotype) (fig. 1A). Histopatologisk analyse viste at både WT og Cav1-KO mus utviklet aktiv kronisk gastritt ledsaget av infiltrasjon av mononukleære og polymorphnuclear (PMN) celler inn i den gastriske slimhinne (Fig. 1B). I motsetning til dette, uinfiserte WT og Cav1-KO mus hadde ingen intramucosal betennelse (data ikke vist). I stedet, gastritt ble vesentlig styrket i H. pylori
-infected Cav1-KO mus sammenlignet med infiserte WT mus (Fig. 1C). I Cav1-KO mus, gjennomsnittlig score på gastritt (0,7 ± 0,2 WT versus
1,7 ± 0,1 KO; * p = 0,0002, n = 15 per genotype) var mer alvorlig (tabell 1) enn i WT mus og mageslimhinnene utstilt intramucosal B-celle follikler, foveolar hyperplasi og tap av parietal celler. Disse dataene tyder på at Cav1-mangel er forbundet med en økt inflammatorisk respons i den gastriske slimhinne, og en mindre effektiv kolonisering av H. pylori
.}

Cav1-mangel fremmer rekruttering av makrofager inn i den infiserte mageslimhinnen

For å vurdere identiteten til immunceller som bidrar til H. pylori
-relaterte betennelse i Cav1-KO mus, RT-qPCR analyse av utvalgte cytokiner, overflatemarkører og chemokiner ble utført (Fig. 2A). I samsvar med den observerte betennelse, H. pylori
SS1 indusert uttrykk for TNFa og IFNgamma i mageslimhinnen av både WT og KO mus. I tillegg uttalte vi en økt mRNA uttrykk av CD19 (B-celler) (1,6 ± 0,3 WT versus
3,3 ± 0,9 KO; p = 0,0512; n = 15 per genotype) og RANTES (CCL5) (1,3 ± 0,2 WT versus
2,1 ± 0,6 KO; p = 0,0449; n = 15 per genotype) i mage vev av H. pylori
-infected Cav1-KO mus sammenlignet med infiserte WT mus. I motsetning til dette, ble mRNA-nivåer av CD4 (T-hjelperceller), CD25 (T-regulerende celler) og CD86 (antigenpresenterende celler) undertrykket av H. pylori
uavhengig av Cav1 status. Immunhistokjemi (IHC) oppdaget en markant økning av intramucosal F4 /80-positive makrofager i mage vev av infiserte Cav1-KO mus sammenlignet med WT kullsøsken (Fig. 2B). CD3-positive lymfocytter ble plassert rundt og i intramucosal follikler (data ikke vist).

Lignende resultater ble oppnådd fra eksperimenter innføre hurtig gastrisk skade hos mus ved injeksjon av indometacin [30] (Fig.S1). I samsvar med den forbedrede vevsskade i Cav1-KO magene (* p = 0,0161, WT versus
KO, n = 9 per genotype), karakterisert ved inflammasjon, erosjon og sår, Cav1-manglende mus uttrykkes også høyere mengder av mRNA som koder for sårtilheling proteiner trekløverfaktor-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT versus
2,3 ± 0,4 KO; * p = 0,0048; n = 9 per genotype) og peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor gamma (PPARg) (0,6 ± 0,2 WT versus
2,5 ± 0,5 KO; * p = 0,0008; n = 9 per genotype). I sum er disse dataene viste at tap av Cav1 øker mottakelighet av mus til mage betennelse og vevsskade.

Cav1 verken endrer vedheft av H. pylori
stammer til eller overlevelse av menneskelige GC celler

For å vurdere funksjonen til Cav1 under H. pylori-infeksjon
in vitro
, den humane mage-epitelcellelinje AGS ble anvendt som var blitt stabilt transfektert med Cav1 ekspresjonsplasmid (AGS /Cav1) eller tom vektor (AGS /EV) [37]. Først undersøkte vi om Cav1 påvirker celleoverlevelse på H. pylori
infeksjon (fig. 3A). AGS kloner med og uten Cav1 ble infisert i 48 timer med mobiltilpassede CagA-levering kompetent H. pylori
belastning G27 på ulike multiplicities på infeksjon (MOI) som strekker seg fra 1:100 til 1:2000. Kolorimetriske MTT-analyser viste at Cav1 hadde ingen effekt på total overlevelse av AGS celler på H. pylori
infeksjon. Lignende resultater ble oppnådd med CagA-levering inhabil H. pylori
SS1 og ved Western blot (WB) analyse påvisning av ekspresjon og fosforylering av overlevelses kinaser (AKT /PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (data ikke vist). Siden begge H. pylori Hotell og Cav1 samhandle innenfor lipid flåter, spurte vi om adhesjon av bakterier til celler avhenger av tilstedeværelsen av Cav1. AGS /Cav1 og AGS /EV-celler ble infisert (MOI = 10) med G27 (fig. 3B, C) eller SS1 (data ikke vist) bakterier i 30 minutter, etterfulgt av vasking og påfølgende inkubasjon i friskt medium i 2 timer. Deretter ble cellene farget for immunfluorescens-mikroskopi, og antallet bakterier som klebet til den Cav1-uttrykkende eller tom vektor-transfiserte celler ble tellet (fig. 3B, C). Det ble ikke observert forskjeller i adhesjon mellom AGS /Cav1 og AGS /EV celler, noe som tyder på at Cav1 ikke påvirke vedheft av H. pylori
bakterier vertsceller.

Cav1 beskytter menneske GC cellene mot CagA-indusert omorganisering av cytoskjelettet

Dannelsen av nål-lignende anslag ( "humming bird") er et typisk morfologiske fenotype av AGS celler som respons på infeksjon med CagA-levering dyktig H. pylori
stammer og trans av CagA inn i cytosol [47]. For å undersøke hvilken rolle Cav1 i dette stress-indusert omorganisering av aktin cytoskjelettet, ble AGS /Cav1 og AGS /EV infisert i 16 timer med H. pylori
G27 wt
eller isogen mutant Delta CagA plakater (MOI = 100). Infiserte celler ble farget som beskrevet ovenfor, og antallet av langstrakte AGS-celler ble bestemt (Fig. 4A, B). Cav1-mangel AGS celler viste betydelig mer langstrakte morfologi enn Cav1-uttrykkende celler (11 ± 0,8% AGS /EV versus
4 ± 0,8% AGS /Cav1; * p = 1,1 × 10 ^{-8; n = 3 pr klon). Som ventet ble det ingen "humming bird" fenotype innhentet i celler infisert med CagA-levering mangel SS1 eller CagA-sletting mutant G27 Delta CagA
stammer som både er i stand til å injisere funksjonell CagA protein inn i vertsceller (data ikke vist). AGS /EV celler også produsert mer IL8 mRNA på H. pylori
G27 infeksjon enn AGS /Cav1 celler (64 ± 19 EV versus
19 ± 6 Cav1; * p = 0,0176; n = 3 per klone) (Fig. 4C). Disse data indikerte at Cav1 beskytter mot CagA relatert stress i cellene.}

Til støtte for disse funnene, celle adhesjon og lukking av sår priser var mer uttalt hos AGS /Cav1 sammenlignet med AGS /EV celler (Fig.S2). I samsvar med sin funksjon som et mål protein av CagA og komponent fokale sammenvoksninger [48], WB analyser (fig. 4D) også oppdaget høyere nivåer (0,4 ± 0,1 AGS /EV versus
1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 , * p = 0,0012; n = 3 pr klon) av fosforylert fokal adhesjonskinase (FAK) i Cav1-uttrykkende celler infisert med H. pylori
G27. Disse data bekreftet at AGS /Cav1 celler infisert med CagA-levering kompetent H. pylori
opprettholdt sin spredt ut epitelial form sammenlignet med stresset langstrakte fenotype av Cav1 /EV celler.

CagA-levering kompetent H. pylori
G27 utløser binding av p120RhoGAP /DLC1 å Cav1 i menneskelige GC celler

Cav1 har vist seg å bli fosforylert av cytosoliske tyrosin kinaser (SRC, ABL) på tyrosin 14 [49], og fosforylert Cav1 og src både aktivere de små GTPases Rho /Rac /Cdc42 som regulerer cytoskeletal funksjoner [13], [50]. For å identifisere den underliggende molekylære mekanismen hvordan Cav1 beskytter mot CagA relatert stress i cellene, vurdert vi de signalveier initiert av CagA-levering dyktig H. pylori
G27. Infeksjon av AGS celler fremkalt en rask fosforylering av Cav1 i AGS /Cav1 celler og av Src i begge AGS /Cav1 og AGS /EV celler. Dette resultat indikerte at Cav1 virker på nedstrømssiden av CagA-avhengige Src aktivering, men oppstrøms for aktivering av de små GTPases (Fig. 5A, B). I samsvar med denne konklusjonen, protein nivåer av fosforylert JNK, som ligger under av Src, var høyere i AGS /EV celler sammenlignet med AGS /Cav1 celler.

Vi klarte ikke å påvise en direkte interaksjon eller kvantitativ colocalization av CagA protein eller H. pylori
G27 bakterier med Cav1 i CoIP eller immunfluorescens eksperimenter (Fig. 6A, B). Gentamycin beskyttelse analyser viste at den totale mengden av injiserte intracellulær CagA var også uavhengig av Cav1 tilstedeværelse (Fig. 6C). Dermed Cav1 verken hemmet vedheft av H. pylori
bakterier til eller injeksjon av CagA i vertscellen, men snarere redusert nedstrøms effekter av CagA på intracellulær signalering.

For å identifisere en kandidat protein som gir beskyttelse mot CagA i en Cav1 avhengig måte, et protein interaksjon skjerm på grunnlag av MALDI-MS ble utført (fig. 7A). AGS /Cav1 celler ble infisert i 16 timer med H. pylori
G27 (MOI = 100), etterfulgt av lysis av cellene ved romtemperatur i MES-bufret 1% (v /v) Triton-X100. Proteinbånd utfelt ved Cav1 antiserum ble visualisert ved sølvfarging, og peptider ble identifisert ved MALDI-MS som er publisert tidligere [29]. Et protein fragment av ~95 kDa inneholdt peptider tilsvarende variant 4 av P120 Rho GTPase aktiverende protein /slettes i leveren kreft-en (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], en tumor suppressor forbundet med brennvoksninger og caveolae /lipid flåter [53]. DLC1 variant 4 (DLC1v4) har en anslått størrelse på ~110 kDa og ble beriket i prøver fra celler som hadde blitt smittet med H. pylori
G27 i forhold til uinfiserte celler (tabell S2). Disse resultatene ble bekreftet ved CoIP av Cav1 og endogent DLC1 protein i AGS /Cav1-celler (fig. 7B), som indikerer at H. pylori
G27 vakte en bestemt rekruttering av DLC1 å Cav1 i infiserte humane mage epitelceller.

Dette resultatet bedt oss om å forsterke cDNA av variant 4 av menneskelig DLC1 [39] fra menneske lever HepG2 celler (Fig . 7C). CDNA ble satt inn i ekspresjonsvektor pTarget (pT-DLC1v4) etterfulgt av forbigående transfeksjon inn i sperre AGS eller HEK293-celler i 24 timer. WB analyser påvises ekspresjon av et ~110 kDa protein, i overensstemmelse med den forutsagte størrelse av DLC1v4 [39]. Transient transfektert AGS cellene ble så infisert med H. pylori
G27 (MOI = 100) for ytterligere 16 timer. Immunfluorescens farging avslørte at DLC1 per se
hemmet ikke dannelsen av CagA-indusert "humming bird" fenotype (19 ± 2% AGS /DLC1 versus
19 ± 2% AGS /EV; n = 3 pr klon) sammenlignet med tom vektor-transfekterte celler (fig. 8A, B). I stedet DLC1 fremmet celle spredning (20 ± 3% AGS /DLC1 versus
11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067; n = 3 per klone) i samsvar med sin rolle i reguleringen av fokale sammenvoksninger [ ,,,0], H. H. pylori
infeksjon. pylori
.

• PLoS ONE: Forhøyede Interleukin-32 Expression er assosiert med Helicobacter pylori-Related Gastritis
• PLoS ONE: Målrettet Sletting av Kcne2 årsaker Gastritt Cystica Profunda og Gastric Neoplasia