PLO Patogeni: Caveolin-1 štiti miševe od B6129 Helicobacter pylori Gastritis

Sažetak pregled

Caveolin-1 (Cav1) je skela proteina i patogen receptora u sluznici gastrointestinalnog trakta. Kronična infekcija želuca epitelnih stanica u Helicobacter pylori pregled ( H. Pylori pregled) je glavni faktor rizika za ljudsko karcinoma želuca (GC), gdje Cav1 je često dolje regulirano. Međutim, funkcija Cav1 u H. pylori
infekcije i patogeneza GC ostao nepoznat. Pokazali smo da se ovdje Cav1 miševi s nedostatkom, zaraženo 11 mjeseci s CagA isporuke manjkav H. pylori pregled soj SS1, razvio težu gastritis i oštećenja tkiva, uključujući gubitak parijetalni stanice i foveolar hiperplazije, a prikazuje donji kolonizaciju želučane sluznice od divljeg tipa B6129 iz istog legla. Cav1-nula miševi pokazuju poboljšana infiltraciju makrofaga i B-stanica i lučenje citokina (RANTES) ali smanjenu količinu CD25 ^{+ regulacijskih T-stanica. Cav1 nedostatkom ljudske GC stanice (AGS), zaraženi CagA isporuke stručnjak h. pylori pregled soj G27, bili su više osjetljivi na CagA vezane citoskeletnih stres morfologija ( "kolibri") u odnosu na AGS stanice stabilno transficirane Cav1 (AGS /Cav1). Infekcija AGS /Cav1 stanice pokreću zapošljavanje p120 roGTPaza-aktivirajući protein /izbrisati u rak-1 jetre (p120RhoGAP /DLC1) da Cav1 i suzbiti CagA izazvanog citoskeletnih pregradnje. U ljudskim GC staničnih linija (MKN45, N87) i miš tkivu želuca, H. pylori
dolje regulira endogenog ekspresiju Cav1 neovisno o CagA. Mehanički, H. pylori
aktiviran sterol reagiraju elementa se veže na protein-1 (SREBP1) potisnuti transkripciju ljudskog gena od Cav1 sterola reagiraju elemenata (SRE) na proksimalnom Cav1 promotora. Ovi podaci sugerirali zaštitnu ulogu Cav1 protiv H. pylori
izazvanu upalu i oštećenje tkiva. Predlažemo da se H. pylori pregled eksploatira-dolje reguliranje Cav1 srušiti imunološkog odgovora domaćina i promicanja signalizaciju njezinih čimbenika virulencije u stanicama domaćina. pregled}

Autor Sažetak pregled

Infekcija bakterijom Helicobacter pylori pregled ( H. pylori pregled) uglavnom utječe na djecu u zemljama u razvoju koji su u opasnosti da napreduje do raka želuca (GC), kao odrasle osobe, nakon višegodišnjeg upornog infekcije, a posebno sa sojevima koji su pozitivni na onkogenih virulencije faktor CagA. Iskorjenjivanje H. pylori pregled antibioticima je lijek izbora, ali također može promijeniti osjetljivost na alergije i druge vrste tumora. Dakle, novi dijagnostički ili prognostički biljezi su potrebne što rano otkrivanje molekularnih promjena u sluznicu želuca tijekom tranzicije kronične upale do raka. U našem istraživanju, otkrili smo da je tumor supresor caveolin-1 (Cav1) reducira se na infekciju s H. pylori pregled i CagA bio dovoljan, ali nije nužno za ovaj down-regulacije. Gubitak Cav1 uzrokovano H. pylori pregled ovisna aktivacija sterola reagiraju elemenata-vezujući protein-1 (SREBP1), a ovaj događaj ukinuo interakciju Cav1 sa p120 roGTPaza koji aktivira protein /briše se u rak-1 jetre (p120RhoGAP /DLC1), drugi vjerodostojan pregled tumor supresor u želučanom tkivu. Zaključno, Cav1 i DLC1 može predstavljati nove molekularne markere u H. pylori
-infected želučane sluznice prije neoplastične transformacije epitela pregled

Izvor:. Hitkova sam, Yuan G, Anderl F, Gerhard M, Kirchner T, Reu S, et al. (2013) Caveolin-1 Štiti B6129 miševe od Helicobacter pylori
gastritis. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. doi: 10,1371 /journal.ppat.1003251 pregled

Urednik: Steven R. Blanke, University of Illinois, Sjedinjene Američke Države

Primljeno: 23. svibnja 2012; Prihvaćeno: 4. veljače 2013; Objavljeno: 11. travanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Hitkova et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od grantova EB i MPAE iz Deutsche Krebshilfe (108287) i DFG (BU-2285). MPAE također podržan od strane potpore iz Deutsche Krebshilfe (107885), DFG (SFB 824, TP B1), inače kruna Stiftung (br P14 /07 //A104 /06) i BMBF (Mobimed 01EZ0802;. KMU-innovativ Ne 0315116B The donatori imali nikakvu ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

u konkurenciji interese.. autori su izjavili da nema suprotstavljenih interesa postoji

Uvod

Helicobacter pylori pregled ( H. pylori pregled) je gram-negativna bakterija koja naseljava želuci od cca. 50% svjetske populacije i povećava rizik za razvoj kroničnih gastritis, peptički ulkus bolest, želučani sluznicu limfnog tkiva (MALT) limfom, mukozne atrofije i karcinom želuca (GC) [1], [2]. na temelju ovog etiologije, H. pylori pregled je klasificiran kao klasa i kancerogen od strane Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) 1994. godine [3]. pregled

Dva glavna H. pylori pregled toksina [4], CagA i Vaca, internaliziraju u želučanu epitelne stanice injekcijom putem sustava za izlučivanje IV na bakterijske vrste (CagA) [5] ili neposrednom umetanje u lipidnih splavi (vaca) [6], [7]. Lipidne nakupine su kolesterol i sfingolipid bogate mikrodomene plazma membranu [8], [9] koji se iskorištava mnoge patogene, uključujući viruse, parazite i bakterije, kako bi se olakšalo unos cijele organizme i /ili internalizacija toksina u stanice domaćina [ ,,,0],10], [11], [12]. Na primjer, Neisseria spec
. koristi lipidne splavi i Rho-posredovani prijenos signala aktinskog citoskeleta kako bi dobili pristup citosolu [13]. Pseudomonas aeruginosa pregled eksploatira lipida stanice epitela splav povezane Toll-like receptora 2 za infekciju pluća [14]. pregled

Caveolin-1 (Cav1) je 21-24 kDa velika i bitna strukturna protein caveolae, specijalizirani oblik lipidnih nakupina mikrodomena. Caveolae su 50-100 nm tikvicu /Cjevaste invaginacija plazma membrane obiluje makrofaga, stanica endotela i glatkih mišićnih stanica, tip I i ​​pneumocytes adipocita, gdje sudjeluju u transportnih stanične procese, uključujući endocitoze, istjecanja kolesterola i membranski promet [15] , [16]. U ovom kontekstu, Cav1 također može djelovati kao inhibitor clathrin neovisno endocitoze i blok patogena /toksin unosa [17], [18]. Vezanjem na njegovu skele domenu Cav1 izravno inhibira mnoštvo receptora i enzima, uključujući tirozin kinaza iz Src obitelji i Ras, G-proteina, i dušikovog oksida sintaze [15]. Osim uloge u membranske prometu Cav1 čime tvori kontrolni platformu za regulaciji stanične proliferacije i preživljavanja [19]. Cav1 također vrši važnu ulogu u staničnoj pokretljivosti i migracija te, u roku od stromalne i endotelnih tkiva, utoliko stanica-stanica kontakte, adheziju staničnog matriksa i imuni odgovor [20], [21], [22], [23] . pregled

Cav1 direktno veže kolesterol i transkripcija Cav1 negativno reguliran je faktora transkripcije sterola reagiraju elemenata-vezujući protein-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 vezan na endoplazmatski retikulum (ER) se inaktivni 125 kDa prekursora i aktivira u uvjetima nedostatak kolesterola proteolitičkim cijepanjem u Golgi aparata. To cijepanje slijedi premještanje aktivne 68 kDa SREBP1 u jezgru gdje se veže na sterola reagiraju elemenata (SRES) ciljnih gena, uključujući Cav1, koji su uključeni u sintezu kolesterola i masne kiseline [25]. H. pylori pregled Pokazano metabolizam kolesterola iz membranom stanice domaćina, i domaćin kolesterol mijenja onkogenski svojstva CagA [26], [27]. pregled

Stoga su hipotezu da je kolesterol vezni protein SREBP1 i Cav1 su mete H. pylori
infekcija i /ili izvršne funkcije. Naime, pitali smo da li (i) H. pylori pregled eksploatira Cav1 olakšati ubrizgavanje i nizvodnog signaliziranja CagA u želučanog epitela ili (ii) Cav1 djeluje kao zaštitna barijera "nametanje" proteina koje neutralizira bolesti potaknutog H. pylori
. Za ovaj test, fenotipovi koji proizlaze iz H. pylori infekcija pregled analiziran je Cav1-deficijentnih miševa i ljudi GC staničnim linijama. Naši podaci su pokazali da Cav1 zaštićena B6129 miševe protiv H. pylori pregled povezani s grupom gastritis i tkiva in vivo pregled neovisno o CagA. H. pylori također
aktivira SREBP1 i dolje reguliraju ekspresiju mišjih i ljudskih Cav1 neovisno CagA. Osim toga, Cav1 suzbiti CagA ovisni staničnog skeleta pregrađivanja In vitro
regrutiranih od tumorski supresor briše se u jetri rak-1 (DLC1). Pregled

materijali i postupci

Etika izjava pregled

Animal studije su provedena u skladu s etičkim smjernicama Technische Universität München (Zakon o njemačkom dobrobiti životinja, Deutsches Tierschutzgesetz) i bilo je odobreno (7.2-1-54-2531-74-08) od strane vlada Bavarske pregled

Životinje

homozigoti Cav1 nokaut (Cav1-KO) (soj Cav1tm1Mls /J, broj dionica 004.585) (Regierung von ÖBB, Minhen, Njemačka.). i uskladiti kontrolu divljih -tipa (WT) (soj B6129SF2 /J, broj dionica 101.045) miševi (8 tjedana) dobiveni su od Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) i održava se na mješoviti pozadini u patogena bez miša objekta [28], [ ,,,0],29]. Eksperimentalni želučane čireve je izvedena s indometacin kao što je objavljeno prije [30]. Infekcija miševa s mišem prilagođen CagA /Vaca isporuku manjkavo H. pylori pregled soj SS1 je provedena oralno sondom kao što je opisano [31]. Prosječno vrijeme miševi iz različitih genetskih pozadina (C57BL /6, B6129, BALB /c) poduzeti za napredak na kronični gastritis i izvan nje (želučani atrofije, hiperplazije, displazije) [32] kreće se između 10 i 15 mjeseca nakon infekcije sa standardiziranim pozivanjem soja SS1 [28], [33], [34], [35]. Stoga smo odlučili da obavlja svoju analizu u istom vremenskom razdoblju. pregled

Reagensi pregled

Kemikalije Merck (Darmstadt, Njemačka) ili Sigme (Taufkirchen, Njemačka). Poliklonalni serumi su SREBP1 (# PA1-46142, Thermofisher Scientific, Waltham, MA), Cav1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (b-300, SC-25766) FAK (a-17, sC-557), fosfo-FAK (Tyr-397, sC-11.765), Hsp90 alfa /beta (H-114, sC-7947), lamin a /C (H-110, sc- 20.681, a sve iz Santa Cruz Biotech., CA), opće i fosfo ERK1 /2 (P44 /p42), p38, JNK (svi iz stanične signalizacije, Danvers, MA) i Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Hamburg, Njemačka ). Mišja monoklonska antitijela su Cav1 (ɢ.406) i fosfo-Cav1 (pY14,ɣ.338) (oba iz BD /transdukcijom Lab., San Jose, CA), DLC-1 (C-12, SC-271.915) i beta-aktin (AC-15, SC-69879) (oba iz Santa Cruz Biotech.). Anti-mišji F4 /80 antitijelo makrofaga specifični štakora (# MF48000) dobiven je od Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Njemačka). Piletina anti H. pylori pregled poliklonalni Ab kako je opisano [36]. Seruma citokini su mjereni pomoću ELISA testa (R &D Systems, Minneapolis, MN), prema uputama proizvođača. Padajućih testove za male GTP Rho /RAC /Cdc42 su kupljene od Biocat (Heidelberg, Njemačka). Pregled

Kultura stanica pregled

bubrega ljudskog embrija (HEK293), Madin-Darby psećeg bubrega ( MDCK) roditeljske GC ljudske stanične linije (AGS, MKN45, N87) (sve su od American Type Culture Collection, Rockville, MD) i stabilno transfektiranih klonova njihove generira održavane su kao što je prethodno opisano [37]. Infekcija stanica sa stanica prilagođena CagA isporuke tečno H. pylori pregled soj G27 je izvedena kao i prije [36]. pregled

DNA konstrukti

plazmida ekspresije pEGFP-CagA se spominje i drugdje [38]. ~800 Bp fragment proksimalnog humanog Cav1 pokretača (AF019742, pozicija 69 do 859), [24] je amplificiran PCR-om od genomske DNA ljudske jetre normalnog i klonira u KpnI /Hindlll pGL3-luc reporterskim plazmidom (luciferaze Promega GmbH, Mannheim, Njemačka). Izoform 4 humanog DLC1 mRNA [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) je pojačan iz humanih hepatoma HepG2 stanica i umetnuti u BamHI /NotI u vektor ekspresije pTarget (PT, Promega GmbH). Prijelazne transfekcije i luciferaze testovi provedeni su kao i prije [37]. Pregled

bakterijske kulture

H. pylori
SS1 i G27 bakterije su se oporavila od -80 ° C glicerola dionice i uzgaja na Wilkins-Chalgren (WC) agar krvi ploče pod uvjetima microaerobic (10% CO2, 5% O2, 85% N2, 37 ° C) za 2-3 dana. H miša prilagoditi. pylori
SS1 prikupljen je iz agar ploče za In vivo
infekcija kao što je ranije [31] objavljena. SS1 soj bio PCR-pozitivna za CagA pregled gena i mRNA, ali nije se uvelo funkcionalni CagA proteina [40] Kao što se vidi po nedostatku "zuji ptica" fenotipa u zaraženim AGS stanicama (podaci nisu prikazani) , H stanica prilagođena. pylori bakterija pregled CagA isporuke stručnjak G27 wt pregled i CagA mutanta G27 Delta CAGA pregled su sakupljene iz agar pločama, a nakon toga uzgojene u kontinuiranom ko-kulturi s MDCK stanicama kao što je opisano [36]. pregled

Ex vivo pregled kvantifikacija jedinica koje stvaraju kolonije (CFUs) pregled

Cijeli želuci izdvojeni su iz miševa, a koloniziranje je mjeri se kao što je opisano u [31] , Antralne traka želuca se izvaže, stavljena u 5 ml Brucella juhe i miješaju 10 minuta. Razrjeđenja 1:10, 1:100 i 1:1000 su pripravljeni i 100 ul svakog razrjeđenja se nasadi na H. pylori
selektivnih WC krvnom agaru ploče. Broj bakterijskih kolonija određivan je poslije 5 dana, a normalizirane na masu odgovarajućih želuca komada. Pregled

Obrada mišjeg tkiva
želučane

Preostali želudac je ispran sa sterilnom vodom. Antralne strip smanjena, zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do ekstrakciju RNK. Ostatak želuca, stavi se u 3 ml 4% (w /v), paraformaldehida (PFA) u fosfatnom puferu (PBS) i inkubiraju 24 sata pri 4 ° C. Zatim, želudac je cut uz veće i male zakrivljenosti u dva dijela, nakon čega slijedi dehidracija i ugrađivanje u parafin za histološku analizu. Pregled

gentamicinom Test zaštita pregled

Ćelije su inficirane s H. pylori
G27 pritisak kroz 2 do 24 sata pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 500:1. Nakon toga, stanice su isprane tri puta s PBS-om kako bi se uklonila preostala bakterije i dodatno inkubiraju 2 sata na 37 ° C u vlažnoj atmosferi na DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella juha) obogaćenom s gentamicinom (200 ug /ml ), penicilina /streptomicina (100 ug /ml) i kloramfenikola (100 ug /ml). Odsutnost izvanstaničnim bakterijama potvrđena pod mikroskopom, a stanice se nakon toga liziraju za detekciju intracelularnog CagA Western blot (WB). Pregled

Coimmunoprecipitation (CoIP) i Western blot (WB) pregled

detekcija imunoprecipitiranim proteina pomoću SDS-PAGE i WB provedena je kao i prije, [41]. Matriksa uz pomoć laserska desorpcija /ionizacija masena spektrometrija (MALDI-MS) je detaljno opisano u [29]. Pregled

Imunofluorescencija pregled

Bojenje je provedeno u modu triple boja vizualizaciju 4,6 diamidino-2-fenilindolom (DAPI), Alexa-488 i -594 pomoću digitalnog fotoaparata povezanog (Axiovision, pustite 4.4) fluorescentnim mikroskopom (Axiovert 200m, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Hallbergmoos, Njemačka). Osnove optike mikroskopija (Axiovert 40, Zeiss) i 3D rekonstrukcija H. pylori pregled -infected stanice s LSM510 (Zeiss) i Volocity (Improvision, Tubingen, Njemačka) je učinjeno kao i prije [37]. pregled

Histopatološka procjena i imunohistokemijski (IHH) pregled

Kronični aktivni gastritis definiran istovremenom prisutnosti i neutrofilnih polymorphnuclear (PMN) i mononuklearnih stanica (limfocita i plazma stanica) unutar želučane sluznice. Aktivni (PMN) i kronične (mononuklearnih) infiltrat je ocijenjena kako slijedi: parafin uklopljenih želuca tkivo zatim je isječen u 3 um sekcije pomoću poluautomatskog mikrotoma (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Njemačka). Sekcije su zatim obojene korištenjem hematoksilina & Eozinom (H &E) rješenja. Histopatološko Analiza je provedena za tri patologa (CR, SR, tk) bio slijep za postavljanje studija. Morfološke promjene u sluznici želuca su klasificirani prema ažuriranoj Sydney sustava [32], [42]. Stupanj gastritis je zabio na temelju gustoće intramucosal upalnih infiltrata iz mononuklearnih i PMN stanice kao što je objavljeno prije [43]: ništa (0), blage (1+), umjerena (2+) i teške (3+). Osim toga, hiperplastičnih i regeneracije epitelne promjene, zabilježen je gubitak parietalnim stanicama i učestalost limfoidne folikule i limfoidnim agregatima. Intenzitet H. pylori pregled kolonizacija u želučanoj sluznici zabilježen kao blago (malo i pojedinačnih bakterija u slučajnom raspodjelom), umjeren (jednokrevetnim i skupljeno bakterija u diskontinuiranog distribuciji) i teške (gustim bakterijskim klasterima pokrivaju sluznicu želuca u stalnom slojeva). Više na desetine različitih područja želuca određena. Imunohistokemija (IHH) je izvedena na parafinskim rezovima, kao što je prije opisano [44]. Pregled

pokretljivosti pomak ispitivanje (EMSA), kromatina imunoprecipitacije (Chip) reverzne transkripcije PCR (RT-PCR) i kvantitativna PCR (qPCR) pregled

čip (Kit od Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Njemačka) i sve druge metode su izvedene kao što je prethodno opisano [45]. Oligonukleotidi su dani u Tabeli S1. Pregled

staničnih analiza

Vijabilnost adherentnim stanicama mjerena je 1- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 3,5-difenil-formazan (MTT ) test (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka), prema uputama proizvođača. Za određivanje stanične adhezije, 1 × 10 ^{4 stanice su nanesene u posude za stanične kulture 6 cm od 1 do 6 sati, a zatim ponavljaju ispiranja s PBS-om. Preostali adherentne stanice su fiksirane s 4% (w /v), PFA u PBS, obojene s kristalnim ljubičastim i zatim se broje pomoću ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Zacjeljivanja rana testovi su provedeni u biti kako je opisano u [46]. Ukratko, stanice su rasle do sjedinjenja u posude od 6 cm i 5 mm ogrebotina uvedena u monosloju pomoću obrnuti plavi vrh zatim inkubiranjem ploča stanične kulture još 24, 48 i 72 sata. Zatvaranja rana se prati na fiksacije i bojanja stanica s kristalnim ljubičastim koriste svijetle polje mikroskopije (Axiovert 200m, Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Pregled}

Statistika

Rezultati su srednje ± S. E. od najmanje 5 životinja po genotipa ili 3 nezavisna eksperimenta iz različitih staničnih prolaza. Softver GraphPad PRISM (verzija 4.0, La Jolla, CA) je upotrebljen za analizu podataka. P-vrijednosti (* p < 0,05) izračunate su korištenjem Student t i Fisher-ov egzaktni ispitivanja pregled

pristupnim brojevima

Ljudski: Cav1. NM_001753.4, Q03135; b2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta-aktin: P60709; LaminA: P02545; Lamin C: P02545; Hsp90 alfa: P07900; Hsp90 beta: P08238; ERK1 (P44): P27361; ERK2 (p42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Miš: Cav1: NM_007616.4, P49817; b2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNFalfa: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Pas: b2M: NC_006612, XP_850148; H. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB. YP_626814.1, Q1CV82 pregled

Rezultati

Cav1 miševi s nedostatkom prikazali poboljšane gastritis nakon infekcije s neodgovornim CagA isporuke H. pylori
SS1 pregled

Za procjenu histološku promjene izazvane u želučanom tkivu na H. pylori pregled infekcija, B6129 WT i Cav1-KO miševi su inficirani s mišem adaptirao i CagA isporuke manjkav H. pylori pregled soj SS1. Miševi su eutanazirani 11 mjeseci kasnije, i H. pylori pregled je izoliran iz resected tkivu želuca [31]. Cav1-KO miševi pokazali manje bakterijske kolonizacije na želučane sluznice nego WT miševa (7.3 ± 2.4 WT u odnosu na pregled 1.6 ± 0.5 KO × 10 ^{3 CFU /mg želudac tkiva; * p = 0,0141; n = 15 po genotipu) (Sl. 1). Patohistološko analiza pokazala je da su oba WT i Cav1-KO miševi razvili aktivni kronični gastritis pratnji infiltracija mononuklearnih i polymorphnuclear (PMN) stanica u sluznici želuca (Sl. 1b). Nasuprot tome, neinficirane WT i Cav1-KO miševi imali intramucosal upale (podaci nisu prikazani). Umjesto toga, gastritis znatno je poboljšana u H. pylori pregled -infected Cav1-KO miševa u usporedbi sa zaraženim WT miševa (Sl. 1 C). U Cav1-KO miševa, prosječna ocjena od gastritisa (0,7 ± 0,2 WT u odnosu na Netlogu 1,7 ± 0,1 KO * p = 0,0002, n = 15 po genotipu) bila je teža (Tablica 1) u odnosu na WT miševa i sluznicu želuca izložen intramucosal B-stanice, folikula foveolar hiperplazija i gubitak parijetalnih stanica. Ovi podaci ukazuju na to da Cav1-manjak je povezan s povećanim upalnog odgovora u sluznicu želuca i manje učinkovitom kolonizacije H. pylori pregled. pregled}

Cav1-deficiency potiče zapošljavanje makrofaga u zaraženo želučane sluznice pregled

Kako bi procijenili identitet imunološke stanice koje pridonose H. pylori pregled povezani s grupom upala u Cav1-KO miševa, RT-qPCR analiza odabranih citokina, površinskih markera i kemokina je izvedena (Sl. 2). U skladu s promatranom upale, H. pylori
SS1 induciranu ekspresiju TNFalfa i IFNgamma u želučanoj sluznici oba WT i KO miševa. Osim toga, navodi se povećanu ekspresiju mRNA za CD19 (B-stanice) (1.6 ± 0.3 WT nasuprot pregled 3.3 ± 0.9 KO; p = 0,0512, n = 15 po genotipa) i RANTES (CCL5), (1.3 ± 0,2 tež u odnosu na pregled 2.1 ± 0.6 KO; p = 0.0449; n = 15 po genotipu) u želučanom tkivu H. pylori pregled -infected Cav1-KO miševa u usporedbi sa zaraženim WT miševa. Nasuprot tome, razine mRNA CD4 (T-helper stanice), CD25 (regulacijske T-stanice) i CD86 (stanice koje prezentiraju antigen) su potisnuti H. pylori
neovisno o statusu Cav1. Imunohistokem (IHH) otkriven značajan porast intramucosal F4 /80 pozitivnih makrofaga u želučanom tkivu zaraženih Cav1-KO miševa u usporedbi s WT iz istog legla (sl. 2b). CD3-pozitivnih limfocita smješten oko i unutar intramucosal folikula (podaci nisu prikazani). Pregled

Slični rezultati su dobiveni iz pokusa uvode brzo ozljede želuca kod miševa ubrizgavanjem indometacin [30] (Fig.S1). U skladu s poboljšanom oštećenja tkiva u Cav1-KO želucima (* p = 0,0161, WT u odnosu na pregled, KO, n = 9 po genotipu), karakterizirana upalom, erozije i ulceracije, Cav1 miševi s nedostatkom također izrazio veće količine mRNA koje kodiraju za proteine ​​zarastanja čira trolisnim faktora-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT nasuprot pregled 2,3 ± 0,4 KO * p = 0,0048, n = 9 po genotipa) i aktivacije proliferacije peroksisoma receptor gama (PPARG) (0,6 ± 0,2 WT u odnosu na Netlogu 2,5 ± 0,5 KO * p = 0,0008; n = 9 po genotipu). Sve u svemu, ovi podaci ukazuju da gubitak Cav1 pojačava osjetljivost miševa na želučane upale i tkiva. Pregled

Cav1 ne mijenja prianjanje H. pylori pregled sojevi se, niti opstanak ljudske GC stanicama

Kako procijeniti funkciju Cav1 u H. pylori infekcija pregled in vitro pregled, ljudski želudac stanična linija epitelnih stanica je korišten AGS koje su stabilno transficirane s ekspresijskim plazmidom Cav1 (AGS /Cav1) ili praznim vektorom (AGS /EV) [37]. Prvo, ispitali smo je li Cav1 utječe na preživljavanje stanica na H. pylori
infekcije (Sl. 3A). AGS klonova sa i bez Cav1 su zaražene 48 sati sa stanice prilagođen CagA isporuke nadležnog H. pylori
soj G27 na različitim mnogostrukosti infekcije (MOI) u rasponu od 1:100 na 1:2000. Kolorimetrijskim MTT testom pokazala je da Cav1 nije imalo utjecaja na ukupno preživljenje AGS stanica nakon H. pylori
infekcije. Slični rezultati dobiveni su s neodgovornim CagA isporuke H. pylori
SS1 i Western blot (WB) analiza detektira ekspresiju i fosforilaciju preživljavanja AKT kinaza (/PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (podaci nisu prikazani). Budući da i H. pylori pregled i Cav1 interakciju unutar lipidnih splavi, pitali smo da li prianjanje bakterija na stanice ovisi o prisutnosti Cav1. AGS /Cav1 i AGS /EV stanice su zaražene (MOI = 10) s G27 (Sl. 3B, C) ili SS1 (podaci nisu prikazani) bakterije za 30 minuta, nakon čega slijedi ispiranje i zatim inkubacijom u svježi medij za 2 h. Nakon toga, stanice su obojene imunofluorescencije mikroskopom, a broj bakterija koje se ljepe na Cav1 koje eksprimiraju ili praznim vektorom-transfektirane stanice su prebrojane (Sl. 3B, C). Nisu primijećene razlike u adhezije između AGS /Cav1 i AGS /EV stanica, sugerirajući da Cav1 ne utječe na prianjanje H. pylori pregled bakterija na stanice domaćina. pregled

Cav1 štiti ljudska GC stanice od CagA izazvanog preuređenju citoskeleta pregled

Formiranje igličastih projekcija ( "kolibri") je tipičan morfološka fenotip AGS stanice kao odgovor na infekciju s CagA isporuke tečno H. pylori pregled, sojeva i translokacija CagA u citosolu [47]. Kako bi se ispitala uloga Cav1 u ovom izazvanog stresom preuređenju aktinskog citoskeleta, AGS /Cav1 i AGS /EV su zaražene 16 sati s H. pylori pregled G27 mas pregled ili Izogena mutant Delta CagA pregled (MOI = 100). Inficirane stanice su obojene kako je gore opisano, a broj izduženih AGS stanica određena (Sl. 4a, b). Cav1 nedostatkom AGS stanice pokazuju znatno više izdužena morfologije nego Cav1-izražavanje stanice (11 ± 0,8% AGS /EV u odnosu na pregled, 4 ± 0,8% AGS /Cav1 * p = 1,1 × 10 ^{-8; n = 3 po klona). Kao što se očekivalo, nijedan "kolibri" fenotipa je bio dobiven u stanicama inficiranim s CagA dostave manjkav SS1 ili CagA mutanta G27 Delta CAGA pregled sojeve koji su i ne bi se uvelo funkcionalni CAGA proteina u stanice domaćina (podaci nisu prikazani). AGS /EV stanice također producirao više IL8 mRNA na H. pylori pregled G27 infekcije od AGS /Cav1 stanice (64 ± 19 EV u odnosu na pregled, 19 ± 6 Cav1 * p = 0,0176; n = 3 po klona) (Sl. 4C). Ovi podaci pokazuju da Cav1 štiti stanične stresa CagA povezane. Pregled}

U prilog ovim nalazima, prianjanje stanica i zarastanje stope zatvaranja bili su izraženiji u AGS /Cav1 usporedbi s AGS /EV stanica (Fig.S2). U skladu sa svojom funkcijom kao ciljnog proteina CagA i komponente fokusa priraslica [48], SB-analize (Sl. 4D) također otkrila više razine (0,4 ± 0,1 AGS /EV u odnosu na
1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 * p = 0,0012; n = 3 po klona) fosforiliranog žarišne adhezije kinaze (FAK) u Cav1-izražavanje stanice zaražene H. pylori
G27. Ovi podaci potvrdio da AGS /Cav1 stanice zaražene CagA isporuke nadležnog H. pylori pregled održavaju rasprostranjenom epitela oblik u usporedbi sa stresom izduženom fenotipa Cav1 /EV stanica. pregled

CagA isporuka nadležno H. pylori pregled G27 aktivira vezanjem p120RhoGAP /DLC1 da Cav1 ljudskim GC stanicama pregled

Cav1 je pokazano da se fosforiliraju citosolnih tirozin kinaze (Src, Abl) na tirozin, 14 [49], a fosforilirana Cav1 i Src i aktiviranje malih GTP Rho /rAC /Cdc42 koji reguliraju citoskeleta funkcije [13], [50]. Kako prepoznati osnovni molekularni mehanizam kako Cav1 štiti stanične stresa CagA vezane, procjenjuje se signalne putove pokrenuo CagA isporuke tečno H. pylori
G27. Infekcija AGS stanica izazvala brzu fosforilaciju Cav1 u AGS /Cav1 stanica i Src u oba AGS /Cav1 i AGS /EV stanica. Ovaj rezultat pokazuje da Cav1 djeluje nizvodno CagA ovisnom aktiviranju Src a uzvodno od aktivacije malih GTP (Sl. 5A, B). U skladu s tim zaključkom, razina proteina fosforiliranog JNK, koja boravi u nastavku Src, bila je viša u AGS /EV stanica u usporedbi s AGS /Cav1 stanica. Pregled

Nismo uspjeli otkriti izravnu interakciju ili kvantitativnu ko-lokaliziranje CagA proteina ili H. pylori pregled G27 bakterije s Cav1 u CoIP ili imunoflorescencijom pokusi (sl. 6A, B). testovi za zaštitu gentamicin otkrila je da je ukupna količina ubrizganog intracelularne CagA bio neovisan o Cav1 prisutnosti (Sl. 6c). Dakle, Cav1 ne inhibira adheziju H. pylori pregled bakterija u niti injekcije CagA u stanicu domaćina, već smanjila nizvodnog učinke CagA na unutarstanične signalizacije. pregled

Kako prepoznati protein kandidata koji se stiče zaštitu od CagA u Cav1 ovisna način, na ekranu se interakcija protein temelji na MALDI-MS je izvedena (sl. 7a). AGS /Cav1 stanice su zaražene 16 sati s H. pylori pregled G27 (MOI = 100), a zatim razgradnje stanica na sobnoj temperaturi u MES puferiranoj 1% (v /v) Triton-X100. Proteinske vrpce istaloži Cav1 antiseruma su vizualizirani bojanje srebrom, a identificirani su peptidi pomoću MALDI-MS kao što je ranije [29] objavljena. Protein fragment ~95 kDa sadržane peptide koji odgovaraju varijanti 4. p120 Rho GTPaza aktivirajući protein /briše se u rak jetre-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], supresor tumora povezana s žarišnim priraslica i caveolae /lipidne nakupine [53]. DLC1 varijanta 4 (DLC1v4) ima predviđenu veličinu ~110 kDa i obogaćen je u uzorcima iz stanica koje su bile zaražene s H. pylori
G27 u odnosu na nezaražene stanice (Tablica S2). Ovi rezultati su potvrđeni CoIP od Cav1 i endogenih DLC1 proteina u AGS /Cav1 stanica (Sl. 7b), što ukazuje da H. pylori pregled G27 izazvala određenu zapošljavanje DLC1 da Cav1 u zaraženim ljudskim stanicama epitela želučanih. pregled

Ovaj rezultat potaknuo nas je na cDNA varijante 4. ljudskog DLC1 [39] iz humane hepatoma HepG2 stanica (Sl . 7C). CDNA je umetnut u ekspresijski vektor pTarget (PT-DLC1v4) nakon tranzientnom transfekcijom u roditeljski AGS ili HEK293 stanica za 24 sata. WB analize otkriti izražavanje kDa protein ~110, u skladu s predviđenoj veličini od DLC1v4 [39]. Prijelazno transficirane AGS Stanice su zatim inficirane s H. pylori
G27 (MUP = 100) za dodatnih 16 sati. Imunofluorescencija bojenje otkrila da DLC1 per se pregled ne inhibiraju formiranje CagA izazvanog "zuji ptica" fenotipa (19 ± 2% AGS /DLC1 u odnosu na pregled, 19 ± 2% AGS /EV; n = 3 po klona) u usporedbi sa praznim vektorom-transfektirane stanice (Sl. 8A, B). Umjesto toga, DLC1 promovirao stanicu širi (20 ± 3% AGS /DLC1 u odnosu na
11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067; n = 3 po klon) u skladu s njegovom ulogom u regulaciji žarišnih prianjanja [ ,,,0], H. H. pylori
infekcije. pylori
.