PLoS Pathogens: caveolina-1 protege a los ratones contra B6129 gastritis por Helicobacter pylori

Extracto

caveolina-1 (Cav1) es una proteína de andamiaje y el receptor de patógenos en la mucosa del tracto gastrointestinal. La infección crónica de las células epiteliales gástricas por Helicobacter pylori gratis ( H. pylori
) es un importante factor de riesgo para el cáncer gástrico humano (GC), donde Cav1 es con frecuencia las reguladas. Sin embargo, la función de Cav1 en H. pylori
infección y patogénesis de la GC permaneció desconocido. Mostramos aquí que los ratones deficientes en Cav1, infectaron durante 11 meses con el CagA-un deficiente servicio H. pylori
cepa SS1, desarrolló gastritis más graves y daños en los tejidos, incluyendo la pérdida de células parietales y la hiperplasia foveolar, y presentaba menor colonización de la mucosa gástrica que sus compañeros de camada B6129 de tipo silvestre. Cav1 ratones nulos mostraron una mayor infiltración de macrófagos y las células B y la secreción de quimiocinas (RANTES), pero habían reducido los niveles de CD25 ^{+ células T reguladoras. Cav1 células deficientes en humanos GC (AGS), infectados con el CagA-entrega dominio del H. pylori cepa
G27, eran más sensibles al estrés morfologías citoesqueleto relacionados CagA-( "colibrí") en comparación con las células AGS transfectadas de forma estable con Cav1 (AGS /Cav1). La infección de células AGS /Cav1 desencadenó el reclutamiento de p120 RhoGTPase-activación de la proteína /borrados en el cáncer de hígado-1 (p120RhoGAP /DLC1) para Cav1 y contrarrestado reordenamientos del citoesqueleto CagA-inducida. En líneas celulares humanas (GC MKN45, N87) y tejido del estómago de ratón, H. pylori
expresión endógena de las reguladas Cav1 independientemente de CagA. Mecánica, H. pylori
activa esterol sensible elemento de unión a la proteína-1 (SREBP1) para reprimir la transcripción del gen Cav1 humano a partir de elementos de esterol-sensible (ERE) en el promotor Cav1 proximal. Estos datos sugieren un papel protector contra Cav1 de H. pylori
inducida por la inflamación y el daño tisular. Proponemos que H. pylori
explota la baja regulación de Cav1 para subvertir la respuesta inmune del huésped y para promover la señalización de sus factores de virulencia en las células huésped.}

Autor Resumen

La infección con la bacteria Helicobacter pylori gratis ( H. pylori
) afecta principalmente a los niños en los países en desarrollo que están en riesgo de progresar a cáncer gástrico (CG) como adultos después de muchos años de infección persistente, especialmente con cepas que son positivas para CagA el factor de virulencia oncogénico. Erradicación de la H. pylori fotos: por antibióticos es un tratamiento de elección, pero también puede alterar la susceptibilidad a las alergias y otros tipos de tumores. Por lo tanto, se necesitan marcadores de diagnóstico o pronóstico novedosos que detectan cambios moleculares tempranos en la mucosa del estómago durante la transición de la inflamación crónica con el cáncer. En nuestro estudio, encontramos que el supresor tumoral caveolina-1 (Cav1) se reduce a la infección por H. pylori
, y CagA fue suficiente pero no necesaria para esta regulación a la baja. La pérdida de Cav1 fue causado por H. pylori
activación dependiente de esterol sensible proteína-1 (SREBP1), y este evento abolido la interacción de Cav1 con la proteína p120 RhoGTPase de activación /borrado en el cáncer de hígado-1 (p120RhoGAP /DLC1) elemento vinculante, un segundo de buena fe
supresor de tumor en el tejido gástrico. En conclusión, Cav1 y DLC1 pueden constituir nuevos marcadores moleculares en el H. pylori
infectado con mucosa gástrica antes de la transformación neoplásica del epitelio

Visto:. Hitkova I, Yuan G, F Anderl, Gerhard M, T Kirchner, Reu S, et al. (2013) caveolina-1 protege a los ratones contra B6129 La gastritis por Helicobacter pylori
. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. doi: 10.1371 /journal.ppat.1003251

Editor: Steven R. Blanke, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América

Recibido: 23 de mayo de 2012; Aceptado: February 4, 2013; Publicado: 11 Abril 2013

Derechos de Autor © 2013 Hitkova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas a EB y MPAE de la Deutsche Krebshilfe (108.287) y la DFG (BU-2285). MPAE también es apoyado por becas de la Deutsche Krebshilfe (107885), DFG (SFB 824, TP B1), Else Kröner Stiftung (Nr P14 /07 //A104 /06) y el BMBF (Mobimed 01EZ0802;. UGC-Innovativ Sin 0315116B El proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Helicobacter pylori gratis ( H. pylori
) es una bacteria Gram-negativa que coloniza el estómago de aprox. 50% de la población mundial y aumenta el riesgo de desarrollo de enfermedades crónicas gastritis, enfermedad de úlcera péptica, gástrica mucosa-tejido linfoide asociado (MALT), atrofia de la mucosa y cáncer gástrico (GC) [1], [2]. sobre la base de esta etiología, H. pylori
ha sido clasificado como un carcinógeno de clase I por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1994 [3].

los dos principales H. pylori
toxinas [4], CagA y VacA, se internaliza en gástrica células epiteliales por inyección a través del sistema de secreción de tipo IV bacteriana (CagA) [5] o por la inserción directa en las balsas de lípidos (VacA) [6], [7]. Las balsas de lípidos son el colesterol y esfingolípidos ricos en microdominios de la membrana plasmática [8], [9], que son explotados por muchos agentes patógenos, incluyendo virus, parásitos y bacterias, para facilitar la toma de organismos enteros y /o internalización de toxinas en las células huésped [ ,,,0],10], [11], [12]. Por ejemplo, Neisseria especificación
. utiliza balsas de lípidos y la señalización mediada por Rho del citoesqueleto de actina para obtener acceso al citosol [13]. Pseudomonas aeruginosa
explota las células epiteliales de la balsa-asociado toll-like receptor 2 para la infección de pulmón de lípidos [14].

caveolina-1 (Cav1) es el 21-24 kDa importante y esencial estructural proteína de caveolas, una forma especializada de microdominios balsa lipídica. Caveolae son 50-100 matraz nm /invaginaciones en forma de tubo de la membrana plasmática abundante en los macrófagos, células endoteliales y de músculo liso, neumocitos de tipo I y adipocitos, donde participan en los procesos de transporte celulares incluyendo la endocitosis, el eflujo de colesterol y el tráfico de membrana [15] , [dieciséis]. En este contexto, Cav1 también puede actuar como un inhibidor de la endocitosis clathrin-independiente y el bloque de patógeno /absorción de la toxina [17], [18]. A través de la unión a su dominio andamios, Cav1 inhibe directamente una gran cantidad de receptores y enzimas, incluyendo tirosina quinasas de la familia Src y Ras, las proteínas G y sintasas de óxido nítrico [15]. Además de un papel en el tráfico de membrana, Cav1 tanto, constituye una plataforma de control para la regulación de la proliferación celular y la supervivencia [19]. Cav1 también ejerce una importante función en la motilidad celular y la migración y, dentro epitelial, estromal y los tejidos endoteliales, mediante la aplicación de contactos célula-célula, la adhesión célula-matriz y las respuestas inmunes [20], [21], [22], [23] .

Cav1 une directamente el colesterol, y la transcripción de Cav1 está regulada negativamente por el factor de transcripción de esterol sensible elemento vinculante proteína-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 está unido al retículo endoplásmico (ER) como un precursor inactivo 125 kDa y se activa en condiciones de deficiencia de colesterol por escisión proteolítica en el aparato de Golgi. Esta escisión es seguida por la translocación de la activo 68 SREBP1 kDa en el núcleo donde se une a elementos de esterol-sensible (SRE) de genes diana, incluyendo Cav1, que participan en la síntesis de colesterol y ácidos grasos [25]. H. pylori
se ha demostrado para metabolizar el colesterol de la membrana de la célula huésped, y el colesterol de acogida altera las propiedades oncogénicas de CagA [26], [27].

Por lo tanto, la hipótesis de que la unión de colesterol-proteínas SREBP1 y Cav1 son objetivos de H. pylori
funciones de infección y /o efectoras. En concreto, nos preguntamos si (i) H. pylori
hazañas Cav1 para facilitar la inyección y la señalización corriente abajo de CagA en las células epiteliales gástricas o (ii) Cav1 actúa como una proteína protectora "barrera de ejecución" que contrarresta la enfermedad provocada por H. pylori
. Para probar esto, los fenotipos que resultan de H. pylori
la infección se estudió en ratones con deficiencia de Cav1 y en líneas celulares humanas GC. Nuestros datos muestran que los ratones Cav1 protegida contra B6129 H. pylori
-relacionado la gastritis y el daño tisular in vivo
independientemente de CagA. H. pylori
también activó SREBP1 y la expresión regulada hacia abajo de murino y humano Cav1 independientemente de CagA. Además, Cav1 contrarrestado reordenamientos del citoesqueleto CagA-dependientes in vitro fotos: por contratación del supresor de tumores en el hígado eliminado el cáncer-1 (DLC1).

Materiales y Métodos

Ética declaración

los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas de la Technische Universität München (Ley alemana de Bienestar Animal, Deutsches Tierschutzgesetz) y había sido aprobado (7.2-1-54-2531-74-08) por el gobierno de Baviera

Animales

homocigótica Cav1 knockout (KO) Cav1-(Cav1tm1Mls cepa a /J; el código RS 004.585) (Regierung von Obb, Munich, Alemania.). igualado y salvaje de control de tipo (WT) (cepa B6129SF2 /J; el código RS 101045) ratones (8 semanas) se obtuvieron del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine) y se mantuvieron en un fondo mixto en una instalación de ratón libre de patógenos [28], [ ,,,0],29]. ulceración gástrica Experimental se realizó con indometacina tal como se publicó antes [30]. La infección de ratones con deficiencia de la H CagA /vaca-entrega adaptada a ratón. pylori
cepa SS1 se realizó por sonda oral como se describe [31]. Los ratones tiempo medio de diferentes orígenes genéticos (C57BL /6, B6129, Balb /c) llevan a progresar a la gastritis crónica y más allá (atrofia gástrica, hiperplasia, displasia) [32] oscila entre 10 y 15 meses después de la infección con la referencia normalizada cepa SS1 [28], [33], [34], [35]. Por tanto, decidimos realizar nuestro análisis dentro de este marco de tiempo.

Reactivos

productos químicos fueron de Merck (Darmstadt, Alemania) o Sigma (Taufkirchen, Alemania). antisueros policlonales fueron SREBP1 (# PA1-46142, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), Cav1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (b-300, SC-25766) , FAK (A-17, SC-557), fosfo-FAK (Tyr-397, SC-11765), Hsp90 alfa /beta (H-114, SC-7947), Lamin A /C (H-110, SC- 20681, todos de Santa Cruz Biotech., CA), ERK1 general y fosfo /2 (p44 /p42), p38, JNK (todos de Señalización celular, Danvers, MA) y Ki-67 (SP6, DCS GmbH, Hamburgo, Alemania ). Los anticuerpos monoclonales de ratón eran Cav1 (ɢ406) y fosfo-Cav1 (PY14,ɣ338) (ambos de BD /Transducción Lab., San Jose, CA), DLC-1 (C-12, sc-271915) y beta-actina (AC-15, sc-69879) (ambos de Santa Cruz Biotech.). La rata específico de macrófagos de ratón anti-F4 80 anticuerpo /(# MF48000) se obtuvo de Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Alemania). Pollo anti- H. pylori
policlonal Ab se utilizó como se describe [36]. citoquinas en suero se midieron por ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) según las instrucciones del fabricante. Pull-down ensayos para las pequeñas GTPasas Rho /Rac /Cdc42 se adquirieron de Biocat (Heidelberg, Alemania).

Cultivo de células

riñón embrionario humano (HEK293), Madin-Darby de riñón canino ( MDCK), las líneas celulares GC humanos parentales (AGS, MKN45, N87) (todos de la American Type Culture Collection, Rockville, MD) y los clones transfectados de manera estable generados de los mismos se mantuvieron como se describe anteriormente [37]. La infección de las células con el dominio del H adaptada a la célula CagA-parto. pylori
G27 cepa se realizó como antes [36].

ADN construcciones

El plásmido de expresión pEGFP-CagA se mencionó en otra parte [38]. El fragmento de ~ 800 pb del promotor Cav1 humana proximal (AF019742, la posición 69 a 859) [24] se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de hígado humano normal y se clonó en los sitios KpnI /HindIII de plásmido informador de luciferasa pGL3-luc ( Promega GmbH, Mannheim, Alemania). Isoforma 4 del ARNm DLC1 humano [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) se amplificó a partir de células de hepatoma HepG2 humanos y insertó en los sitios BamHI /NotI del vector de expresión pTarget (pT, Promega GmbH). ensayos de transfección y luciferasa transitoria se realizaron como antes [37]

El cultivo bacteriano

H.. pylori SS1
y bacterias G27 fueron recuperados de las existencias de glicerol C -80 ° y cultiva en Wilkins-Chalgren (WC) placas de agar sangre en condiciones microaeróbicas (CO2 al 10%, 5% O2, 85% N2; 37 ° C) para 2-3 días. El H adaptada a ratón. pylori SS1
fue cosechada de placas de agar para in vivo
infecciones según lo publicado anteriormente [31]. La cepa SS1 fue PCR-positivo para el cagA
gen y el ARNm pero no inyectar la proteína CagA funcional [40], como es evidente por la ausencia del fenotipo "colibrí" en las células AGS infectados (datos no mostrados) . El H adaptada a la célula. pylori CagA
bacterias entrega dominio del G27 en peso
y la CagA-supresión mutante G27 Delta cagA
se recogieron de las placas de agar y posteriormente se cultiva en continua co-cultivo con células MDCK como se describe [36].

Ex vivo
cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC)

estómagos enteros fueron extirpados de los ratones, y la formación de colonias se determinó esencialmente como se describe [31] . Una tira antral del estómago se pesó, se colocó en 5 ml de caldo de Brucella y se agitó durante 10 min. Se prepararon diluciones de 1:10, y 1:100 1:1000, y 100 l de cada dilución se sembraron en H. pylori
placas de agar sangre WC selectivos. Se determinó el número de colonias bacterianas después de 5 días y se normalizaron al peso de las piezas de estómago correspondientes.

Tratamiento de ratón gástrico
tejido

El estómago restante se lavó con agua estéril. Se cortó una tira antral, congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta la extracción de ARN. El resto del estómago se colocó en 3 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante 24 horas a 4 ° C (w /v). Entonces, el estómago se corta a lo largo de la curvatura mayor y pequeña en dos mitades, seguido de deshidratación e incrustación en parafina para el análisis histológico.

Gentamicina ensayo de protección

Las células fueron infectadas con el MARIDO. pylori
cepa G27 durante 2 a 24 h a una multiplicidad de infección (MOI) de 500:1. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar las bacterias residuales y se incubaron adicionalmente durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada en DMEM /F12 (10% de FCS, 10% de caldo de Brucella) suplementado con gentamicina (200 mg /ml ), penicilina /estreptomicina (100 mg /ml) y cloranfenicol (100 g /ml). La ausencia de bacterias extracelulares se confirmó con el microscopio, y las células se lisaron posteriormente para la detección de CagA intracelular por Western blot (WB).

coimmunoprecipitation (CoIP) y Western blot (WB)

La detección de proteínas inmunoprecipitadas mediante SDS-PAGE y WB se realizó como antes [41]. Desorción láser /ionización de espectrometría de masas asistida por matriz (MALDI-MS) se describe en detalle en [29].

inmunofluorescencia

La tinción se realizó en el modo de triple color de la visualización de 4,6- diamidino-2-fenilindol (DAPI), Alexa-488 y -594 con una cámara conectada a digital (Axiovision, liberan 4,4) microscopio de fluorescencia (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Hallbergmoos, Alemania). La microscopía confocal (Axiovert 40, Zeiss) y la reconstrucción 3D de H. pylori
células infectadas con LSM510 (Zeiss) y Volocity (Improvisación, Tübingen, Alemania) se realizó como antes [37].

evaluación histopatológica e inmunohistoquímica (IHC)

crónica activa gastritis se definió por la presencia simultánea de ambos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) y células mononucleares (linfocitos y células plasmáticas) dentro de la mucosa gástrica. Activo (PMN) y crónica (mononuclear) infiltrado se evaluó como sigue: tejido gástrico incluidas en parafina se cortó en 3 micras secciones usando un microtomo semi-automática (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). Las secciones fueron teñidas utilizando hematoxilina & Eosina (H & E) soluciones. El análisis histopatológico se llevó a cabo por tres patólogos (CR, SR, TK) cegados a la configuración del estudio. Las alteraciones morfológicas en la mucosa gástrica se clasifican de acuerdo con el sistema de Sydney actualizado [32], [42]. El grado de la gastritis fue anotado basa en la densidad del infiltrado inflamatorio mononuclear y intramucosos de células PMN según lo publicado antes [43]: ninguno (0), leve (1+), moderada (2+) y grave (3+). Además, hiperplásico o alteraciones epiteliales regenerativas, se observaron pérdida de células parietales y la frecuencia de los folículos linfoides o agregados linfoides. La intensidad de H. pylori
colonización en la mucosa gástrica se registró como (pocos y simples bacterias en una distribución aleatoria) leves, (bacterias individuales y agrupados en una distribución discontinua) moderada y grave (clusters bacterianas densos que cubren la mucosa gástrica en capas continuas). se determinaron múltiples puntuaciones de las diferentes regiones del estómago. La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en secciones de parafina como se describió anteriormente [44].

ensayos de movilidad electroforética (EMSA), inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), transcripción inversa PCR (RT-PCR) y PCR cuantitativa (qPCR)

chip (Kit de Upstate, Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y todos los demás métodos se realizaron como se describe anteriormente [45]. Los oligonucleótidos se listan en la Tabla S1.

ensayos celulares

viabilidad de las células adherentes se midió por 1- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 3,5-difenil-formazán (MTT ) ensayo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) según lo recomendado por el fabricante. Para determinar la adhesión celular, 1 × 10 ^{4 células fueron sembradas en 6 cm placas de cultivo celular de 1 a 6 h, seguido de lavado repetido con PBS. Las células adherentes restantes se fijaron con 4% (w /v) de PFA en PBS, se tiñeron con cristal violeta y posteriormente contado usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD). ensayos de curación de la herida se realizaron esencialmente como se describe en [46]. Brevemente, las células fueron cultivadas hasta la confluencia en placas de 6 cm, y un 5 mm cero se introdujo en la monocapa usando una punta azul invertida seguida de la incubación de las placas de cultivo celular para adicional 24, 48 y 72 h. Cierre de la herida se controló a la fijación y tinción de las células con cristal violeta utilizando microscopía de campo brillante (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH).}

Estadísticas

Los resultados son medias ± S. E. de al menos 5 animales por genotipo o 3 experimentos independientes de diferentes pases celulares. El software GraphPad Prism (versión 4.0, La Jolla, CA) se utilizó para analizar los datos. Los valores de P (* P < 0,05) se calcularon utilizando la t de Student y la prueba exacta de Fisher

Los números de acceso

Humano: Cav1:. NM_001753.4, Q03135; b2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 v1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 v4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta-actina: P60709; Lamina A: P02545; Lamin C: P02545; alfa Hsp90: P07900; beta Hsp90: P08238; ERK1 (p44): P27361; ERK2 (p42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Ratón: Cav1: NM_007616.4, P49817; b2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNF-alfa: NM_013693.2, P06804; IFN: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Perro: b2M: NC_006612, XP_850148; H. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB:. YP_626814.1, Q1CV82

Resultados

ratones con deficiencia de Cav1 mostrar una mayor gastritis después de la infección con incompetente CagA-entrega H. pylori SS1

Para evaluar los cambios histológicos inducidos en tejido gástrico en H. pylori
infección, B6129 ratones WT y Cav1-KO estaban infectados con el ratón adaptado y CagA-un deficiente servicio H. pylori
cepa SS1. Los ratones fueron sacrificados 11 meses más tarde, y H. pylori
se aisló de tejido del estómago resecado [31]. ratones Cav1-KO mostró colonización menos bacteriana de la mucosa gástrica que los ratones WT (7,3 ± 2,4 WT frente
1,6 ± 0,5 × 10 KO ^{3 tejido del estómago CFU /mg; * p = 0,0141; n = 15 por genotipo) (Fig. 1A). El análisis histopatológico reveló que los ratones WT y tanto Cav1-KO desarrollan gastritis crónica activa acompañado por la infiltración de células polimorfonucleares (PMN) mononuclear y en la mucosa gástrica (Fig. 1B). En contraste, los ratones WT y Cav1-KO no infectados no tenían inflamación intramucoso (datos no mostrados). En cambio, la gastritis fue notablemente mayor en H. pylori
infectados con ratones Cav1-KO en comparación con ratones WT infectados (Fig. 1C). En ratones Cav1-KO, la puntuación media de la gastritis (0,7 ± 0,2 WT frente
1,7 ± 0,1 KO; * p = 0,0002, n = 15 por genotipo) fue más severo (Tabla 1) que en ratones WT , y la mucosa del estómago expuesto intramucoso folículos de células B, hiperplasia foveolar y la pérdida de las células parietales. Estos datos indican que Cav1-deficiencia se asocia con un aumento de la respuesta inflamatoria en la mucosa gástrica y una colonización menos eficiente por H. pylori
.}

Cav1 por deficiencia promueve el reclutamiento de los macrófagos en la mucosa gástrica infectada

Para evaluar la identidad de las células inmunes que contribuyen a H. Se realizó pylori
inflamación -relacionado en ratones Cav1-KO, análisis de RT-qPCR de ciertas citocinas, quimiocinas y marcadores de superficie (Fig. 2A). En consonancia con la inflamación observada, H. pylori SS1
expresión inducida de TNF-alfa y IFN en la mucosa gástrica de ambos y ratones KO. Además, establecimos un aumento de la expresión de ARNm de CD19 (células B) (1,6 ± 0,3 WT frente
3,3 ± 0,9 KO; p = 0,0512; n = 15 por genotipo) y RANTES (CCL5) (1,3 ± 0,2 WT frente a 2,1 ± 0,6
KO; p = 0,0449; n = 15 por genotipo) en el tejido gástrico de los H. pylori
infectados con ratones Cav1-KO en comparación con ratones WT infectados. Por el contrario, los niveles de mRNA de las células CD4 (células T auxiliares), CD25 (células T reguladoras) y CD86 (células presentadoras de antígeno) fueron suprimidos por H. pylori
independientemente del estado Cav1. La inmunohistoquímica (IHC) detectó un marcado incremento de F4 intramucoso /macrófagos 80-positivas en el tejido gástrico de los ratones Cav1-KO infectados en comparación con los compañeros de camada WT (Fig. 2B). linfocitos CD3-positivas se encuentran alrededor y dentro de los folículos intramucosos (datos no mostrados).

Resultados similares se obtuvieron a partir de experimentos que introducen una lesión gástrica rápida en ratones mediante la inyección de indometacina [30] (Fig.S1). En consonancia con el daño tisular mejorada en los estómagos Cav1-KO (* p = 0,0161, WT frente
KO, n = 9 por genotipo), caracterizada por la inflamación, la erosión y la ulceración, los ratones deficientes en Cav1 también expresaron cantidades más altas de los ARNm que codifican para proteínas de curación de la úlcera del trébol de factor 2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT frente a 2,3 ± 0,4
KO; * p = 0,0048; n = 9 por genotipo) y peroxisoma proliferador activado del receptor- gamma (PPARg) (0,6 ± 0,2 WT frente a 2,5 ± 0,5
KO; * p = 0,0008; n = 9 por genotipo). En resumen, estos datos indican que la pérdida de Cav1 aumenta la susceptibilidad de los ratones a la inflamación gástrica y daño tisular.

adhesión altera de H Cav1 ninguno. pylori
cepas que ni supervivencia de las células humanas GC

Para evaluar la función de Cav1 durante el H. pylori
infección por in vitro
, la línea celular humana gástrica epitelial se utilizó AGS que habían sido transfectadas establemente con el plásmido de expresión Cav1 (AGS /Cav1) o vector vacío (AGS /EV) [37]. En primer lugar, se examinó si Cav1 influye en la supervivencia celular tras la H. pylori
infección (Fig. 3A). clones de AGS con y sin Cav1 se infectaron durante 48 h con el competente H adaptada a la célula CagA-parto. pylori
G27 cepa en diferentes multiplicidades de infección (MOI) que van desde 1:100 a 1:2000. ensayos de MTT colorimétricos revelado que Cav1 no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia global de las células AGS a H. pylori
infección. Resultados similares se obtuvieron con incompetente CagA-entrega H. pylori SS1
y por análisis Western blot (WB) la detección de la expresión y la fosforilación de las quinasas de supervivencia (AKT /PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (datos no mostrados). Dado que tanto H. pylori Opiniones y Cav1 interactúan dentro de las balsas lipídicas, nos preguntamos si la adhesión de las bacterias a las células depende de la presencia de Cav1. AGS /Cav1 y células /EV AGS se infectaron (MOI = 10) con G27 (Fig. 3B, C) o SS1 (datos no mostrados) para las bacterias 30 min, seguido de lavado y la posterior incubación en medio fresco durante 2 h. Posteriormente, las células se tiñeron para microscopía de inmunofluorescencia, y el número de bacterias que se adhirió a la Cav1-expresión o las células transfectadas con el vector vacío se contaron (Fig. 3B, C). No se observaron diferencias en la adhesión entre AGS /Cav1 y las células AGS /EV, lo que sugiere que Cav1 no influye en la adherencia de H. pylori
bacterias a las células huésped.

Cav1 protege a las células de GC humanos contra la reordenación CagA inducida del citoesqueleto

La formación de proyecciones con forma de aguja ( "colibrí") es un típico fenotipo morfológico de células AGS en respuesta a la infección por CagA-entrega dominio del H. pylori
cepas y translocación de CagA en el citosol [47]. Para examinar el papel de la Cav1 en este reordenamiento inducida por el estrés del citoesqueleto de actina, AGS /Cav1 y AGS /EV se infectaron durante 16 h con H. pylori
G27
peso o el mutante isogénica Delta cagA gratis (MOI = 100). Las células infectadas se tiñeron como se ha descrito anteriormente, y el número de células AGS alargados se determinaron (Fig. 4A, B). Cav1 células deficientes en AGS mostraron morfologías considerablemente más alargadas que las células que expresan Cav1 (11 ± 0,8% AGS /EV frente página 4 ± 0,8% AGS /Cav1; * p = 1,1 × 10 ^{-8; n = 3 por clon). Como era de esperar, no se obtuvo "colibrí" fenotipo en las células infectadas con el CagA-SS1 o un deficiente servicio al CagA-supresión mutante G27 Delta cagA
cepas que se encuentren imposibilitados para inyectar la proteína CagA funcional en las células huésped (datos no mostrados). células AGS /EV también produjeron más IL-8 mRNA en H. pylori
infección G27 que las células AGS /Cav1 (64 ± 19 EV frente
19 ± 6 Cav1; * p = 0,0176; n = 3 por clon) (Fig. 4C). Estos datos indicaron que Cav1 protege contra el estrés celular relacionados CagA.}

En apoyo de estos resultados, la adhesión celular y las tasas de cierre de heridas fueron más pronunciados en AGS /Cav1 en comparación con las células AGS /EV (Fig.S2). En concordancia con su función como una proteína diana de CagA y el componente de adhesiones focales [48], análisis WB (Fig. 4D) también detectaron niveles más altos (0,4 ± 0,1 AGS /EV frente
1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 , * p = 0,0012; n = 3 por clon) de fosforilados quinasa de adhesión focal (FAK) en las células que expresan Cav1-infectados con H. pylori
G27. Estos datos corroboran que las células AGS /Cav1 infectadas con CagA-entrega competente H. pylori
mantiene su forma epitelial desplegada en comparación con el fenotipo de las células alargadas subrayado Cav1 /EV.

CagA-entrega competente H. pylori
G27 desencadena unión de p120RhoGAP /DLC1 a Cav1 en células GC humanos

Cav1 ha demostrado ser fosforilados por tirosina quinasas citosólicas (Src, Abl) en la tirosina 14 [49], y fosforilados Cav1 y src tanto activar las pequeñas GTPasas Rho /Rac /Cdc42 que se regulan las funciones del citoesqueleto [13], [50]. Para identificar el mecanismo molecular subyacente cómo Cav1 protege contra el estrés celular relacionados CagA-, se evaluaron las vías de señalización iniciadas por CagA-entrega dominio del H. pylori
G27. La infección de células AGS provocó una rápida fosforilación de Cav1 en células AGS /Cav1 y de Src en ambas células AGS /Cav1 y AGS /EV. Este resultado indicó que Cav1 actúa aguas abajo de la activación de Src CagA-dependiente, pero aguas arriba de la activación de las GTPasas pequeñas (Fig. 5A, B). En consonancia con esta conclusión, los niveles de proteína de JNK fosforilada, que se encuentra por debajo de Src, fueron mayores en células AGS /EV en comparación con las células AGS /Cav1.

No se pudo detectar una interacción directa o colocalización cuantitativa de CagA proteína o H. pylori
bacterias G27 con Cav1 en CoIP o experimentos de inmunofluorescencia (Fig. 6A, B). ensayos de protección de gentamicina revelaron que la cantidad total de CagA se inyecta intracelular también fue independiente de la presencia de Cav1 (Fig. 6C). Por lo tanto, inhibe la adhesión de H Cav1 ninguno. pylori
bacterias ni a la inyección de CagA en la célula huésped, sino que reducen los efectos corriente abajo de CagA en la señalización intracelular.

Para identificar una proteína candidata que confiere protección contra CagA en un Cav1 dependiente manera, se realiza una pantalla de interacción de proteínas sobre la base de MALDI-MS (Fig. 7A). células AGS /Cav1 se infectaron durante 16 h con H. pylori
G27 (MOI = 100), seguido de la lisis de las células a temperatura ambiente en MES tamponada con 1% (v /v) de Triton-X100. Las bandas de proteínas precipitadas por Cav1 antisuero se visualizaron por tinción con plata, y se identificaron los péptidos por MALDI-MS como se publicó anteriormente [29]. Un fragmento de la proteína de ~ 95 kDa contenía péptidos correspondientes a la variante 4 de la proteína p120 Rho GTPasa de la activación /borrado en el cáncer de hígado-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], un supresor de tumores asociados con las adhesiones focales y /caveolas balsas de lípidos [53]. variante DLC1 4 (DLC1v4) tiene un tamaño previsto de ~110 kDa y se enriqueció en muestras procedentes de células que habían sido infectadas con H. pylori
G27 en comparación con las células no infectadas (Tabla S2). Estos resultados fueron confirmados por CoIP de Cav1 y proteína DLC1 endógena en las células AGS /CAV1 (Fig. 7B), lo que indica que H. pylori
G27 evocó una contratación específica de DLC1 a Cav1 en las células epiteliales gástricas humanas infectadas.

Este resultado nos llevó a amplificar el ADNc de la variante 4 de DLC1 humana [39] a partir de células HepG2 de hepatoma humano (Fig . 7C). El ADNc se insertó en el vector de expresión pTarget (pT-DLC1v4) seguido de transfección transitoria en AGS parentales o células HEK293 para 24 h. Los análisis de WB detectó la expresión de una proteína de ~110 kDa, consistente con el tamaño predicho de DLC1v4 [39]. células AGS transfectadas transitoriamente se infectaron entonces con H. pylori
G27 (MOI = 100) durante otros 16 h. La tinción de inmunofluorescencia reveló que DLC1 per se
no inhibió la formación del fenotipo CagA inducida "colibrí" (19 ± 2% AGS /DLC1 frente
19 ± 2% AGS /EV; n = 3 por clon) en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Fig. 8A, B). En su lugar, DLC1 promovió la propagación de células (20 ± 3% AGS /DLC1 frente página 11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067; n = 3 por clon) consistente con su papel en la regulación de las adhesiones focales [ ,,,0], H. H. pylori
infección. pylori
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