PLOS ONE: Hög Mobility Group Box 1 inhiberar Gastric sårläkning genom Toll-like receptor 4 och receptor för framskriden glykation End Products

Abstrakt

Hög rörlighet grupprutan 1 (HMGB1) ursprungligen upptäcktes som en nukleärt protein som interagerar med DNA som en kromatin-associerade icke-histon-protein för att stabilisera nukleosomer och reglera transkription av många gener i cellkärnan. När läckt eller aktivt utsöndras i den extracellulära miljön, aktiverar HMGB1 inflammatoriska vägar genom att stimulera flera receptorer, inklusive Toll-like receptor (TLR) 2, TLR4 och receptor för avancerade glykation slutprodukter (RAGE), vilket leder till vävnadsskada. Även HMGB1 förmåga att framkalla inflammation har dokumenterats väl, har inga studier undersökt roll HMGB1 i sårläkning i mag-tarmområdet. Syftet med denna studie var att utvärdera betydelsen av HMGB1 och dess receptorer i läkning av magsår. Vi undersökte också vilken receptor bland TLR2, TLR4 eller RAGE förmedlar HMGB1 effekter på sårläkning. Magsår inducerades genom serosala tillämpning av ättiksyra i möss, och mag vävnader bearbetades för ytterligare utvärdering. Induktion av magsår ökade immunhistokemisk färgning av cytoplasma HMGB1 och förhöjda HMGB1 nivåer. Sår storlek, myeloperoxidas (MPO) aktivitet, och ett uttryck för tumörnekrosfaktor α (TNF) mRNA nådde en topp på dag 4. Intraperitoneal administrering av HMGB1 fördröjd sårläkning och förhöjda MPO-aktivitet och TNF uttryck. I motsats, administration av anti-HMGB1 antikropp främjas sårläkning och minskad MPO-aktivitet och TNF uttryck. TLR4 och RAGE-brist förbättrad sårläkning och minskat nivån av TNFa, medan sårläkning i TLR2 knockout (KO) möss var jämförbar med den hos vildtypsmöss. I TLR4 KO och RAGE KO möss, gjorde exogen HMGB1 inte påverka sårläkning och TNFa uttryck. Således visade vi att HMGB1 är en komplicerande faktor i magsårs läkningsprocessen, som verkar genom TLR4 och RAGE att inducera alltför inflammatoriska svar.

Citation: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) Hög-Mobility Group Box 1 inhiberar Gastric sårläkning genom Toll-like receptor 4 och receptor för framskriden Glycation slutprodukter. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10.1371 /journal.pone.0080130

Redaktör: Mathias CHAMAILLARD, INSERM, Frankrike

emottagen: 29 maj, 2013; Accepteras: 30 september 2013, Publicerad: 11 november 2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Författarna har inget stöd eller finansiering för att rapportera

Konkurrerande intressen:. Kenji Watanabe - Grant /forsknings~~POS=TRUNC stöd~~POS=HEADCOMP från Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Tala och undervisning: Abbott Japan Co., LTD. Yasuhiro Fujiwara - tal och undervisning: Eisai Co. Ltd Tetsuo Arakawa - rådgivande kommittéerna eller granskningspaneler: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. De andra författare har förklarat att inga konkurrerande intressen finns. Detta ändrar inte författarnas anslutning till alla PLOS ONE politik för att dela data och material.

Introduktion

Hög rörlighet grupprutan protein 1 (HMGB1), en medlem av hög- mobilitetsgrupp proteinsuperfamiljen, är ett nukleärt protein [1]. HMGB1 interagerar med DNA som en kromatin-associerade nonhistone protein för att stabilisera nukleosomer och reglera transkription av många gener i kärnan [2]. När läckt ut från en cell under nekrotisk celldöd [3] eller aktivt utsöndras i den extracellulära miljön av monocyter och makrofager [3,4], HMGB1 fungerar som en alarmin med potenta proinflammatoriska egenskaper [5].

De mest studerade HMGB1 receptorer är Toll-like receptor (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], och receptor för avancerade glykation slutprodukter (RÅGE) [6,8]. TLR2 och TLR4 är medlemmar av TLR familjen, och de spelar en avgörande roll i medfödda immunsvar till patogen-associerade molekylära mönster och skadeassocierade molekylära mönster molekyler [10]. TLR2 erkänner främst komponenter i den grampositiva bakteriens cellvägg, och TLR4 erkänner främst lipopolysackarid, som är den huvudsakliga cellväggskomponent av gramnegativa bakterier. Trigg TLR2 och TLR4 signalvägar leder till aktiveringen av nukleär faktor kB (NF-kB), genom den accessoriskt protein MyD88, och den efterföljande regleringen av immunologiska och inflammatoriska gener, inklusive inflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor α (TNFa), med aktiveringen av mitogenaktiverade proteinkinaser [11-13]. Receptor för avancerade glykation slutprodukter (RAGE) är en multi-ligandreceptor som tillhör immunoglobulinsuperfamiljen [14]. Andra kända RAGE ligander innefattar amyloid [15] och S100 [16]. Flera experiment har antytt att ligand-RAGE interaktion aktiverar även NF-kB och mitogenaktiverade proteinkinaser [17-20].

Många patologiska tillstånd är relaterade till de proinflammatoriska egenskaper HMGB1. Tidigare rapporter har visat att HMGB1 spelar en avgörande roll i endotoxemi [21], akut pankreatit [22], akut andnödssyndrom [23], vissa autoimmuna sjukdomar [24], cerebral ischemi skada [25], och ischemi-reperfusion (IR) skador i levern [26], hjärta [27], och njure [28]. Med avseende på mag-tarmkanalen, är HMGB1 en komplicerande faktor vid experimentell kolit [29,30], och icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel inducerad tunntarmsskada [31].

För närvarande är rollen av HMGB1 vid sårläkning oklar, även om dess förmåga att inducera inflammation har dokumenterats väl, såsom beskrivits ovan. I mag-tarmområdet, har ingen studie undersökte rollen av HMGB1 i sårläkning. Syftet med denna studie var att undersöka vilken roll HMGB1 i magsår läkning. Vi undersökte rollen av HMGB1 i läkningsprocessen genom att använda en etablerad experimentell kronisk magsårsmodell skapades i gnagare genom topisk applicering av ättiksyra från den gastriska serosala sida. Modellen efterliknar nära mänsklig peptiskt magsår i histologi och morfologi [32]. Vi undersökte också om HMGB1 påverkar sårläkning genom TLR2, TLR4 eller RAGE.

Material och metoder

Djur

TLR2- och TLR4-knockout (KO) möss, som ursprungligen genererades av Dr. S. Akira (Osaka University, Osaka, Japan ) och återkorsas 8 gånger på en C57BL /6 bakgrund, erhölls från Oriental Bioservice, Inc. (Kyoto, Japan). RAGE-KO-möss, som hade korsades på en C57BL /6 bakgrund, ursprungligen genererats och en gåva från Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japan). Vildtyp C57BL /6-möss inhandlades från Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japan) som kontrollstam för TLR2 KO, TLR4 KO, och RAGE-KO möss. Specifika patogenfria 12 veckor gamla manliga djur användes. Alla djur inhystes i polykarbonatburar med papper chip sängar. Burarna var belägna i ett luftkonditionerat biologiskt rum med en 12-h ljus-mörker-cykel. Alla experimentella procedurer godkändes av Animal Care kommittén för Osaka City University Graduate School of Medicine (Tillståndsnummer: 11006). Alla operationer utfördes under isofluran, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.

Experimentellt Induktion av magsår

Magsår framkallades av en metod som beskrivs i detalj på annat håll [33], med mindre modifieringar . I korthet, under eteranestesi, ades bakkroppen hos djuren snittas och magen exponerades. En polypropenrör (4 mm i diameter) placerades mot serosala sidan av magen. En 80-mikroliter alikvot av 60% ättiksyra tillsattes till röret, som hålls i kontakt med den serosala ytan i 30 sek. Efter omedelbart borttagande av ättiksyra från röret genom aspiration, ades magen återgått till sitt ursprungliga läge, och buken stängdes. Tidigare rapporter har visat att storleken på magsår nådde ett maximum på dag 3 eller 4 efter sår induktion, och därefter successivt minskat det [32,34]. Läkningsfasen av den experimentella magsår börjar på dag 4 efter sår induktion

Experimentellt Grupper i

​​För att undersöka effekten av exogena HMGB1, fick möss intraperitoneala injektioner av humant rekombinant HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 pg /kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) eller vehikel (fosfatbuffrad saltlösning) två gånger dagligen, med början vid 4 dagar efter sår induktion (från dag 4 till dag 9).

Nästa, effekten av immunoneutralization av HMGB1 på magsår läkningen bedömdes. Möss administrerades intraperitonealt neutraliserande kyckling anti-HMGB1 polyklonal antikropp (5 mg /kg; Shino-Test Corporation, Tokyo, Japan) eller normalt kyckling IgY (5 mg /kg; Sigma-Aldrich Co.) med början vid 4 dagar efter sår induktion ( från dag 4 till dag 9). Dessutom, för att bekräfta effekten av frisättningen av en inhibitor av HMGB1 ades etylpyruvat eller vehikel injicerades två gånger dagligen, med början på dag 4 efter sår induktion.

Vidare, för att bestämma receptor ansvarig för HMGB1 relaterade magsår läka, magsår inducerades i TLR2 KO, TLR4 KO, och RAGE KO möss med eller utan intraperitoneal injektion av 1000 ug /kg av rHMGB1 två gånger dagligen med början på dag 4 efter sår induktion.

Magen avlägsnades och såret storleken mättes på dag 6 eller 9 efter sår induktion. Sår storlek uttrycktes som ett sår index, produkten av den maximala längden och minsta längd (dvs maximal längd multiplicerades med minimilängd). Studier utfördes med användning av 4-8 prover. Proverna av gastrisk vävnad bearbetades för ytterligare utvärdering.

mRNA uttryck av inflammatoriska mediatorer i Gastric Tissue Avgörs av kvantitativ realtids omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) katalog

Real- kvantitativ RT-PCR utfördes såsom tidigare beskrivits [35]. I korthet isolerades totalt RNA från tarmvävnad genom att använda en ISOGEN kit (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan) i enlighet med tillverkarens protokoll. Kompletterande DNA förvärvades med hjälp av en hög kapacitet RNA till cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) enligt tillverkarens protokoll. Kvantitativ realtids-RT-PCR-analyser utfördes med användning av en Applied Biosystems 7500 Snabb realtids-PCR-system och programvara (Life Technologies Corporation). Reaktionsblandningen framställdes enligt tillverkarens protokoll med hjälp av TaqMan-Snabb Universal PCR Master-blandning (Life Technologies Corporation). Termiska cyklingsförhållanden var som följer: 45 cykler av amplifiering vid 95 ° C under 15 s och 60 ° C under 1 min. Totalt RNA utsattes för i realtid av kvantitativ RT-PCR för mätning av målgener genom att använda TaqMan glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas kontrollreagens (Life Technologies Corporation), som användes som en intern standard. Uttrycket av mRNA som kodar HMGB1 var TLR4, RAGE, vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-1-beta (IL-1β), och TNFa i såriga och normala mag vävnader kvantifieras med hjälp av realtids-RT-PCR och standardiserade till glyceraldehyd -3-fosfatdehydrogenas mRNA-nivåer. Uttrycket av varje mRNA anges som ett förhållande, i förhållande till medelvärdet i normal gastrisk vävnad. Primers och sönder som används för RT-PCR visas i tabell 1.
Gene
primer och sond
TNF-αPrimer (framåt) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Framåt) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Framåt) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Framåt) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (bakåt) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (framåt) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Framåt) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (bakåt) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (framåt) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (bakåt) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. Primers och prober.
CSV Ladda ner CSV

Immunohistokemisk och immunofluorescensfärgning

Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP fixerades med 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) innehållande 4% paraformaldehyd. Prover inbäddade i paraffin, och serie 5-um tjocka sektioner monterades på silaniserade objektglas (Dako, Tokyo, Japan). Exemplaren nedsänktes i en lösning av 3% H _{2O 2 i absolut metanol under 5 minuter, för att inhibera endogen peroxidasaktivitet och inkuberades sedan i 5% skummjölk i 10 min. Hematoxylin och eosin färgning utfördes för de morfologiska observationerna. En kanin monoklonal anti-HMGB1 antikropp (spädd 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) applicerades som den primära antikroppen och inkuberades över natten vid 4 ° C med proverna. En sekundär antikropp (Histofine Enkel Stain MAX Peroxidase kit, Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) inkuberades med proverna under 1 h enligt tillverkarens anvisningar. Immunoreaktivitet visualiserades genom att behandla sektionerna med Histofine Enkel Stain och diaminobensidin lösning (Nichirei Biosciences Inc.). Proverna sedan motfärgades med hematoxylin. Därefter TLR2, TLR4 och RAGE uttryck bestäms av en immunfluorescensmetod. De primära antikropparna som användes i immunofluorescensinfärgning inkluderade en mus-monoklonal antikropp mot TLR2 (spädd 1: 200; Abcam), en mus-monoklonal antikropp mot TLR4 (spädd 1: 200; Abcam), och en monoklonal antikropp från råtta mot RÅGE (spädd 1: 250; Abcam). Vävnadsprov, vilka framställdes såsom beskrivits ovan, inkuberades över natten vid 4 ° C med de primära antikropparna och sedan bringas att reagera med de motsvarande fluorescerande färgämnes-konjugerad sekundära antikroppar (Abcam) för 2 timmar. Prover undersöktes med en konfokalmikroskop utrustad med argon och argon-krypton laserkällor.}

Mätning av serum HMGB1 nivåer

Blood (1000 mikroliter) prover erhölls i serumseparatorrör genom hjärtpunktion. Efter centrifugering vid 3000 rpm under 10 minuter, tillsattes serum uppsamlades och lagrades vid -80 ° C. Serumnivåer av HMGB1 mättes med användning av en HMGB1 sandwich-ELISA-kit (Shino-Test Corporation) enligt tillverkarens protokoll.

Mätning av Myeloperoxidas (MPO) aktivitet

Metoder som används för att mäta MPO-aktivitet beskrivs i detalj på annat håll [36]. I korthet, proverna homogeniserades i 50 mM kaliumfosfatbuffert (pH 6,0) innehållande 0,5% hexadecyltrimetylammoniumbromid (Sigma Chemical Co.). Suspensionerna centrifugerades, och MPO-aktivitet i den resulterande supernatanten analyserades med en spektrofotometer. En enhet av MPO-aktivitet definierades som den mängd enzym som degraderas 1 fimol peroxid /min vid 25 ° C. Resultaten är uttryckta som enheter per gram av gastrisk vävnad.

Statistisk analys

Värdena är uttryckta som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Envägs variansanalys (ANOVA) användes för att testa signifikansen av skillnaderna mellan behandlingsgrupp innebär, och resultaten analyserades med Fishers skyddade minst signifikanta differenstestet. P-värden mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Tidsförlopp magsår Healing

För att utvärdera läkningsprocessen av magsår var experimentell magsår framkallad genom topisk applicering av ättiksyra från mag serosala sidan . Såren utvärderades mikroskopiskt (Figur 1A, 1B) och makroskopiskt. Storleken av såren nådde ett maximum på dag 4 och minskade över tid därefter (Figur 1C). MPO-aktiviteten (figur 1D) och uttrycket av TNFa (figur 1E) och IL-1β (figur 1E) mRNA i ulcerated gastrisk vävnad nådde en topp också på dag 4, och deras nivåer var högre i såriga vävnad än i normal gastrisk vävnad genom hela granskningsperioden. Sår förhöjda också uttrycket av VEGF-mRNA (figur 1F).

HMGB1 Expression efter Sår

Vi utvärderade nästa om HMGB1 var inblandad i magsår läkning. HMGB1 mRNA-nivåer i gastrisk vävnad (Figur 2A) och serumnivåer av HMGB1 (Figur 2B) nått sin maximala vid dag 4. HMGB1 mRNA-nivåer var nästan konstant under den aktuella perioden, medan serumnivåer av HMGB1 sjönk till normala nivåer 6 dagar efter induktion av magsår. Immunhistokemiskt, sår inducerade framträdande cytoplasmisk färgning av HMGB1 i epitelceller, särskilt i skadade områden (Figur 2C, 2D). Däremot i intakt magslemhinna, var HMGB1 lokalisering begränsad till insidan kärnorna hos epitelceller (figur 2E).

Effekter av exogen HMGB1, HMGB1 Immunoneutralization och Hämning av HMGB1 Release på Gastric sårläkning

mRNA-expression och MPO-aktivitet utvärderades på dag 6, och såret index utvärderades på dag 9, enligt tidsförloppsstudie. Möss administrerades rHMGB1 eller anti-HMGB1 antikropp intraperitonealt efter induktion av magsår. Administrering av rHMGB1 vid en dos av antingen 100 | ig /kg eller 1000 ng /kg signifikant suppression av magsår läkning (figur 3A), som var förknippad med ökad MPO-aktiviteten (figur 3B) och TNFa-mRNA-uttryck i ulcererade vävnader (Figur 3C). I motsats härtill HMGB1 neutraliserande antikroppar främjas sårläkning (figur 4A) med reducerad MPO-aktivitet (Figur 4B) och TNFa-mRNA-uttryck (Figur 4C). Den komplicerande effekten av exogen rHMGB1 på magsår läkning avbröts genom samtidig administrering av anti-HMGB1 antikropp (Figur 4F). Expression av VEGF-mRNA påverkades inte av behandling med antingen rHMGB1 (Figur 3D, 3E) eller anti-HMGB1 antikropp (Figur 4D, 4E). Vid normal gastrisk vävnad, administrering av rHMGB1 eller anti-HMGB1 inte heller ha någon effekt på cytokin uttryck eller MPO-aktivitet (data visas ej). Dessutom administrationen av etylpyruvat, en hämmare av HMGB1 release, markant främjas sårläkning, jämfört med behandling fordon. Healing åtföljdes av undertryckandet av TNF-mRNA-expression (data visas ej).

roll TLR2, TLR4, och RAGE i Gastric Ulcer Healing

För att undersöka om TLR2, TLR4, och RAGE bidrar till HMGB1-medierad magsår läkning var experimentella magsår inducerade i TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO, och kontroll vildtyp möss. TLR4 och RAGE-brist främjas magsår bildning och förhindrade ökningen av TNFa mRNA-expression efter sårbildning, medan TLR2-brist varken påverkar sårindex heller expressionen av TNFa-mRNA (figur 5A, 5B). Administration av exogen HMGB1 varken påverkar sårindex eller uttrycket av TNF-mRNA i antingen TLR4 KO eller RAGE KO möss (Figur 5C-5F). Administration av exogen HMGB1 dock fördröjd sårläkning i vildtyp möss och minskad TNFa-mRNA-uttryck (Figur 3).

Uttryck av TLR2, TLR4 och RAGE under Gastric sårläkning

Vi undersökte nästa mRNA-expression och immunreaktivitet av TLR2, TLR4 och RAGE i vildtyp möss. En signifikant uppreglering av TLR2 mRNA observerades efter induktion av ett sår (figur 6A). TLR2 immunreaktivitet observerades främst i inflammatoriska celler (Figur 6B). Uttrycket av TLR4 mRNA inte påverkades av induktion av magsår (Figur 6C). TLR4 immunoreaktivitet observerades i den apikala delen av epitelbeklädnaden vid sår kanten och i vissa inflammatoriska celler i såret säng (figur 6D).

En betydande uppreglering av RAGE-mRNA observerades på dag 9 efter induktion av magsår (figur 6E). RAGE immunoreaktivitet observerades främst i inflammatoriska celler vid kanten av såret sängar och i vaskulär endotelial cellmembranet (fig 6F).

Färgning av såriga vävnad från TLR4 KO eller RAGE KO-möss med en anti-TLR4-antikropp eller anti-RAGE-antikropp, visade inga positiva signaler, vilket bekräftar specificiteten av dessa antikroppar (data ej visade).

Diskussion

I denna studie visade vi att exogena HMGB1 förseningar magsår läkning, medan inducera TNFa uttryck och MPO-aktivitet. Omvänt immunoneutralization av HMGB1 eller hämma frisättningen av HMGB1 främjar sårläkning och samtidigt minska TNFa-expression och MPO-aktivitet. Dessutom TLR4 och RAGE brist främjar sårläkning och exogena HMGB1 inte fördröja sårläkning i TLR4 KO och RAGE KO möss. Dessa resultat tyder på att HMGB1 är en komplicerande faktor för magsår läkning som verkar genom TLR4- och RAGE-beroende vägar. Såvitt vi vet är detta den första rapporten att klargöra vilken roll HMGB1 vid sårläkning inom mag-tarmkanalen.

Ett fåtal studier adresserade roll HMGB1 i sårläkning i annan valuta än magtarmkanalen organ, men resultaten av dessa studier är kontroversiella [37-40]. I överensstämmelse med våra resultat, vissa studier har visat att HMGB1 har en hämmande effekt på sårläkning [37,38]. Zhang m.fl.. visat att HMGB1 försämrar incision sårläkning genom att minska reparativa kollagendeponering via RAGE [37]. Goova et al. visat att blockering RAGE ligander såsom AGE och HMGB1 med hjälp av en löslig form av receptorn för AGE (sRAGE), accelererar sårläkning och dämpar nivåer av inflammatoriska cytokiner [38]. Tidigare studier har visat att överdriven inflammation försämrad sårläkning. Till exempel visade vår tidigare studie som TNFa överuttryck och överdriven neutrofil infiltration är komplicerande faktorer i bildandet och läkning av magsår [41]. Dessutom i en annan modell av vävnadsreparation, Goren et al. visat att överdriven neutrofiler och makrofager infiltration med TNF överuttryck hämmar läkningen av mus hudskador [42]. Således är det möjligt att HMGB1 fördröjer magsår läkning genom TNFa-utlöst inflammatoriska svar.

I motsats, en del in vitro studier tyder på att HMGB1 och dess receptorer är viktiga för sårläkning [39,40]. Staraino et al. visade att HMGB1 accelererar sårläkningsprocessen och förnyelse genom att öka migreringen av hudfibroblaster och keratinocyter [39]. HMGB1 främjar också sårläkning av 3T3-fibroblaster genom att inducera cellproliferation och migration genom aktiveringen av RAGE /extracellulära signalreglerade kinasvägen [40]. Eftersom dessa in vitro-studier utfördes i frånvaro av inflammatoriska celler, kan skillnaderna i experimentella metoder resultera i inkonsekventa slutsatser om rollen av HMGB1 i sårläkning.

VEGF, en potent angiogen tillväxtfaktor, spelar en viktig roll i magsår läkning [43,44]. Tidigare rapporter visade att HMGB1 kunde inducera expression av VEGF i ett flertal vävnader och djurmodeller [45-47]. Men i denna studie, varken rHMGB1 eller anti-HMGB1 antikroppar påverkade VEGF-produktion i ulcerös vävnad. Anledningen till skillnaden mellan våra resultat och de av tidigare undersökare är inte klart, men det kan vara förknippade med användning av olika organ och experimentella modeller.

Det finns 2 möjliga källor till extracellulärt HMGB1: passiv frisättning från nekrotiska celler [48] och aktiv sekretion från inflammatoriska celler [5]. I denna studie var HMGB1 immunoreaktivitet observerades i cytoplasman liksom kärnan, vilket antyder att nekrotiska celler är en källa till HMGB1. Gastric HMGB1 mRNA-nivåer ökade under sårläkning, vilket tyder på att inflammatoriska celler producerar och frigör HMGB1. Kollektivt, höjningen av serum HMGB1 resulte berodde på passiv frisättning från skadade celler vid magsår och aktiv sekretion från inflammatoriska celler.

Serum HMGB1 nivåer ökar efter induktion av magsår men minskade i den sena fasen av healing, även om uttrycket av HMGB1 och TNF fortsatt hög. Dessa data ta upp möjligheten att en system HMGB1 fångstsystemet. För detta ändamål har det föreligger ett HMGB1 bindande protein rapporterats. Trombomodulin, ett cellyte-glykoprotein, är ett exempel på en HMGB1-bindande protein. Rekombinant humant lösligt trombomodulin hämmade ökningen i plasma HMGB1 inducerad av lipopolysackarid i en råttmodell [49] och bunden till HMGB1 genom dess lektindomänen [50] för att förhindra HMGB1 från att interagera med andra receptorer [51]. I kliniska tillämpningar, är trombomodulin också användbar i HMGB1 relaterade sjukdomar och tillstånd såsom sepsis på grund av dess anti-HMGB1 egenskaper [52]. sRAGE, som finns i omlopp, är ett annat exempel på en HMGB1 bindande protein. sRAGE är den lösliga formen av RÅGE; det fungerar som ett lockbete för att förhindra växelverkan mellan cellyte-RAGE och dess ligander, såsom HMGB1 [53]. I den aktuella studien, kan sådana fångstsystem också spela en skyddande roll för att förhindra spridningen av inflammation och därigenom främja sårläkning.

Det är känt att många magsår patienter infekterade med Helicobacter pylori
. Även i denna studie vi inte undersöka vilken roll HMGB1 i magsår läkning i möss infekterade med H. pylori
, kliniska och experimentella studier tyder på att den skadliga effekten av HMGB1 på magsår healing skulle vara mer uttalad hos patienter med en H. pylori
infektion än i de utan den. Vi har tidigare visat att H. pylori
infektion ökar neutrofil infiltration i såriga vävnader i mongoliska gerbiler [54]. Shimizu et al. också visat att neutrofiler och makrofager infiltrerar magsårsmarginaler i högre grad hos patienter med H. pylori
infektion än i de utan infektion [55]. En stor mängd HMGB1 är därför sannolikt förekommer i såriga vävnaden infekterade med H. pylori
, eftersom det skulle kunna utsöndras av dessa inflammatoriska celler. Dessutom Radin et al. rapporterade att VacA en viktig virulensfaktor av denna organism, orsakar programmerad nekros av gastric epitelceller och efterföljande frisättning av HMGB1 [56]. Därför förväntar vi oss att den skadliga av HMGB1 på sårläkning skulle vara mer framträdande i H. pylori
-infekterade patienter.

TLR2, TLR4, och RAGE, som förmedlar proinflammatoriska svar är allmänt kända HMGB1 receptorer. Våra resultat visar tydligt att TLR4 och RAGE spelar avgörande roller i magsår läkning. Detta resultat är i linje med tidigare fynd på de inflammatoriska svar som induceras av HMGB1. En av de mest etablerade modeller som omfattar interaktion mellan HMGB1 och dessa receptorer är I-R skada. I lever I-R skada, TLR4 fattiga möss uppvisade mindre lever I-R skada; skadorna i TLR4 fattiga möss inte påverkades av rHMGB1 eller anti-HMGB1 antikropp [26]. Dessutom blockerar RAGE skyddas mot hepatocellulär död och nekros i levern I-R skada modell [57]. I en modell av hjärt I-R skada, Andrassy et al. visade att RAGE-brist möss visas endast lätt inflammation till följd av hjärt I-R skada; inflammationen påverkades inte genom induktion av rHMGB1 [27]. Dessa fynd tyder på att TLR4-HMGB1 och RAGE-HMGB1 interaktioner spelar en avgörande roll i I-R skada, även om det är nödvändigt att beakta skillnaderna i varje organ. Den andra etablerad modell är systemisk inflammation, såsom sepsis [5,8,58]. I en experimentell modell av intraabdominell sepsis, Susa et al. visade att HMGB1-RAGE interaktion var nära förknippad med sepsisinducerade diafragma dysfunktion [58]. I en in vivo systemisk inflammationsmodell som alstras genom injektion av exogent HMGB1, Zoelen et al. visat att HMGB1 inducerar frisättning av cytokiner, aktivering av koagulering, och neutrofil rekrytering genom TLR4 och RAGE [8]. Sålunda TLR4 och RAGE play kritiska roller i patogenesen medierad av HMGB1-associerade banan innefattande reaktionsvägen i vårt magsårsläkning modell.

Våra resultat tyder på att TLR2 har ingen relation till magsår läkning: sårläkning i TLR2 KO möss liknade det i vildtyp möss. Även in vitro studier med makrofagcellinjer indikerade att TLR2-HMGB1 väg framkallar inflammatoriska svar [6,9], in vivo effekter av TLR2 i HMGB1-medierad sjukdomar har inte rapporterats. Således, baserat på tidigare fynd [8] och våra resultat kan HMGB1-TLR2 vägen spelar en underordnad roll i reparation och patogenes av vävnadsskada och inflammation.

Sammanfattningsvis har vi visat att HMGB1 är en komplicerande faktor i läkningsprocessen av magsår liksom i andra patologiska tillstånd. Dessutom har vi visat att HMGB1 hämmar sårläkning genom en mekanism som involverar TLR4, RAGE, och överdrivna inflammatoriska reaktioner. Även proton pomp-hämmare är förskrivna för magsår, svår sår fortfarande utgör ett kliniskt problem. Vår nuvarande studie stöder ett nytt koncept för behandling av svår magsår, förutom proton pomp-hämmare.

Tack till

Vi tackar Emi Suzuki-Yoshioka för tekniskt stöd. Jag vill också uttrycka min uppriktiga tacksamhet till de anställda i Osaka City University som stödde oss.

• PLOS ONE: Mangiferin minskar magsår hos ischemi /reperfusion Rats: Medverkan av PPAR-γ, NF-kB och Nrf2 /HO-1 signalvägar
• PLOS ONE: Nej Association of kaffekonsumtionen med magsår, duodenalsår, refluxesofagit, och icke-Erosive refluxsjukdom: En tvärsnittsstudie av 8,013 friska försökspersoner i Japan