Plos ONE: High-Mobility Group Box 1 zavira celjenje želodčne razjede preko Toll-like receptor 4 in Receptor za napredno Glycation končnih izdelkov

Povzetek

Skupina box High-mobilnost 1 (HMGB1) je bil sprva odkrili kot jedrska protein, ki komunicira z DNK kot-kromatina povezano non-histon beljakovin za stabilizacijo nukleosome in regulacijo transkripcije mnogih genov v jedru. Enkrat razpoka ali aktivno izloča v zunajcelični okolje, HMGB1 aktivira vnetnih poti s stimulacijo več receptorje, vključno Toll-u podobnega receptorja (TLR) 2, TLR4, in receptorja za napredno glikacije končnih izdelkov (Rage), ki vodi do poškodbe tkiva. Čeprav je bila zmožnost HMGB1 za sprožanje vnetje dobro dokumentirane, študij niso preučila vlogo HMGB1 pri celjenju ran na področju prebavil. Cilj te raziskave je bil oceniti vlogo HMGB1 in njegove receptorje v zdravljenje želodčnih razjed. Prav tako smo raziskali, kateri receptor med TLR2, TLR4 ali RAGE posreduje učinke HMGB1 je na celjenje razjed. Želodčnih razjed bile inducirane z serozne uporabo ocetne kisline v miših in želodčni tkiva bila pripravljena za nadaljnje ocenjevanje. Indukcija razjeda povečala Imunohistokemijsko za citoplazemske HMGB1 in zvišane vrednosti serumskih HMGB1. Velikost razjeda, mieloperoksidaze (MPO) aktivnost in izražanje faktorja tumorske nekroze alfa (TNF) mRNA vrhuncem na dan 4. Intraperitonealna uprave HMGB1 zamudo celjenje razjed in povišano MPO aktivnost in TNFa izraz. V nasprotju s tem uporaba anti-HMGB1 protitelesa spodbuja celjenje razjed in zmanjšano MPO aktivnost in TNFa izraz. TLR4 in pomanjkanje RAGE izboljšano razjede in zniža raven TNFa, medtem ko je razjede v TLR2 izločilno (KO) miših, podoben tistemu pri divjih miši. V TLR4 KO in RAGE KO miši, eksogeni HMGB1 ni vplivalo razjede zdravljenje in TNFa izraz. Tako smo pokazali, da je HMGB1 oteževalni dejavnik v želodčni procesu razjeda zdravljenja, ki deluje preko TLR4 in RAGE, da povzroči pretirane vnetne odzive.

Navedba: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013), High-Mobility Group Box 1 zavira celjenje želodčne razjede preko Toll-like receptor 4 in Receptor za napredno Glycation končnih izdelkov. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10,1371 /journal.pone.0080130

Urednik: Mathias Chamaillard, INSERM, Francija

Prejeto: 29. maj 2013; Sprejeto: 30. september 2013; Objavljeno: 11 november 2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

Konkurenčni interesi:. Kenji Watanabe - Grant /Raziskave podpora iz Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co, LTD .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Govorjenje in poučevanje: Abbott Japan Co, LTD. Yasuhiro Fujiwara - govor in poučevanja: Eisai Co Ltd Tetsuo Arakawa - sosveti ali pregled Plošče: Eisai Co Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd Drugi avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi. To ne spremeni pripadnost avtorjev vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

High-mobilnost skupina box protein 1 (HMGB1), član visoko- skupina mobilnost protein naddružina je jedrska protein [1]. HMGB1 komunicira z DNA kot-kromatina povezan nonhistone proteina za stabilizacijo nukleosome in regulacijo transkripcije mnogih genov v jedru [2]. Ko ušli iz celice v nekrotičnemu celične smrti [3] ali aktivno izloča v zunajcelični okolja z monociti in makrofagi [3,4], HMGB1 dejanj kot alarmin z močnimi vnetnih lastnostmi [5].

Najbolj raziskani HMGB1 receptorji Toll-like receptor (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], in receptor za napredne glikacije končnih izdelkov (RAGE) [6,8]. TLR2 in TLR4 so člani družine TLR, ki igrajo ključno vlogo pri prirojenih imunskih odzivov na-patogenov, povezanih molekularnih vzorcev in-škode, povezanih molekul molekularnih vzorcev [10]. TLR2 predvsem prepozna sestavine gram-pozitivne bakterijske celične stene, in TLR4 predvsem priznava lipopolisaharid, ki je glavna celične stene komponenta gram-negativne bakterije. Proženje TLR2 in TLR4 signalnih poti vodi do aktivacije jedrske faktorja κB (NF-κB), skozi dodatno proteina MyD88, in naknadno ureditev imunskih in vnetnih genov, vključno vnetnih citokinov, kot tumorskega nekroznega faktorja alfa (TNF), pri čemer aktiviranje mitogenom aktivirana protein kinaz [11-13]. Receptor za napredne glikacije končnih izdelkov (bes) je multi-ligand receptorja, ki spada v imunoglobulinov naddružine [14]. Druge znane bes ligande vključujejo amiloida [15] in S100 [16]. Večkratni poskusi so predlagali, da interakcija ligand-RAGE aktivira tudi NF-κB in mitogeni aktivirani protein kinaz [17-20].

Veliko patoloških stanj so povezani z vnetnih lastnosti HMGB1. Prejšnjih poročilih je pokazala, da ima HMGB1 ključno vlogo pri endotoksemije [21], akutni pankreatitis [22], sindrom akutne respiratorne stiske [23], nekatere avtoimunske bolezni [24], cerebralna ishemija škode [25] in ishemije-reperfuzije (IR) poškodbe jeter [26], srčni [27], in ledvic [28]. Glede na prebavilih, HMGB1 je oteževalni dejavnik pri eksperimentalni kolitis [29,30], in nesteroidnih protivnetnih zdravil povzroča tankega črevesa škode [31].

Trenutno vloga HMGB1 na celjenje ran ni jasno, čeprav je bila njegova sposobnost, da povzroči vnetje dobro dokumentirani, kot je opisano zgoraj. Na področju prebavil, nobena študija preučila vlogo HMGB1 pri celjenju ran. Cilj te raziskave je bil raziskati vlogo HMGB1 na celjenje želodčne razjede. Preučevali smo vlogo HMGB1 v procesu zdravljenja z uveljavljenim eksperimentalno kronične želodca modela ustvarili v glodalcih z nanosu ocetne kisline iz želodca strani serozne. Model oponaša človeško peptični želodčne razjede na histologijo in morfologije [32]. Prav tako smo raziskali, ali HMGB1 pojavijo razjede zdravljenje z TLR2, TLR4 ali RAGE.

Materiali in metode

Živali

TLR2- in TLR4-knockout (KO) miši, ki so bili prvotno ustvarjeni dr S. Akira (Osaka University, Osaka, Japonska ) in backcrossed 8-krat mirno C57BL /6 ozadju, so bili pridobljeni iz Vzhodno Bioservice, Inc. (Kjoto, Japonska). RAGE-KO miši, ki so bile backcrossed mirno C57BL /6 ozadju, so bili prvotno ustvari in darilo od Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japonska). Divjega tipa C57BL /6 miši so bile kupljene od Charles River Japonske, Inc. (Atsugi, Japonska) kot kontrolni sev za TLR2 KO, TLR4 KO, in bes KO miši. so bile uporabljene posebne patogenih brez 12 tednov starih samcev. Vse živali so bile nameščene v polikarbonatnih kletkah s čipom papir posteljnino. Kletke so se nahajala v klimatizirani biološko nevarnost sobi s 12-h svetlobe in teme cikla. Vse eksperimentalne postopke je odobril odbor za živali Care v Osaka City University Graduate School of Medicine (dovoljenje številka: 11006). Vse operacije so bile izvedene v skladu z izofluran, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja.

Eksperimentalni Indukcija razjede

Želodčna razjeda je bila povzročena z metodo podrobno opisana drugje [33], z manjšimi spremembami . Na kratko, pod eter anesteziji, trebuhi živali so zarezati in želodec je bil izpostavljen. Polipropilenska cev (4 mm v premeru) damo ob strani serozne želodca. 80-xl alikvot 60% ocetne kisline dodamo v cev, ki je bila v stiku s serozne površino za 30 sekund. Po takojšnjo odstranitev ocetne kisline iz cevi, ki ga aspiracije bil želodec vrne v prvotni položaj in trebuh je bil zaprt. Prejšnja poročila so pokazala, da je velikost želodca doseže maksimum na 4. dan 3 ali po indukciji razjede, in nato postopoma zmanjšal [32,34]. Faza celjenje eksperimentalnega želodca se začne 4. dan po indukciji razjede

Eksperimentalne skupine

Da bi raziskali vpliv eksogenega HMGB1, miši prejela intraperitonealne injekcije humani rekombinantni HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 mg /kg; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) ali vozilo (-fosfatni pufer), dvakrat na dan, s pričetkom ob 4 dni po indukciji razjede (od 4. dan za dnem 9).

Naprej, učinek immunoneutralization HMGB1 na celjenje želodčne razjede je bila ocenjena. Miši intraperitonealno dajemo nevtraliziranje piščančjih anti-HMGB1 poliklonsko protitelo (5 mg /kg; Shino poskusov Corporation, Tokio, Japonska) ali normalno piščančje IgY (5 mg /kg; Sigma-Aldrich Co.), ki se začne pri 4 dni po indukciji razjed ( od 4. dan za dnem 9). Poleg tega, potrditev učinek sproščanja inhibitorja HMGB1 so etil piruvat ali vozilo injiciramo dvakrat na dan, ki se začne po indukciji razjedo 4. dan.

Poleg tega, da se ugotovi receptorja, odgovoren za povezane s HMGB1 želodca zdravilni, želodčne razjede so bile povzročene v TLR2 KO, TLR4 KO, in bes KO miši z ali brez intraperitonealno injekcijo 1000 ug /kg rHMGB1 dvakrat na dan začetka na po indukciji razjede 4. dan.

želodca odstranimo in velikost ulkus bila izmerjena na po indukciji razjed dan 6 ali 9. Velikost razjeda je bila izražena kot indeks razjed, produkt največjo dolžino in najmanjšo dolžino (tj maksimalna dolžina smo pomnožili z najmanjšo dolžino). Raziskave so bile izvedene z uporabo 4-8 vzorcev. Vzorci želodčnega tkiva so bila pripravljena za nadaljnje vrednotenje.

mRNA Izražanje vnetnih mediatorjev želodčnega tkiva, ki v realnem času Kvantitativna Reverse Transcription-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR), določena

realnem čas kvantitativno RT-PCR smo izvedli kot je opisano predhodno [35]. Na kratko, smo izolirali celotno RNA iz črevesnega tkiva z uporabo ISOGEN komplet (Nippon Gene Co, Ltd, Tokio, Japonska) v skladu s protokolom proizvajalca. Komplementarna DNA smo pridobili s pomočjo High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA), v skladu s protokolom proizvajalca. Realnem času kvantitativne analize RT-PCR smo izvedli z uporabo Applied Biosystems 7500 Fast sistem in programsko opremo v realnem času PCR (Life Technologies Corporation). Reakcijsko mešanico smo pripravili po proizvajalčevih protokolu s pomočjo TaqMan Fast Universal PCR glavno zmes (Life Technologies Corporation). Termo kolesarske pogoji so bili naslednji: 45 ciklov pomnoževanja pri 95 ° C za 15 sekund in 60 ° C 1 min. Celotno RNA smo podvrgli v realnem času kvantitativne RT-PCR za merjenje ciljnih genov s pomočjo TaqMan gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze kontrole reagentov (Life Technologies Corporation), ki so bile uporabljene kot interni standard. Ekspresijo mRNA, ki kodira HMGB1 je TLR4, RAGE, vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF), interlevkin-1-beta (IL-1β) in TNFa v razjedami in normalnih želodčne tkiv količinsko uporabo v realnem času RT-PCR in standardizirane gliceraldehid -3-fosfat dehidrogenaze nivoji mRNA. Izraz vsakega mRNA je označeno kot razmerje, relativno glede na srednjo vrednost v normalni želodca tkivu. Primerji in sonde, ki se uporabljajo za RT-PCR so prikazani v tabeli 1.
Gene
primerja in sonde
TNF-αPrimer (naprej) 5-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Naprej) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Naprej) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Naprej) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (nazaj) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-Tamra-3'TLR4Primer (naprej) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Naprej) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (nazaj) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-Tamra-3'VEGFPrimer (naprej) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (nazaj) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-Tamra-3'Table 1. premazi in sonde.
CSV Shrani CSV

imunohistokemičnim in imunofluorescenco

vzorce tkiva, so bile določene z 0,1 M fosfatnem pufru (pH 7,4), ki vsebuje 4% paraformaldehida. Vzorci so bili vgrajeni v parafin, in serijski 5-im-debele odseki so bili nameščeni na silanizira diapozitive (Dako, Tokio, Japonska). Osebki so bile potopljene v raztopini 3% H _{2O 2 v absolutnem metanolu 5 minut, da se inhibira endogene peroksidaze aktivnost in nato inkubiranih pri 5% posnetega mleka 10 minut. Hematoxylin in eozin obarvanje je bila izvedena za morfoloških opazovanj. Kunčji monoklonsko anti-HMGB1 protitelo (razredčili 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) je bila uporabljena kot primarna protitelesa in inkubiran preko noči pri 4 ° C z vzorci. Sekundarna protitelesa (Histofine Enostavno Stain MAX peroksidaze kit; Nichirei Biosciences Inc, Tokio, Japonska) smo inkubirali z vzorci, za 1 uro v skladu z navodili proizvajalca. Radioinkorporacijo smo vizualizirali z obdelavo razdelke z Histofine Enostavno madeže in diaminobenzidine raztopine (Nichirei Biosciences Inc.). Vzorce nato jih nasprotno z hematoksilinom. Naslednji je TLR2, TLR4 in RAGE ekspresijo določimo z metodo imunofluorescence. Primarni protitelesa, ki se uporabljajo v imunofluorescenco vključen mišjega monoklonskega protitelesa proti TLR2 (razredčen 1: 200; Abcam), mišjega monoklonskega protitelesa proti TLR4 (razredčen 1: 200; Abcam) in protitelo je podgana monoklonsko proti RAGE (razredčen 1: 250; Abcam). vzorce tkiva, ki so bile pripravljene, kot je opisano zgoraj, smo inkubirali preko noči pri 4 ° C s primarnimi protitelesi in nato reagira z ustreznimi fluorescenčnih barvil konjugiranih sekundarnih protiteles (Abcam) za 2 uri. Vzorci so bili pregledani z konfokalnim mikroskopom opremljeno z argonom in argon, kripton laserskih virov.}

Merjenje Serum HMGB1 nivoji

Blood (1000 ul) Vzorci so bili pridobljeni v serumu separator cevi, ki jih srčno punkcijo. Po centrifugiranju pri 3000 obratih na minuto za 10 minut, je bil serum zberemo in shranimo pri -80 ° C. Serumskih ravni HMGB1 bile izmerjene z uporabo HMGB1 sendvič ELISA kit (Shino poskusov Corporation) po protokolu proizvajalca.

Merjenje mieloperoksidaze (MPO) aktivnost

Metode za merjenje MPO dejavnosti so podrobno opisani drugje [36]. Na kratko, so osebki homogeniziramo v 50 mM kalijevega fosfatnega pufra (pH 6,0), ki vsebuje 0,5% heksadeciltrimetilamonijevim bromidom (Sigma Chemical Co.). Suspenzije smo centrifugirali in MPO aktivnost nastalega supernatantu smo testirali s spektrofotometrom. Ena enota MPO aktivnost je definirana kot količina encima, ki razgradi 1 mol peroksida /min pri 25 ° C. Rezultati so izraženi kot enot na gram želodčnega tkiva.

Statistična analiza

Vrednosti so izražene kot povprečje ± standardna napaka srednje vrednosti (SEM). Enosmerna analiza variance (ANOVA) smo uporabili za testiranje pomembnosti razlik med obdelanih skupin, rezultati pa so bili analizirani z Fisher je zaščiteno testa najmanj pomembna, razlika. P-vrednosti manj kot 0,05, so bile obravnavane statistično značilne.

Rezultati

Čas Potek želodca Healing

Za oceno celjenja razjed želodca, je eksperimentalni želodcu induciran z lokalno uporabo ocetne kisline iz želodca strani serozne . Razjede bili ocenjeni mikroskopom (slika 1A, 1B) in mikroskopom. Velikost razjed dosegel maksimum na dan 4 in nato sčasoma zmanjšala (slika 1C). MPO aktivnost (Slika 1D) in izraz TNFa (slika 1E) in IL-1β (slika 1E) mRNA v ulkusa želodca tkiva vrhuncem tudi na dan 4, in njihove vrednosti so bile v ulkusa tkivu višji kot pri normalnem želodca tkivu celotnem izpitno obdobje. Razjede povišani tudi ekspresijo VEGF mRNA (slika 1F).

HMGB1 Expression po razjede

Naslednja oceniti, ali je bila HMGB1 vključena v celjenje želodčne razjede. Ravni HMGB1 mRNA želodca tkiva (Slika 2A) in serumu HMGB1 (slika 2B) je dosegel svoj maksimum na dan 4. Raven HMGB1 mRNA so skoraj stalnica v času pregleda, medtem ko so koncentracije HMGB1 padla na normalno raven 6 dni po tem, ko indukcija razjede. Imunohistokemično, razjeda povzroča vidno citoplazemsko obarvanja HMGB1 v epitelnih celic, zlasti v poškodovanih območjih (slika 2C, 2D). Nasprotno, v nepoškodovanem želodčni sluznici, so HMGB1 lokalizacija omejena znotraj jedra epitelnih celic (slika 2e).

Vpliv eksogenih HMGB1, HMGB1 Immunoneutralization in Zaviranje HMGB1 objave na celjenje želodčne razjede

mRNA izražanja in MPO aktivnost je bila ovrednotena na dan 6, indeks ulkus je bila ovrednotena na dan 9, po študiji časovnega tečaja. Miši so dajali rHMGB1 ali anti-HMGB1 protitelesa intraperitonealno po indukcijo razjede. Dajanje rHMGB1 v odmerku bodisi 100 ug /kg ali 1000 ug /kg znatno potlačene želodčne razjede celjenje (slika 3A), kar je povezano s povečano aktivnostjo MPO (slika 3B) in TNF mRNA izražanja v razjedami tkiv (slika 3c). V nasprotju s tem, HMGB1 nevtralizirajočih protiteles promovira razjede (slika 4A) z zmanjšano MPO aktivnost (slika 4B) in TNF ekspresijo mRNA (slika 4C). Zapletlo vpliv eksogenega rHMGB1 na celjenje želodčne razjede je prekinil jemanje anti-HMGB1 protitelesa (Slika 4F). Izražanje VEGF mRNA ni vplivalo na zdravljenje z bodisi rHMGB1 (slika 3D, 3E) ali anti-HMGB1 protitelesa (slika 4D, 4E). V normalnem želodca tkiva, uporaba rHMGB1 ali anti-HMGB1 tudi ni nobenih učinkov na izražanje citokinov ali MPO aktivnost (podatki niso prikazani). Poleg tega je uporaba etil piruvat, inhibitor sproščanja HMGB1, izrazito spodbuja celjenje razjed, v primerjavi z zdravljenjem vozila. Healing je spremljala zatiranje TNF mRNA izražanja (podatki niso prikazani).

Vloga TLR2, TLR4 in RAGE na celjenje želodčne razjede

Da bi raziskali, ali TLR2, TLR4 in RAGE prispevati do HMGB1 posredovano želodca celjenje razjed, so eksperimentalne želodčnih razjed povzročene v TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO, in kontrolnih miših divjega tipa. TLR4 in pomanjkanje RAGE spodbuja želodčne razjede formaciji in preprečil povečanje TNF mRNA ekspresije po razjed, ker je pomanjkanje TLR2 vplivale niti indeks razjede niti izražanje TNFa mRNA (slika 5A, 5B). Uprava eksogenega HMGB1 prizadela niti indeks razjede niti izražanje TNF mRNA v obeh TLR4 KO ali bes KO miši (slika 5C-5F). Uprava eksogenega HMGB1, vendar z zamudo razjede na divjih miši in zmanjšano TNF mRNA izražanja (slika 3).

Izražanje TLR2, TLR4 in RAGE med celjenje želodčne razjede

Naslednja raziskovali mRNA izražanja in radioinkorporacijo TLR2, TLR4 in bes v divjih miši. Pomemben navzgor regulacija TLR2 mRNA opazili po indukciji izvedeni razjede (slika 6A). TLR2 radioinkorporacijo opazili predvsem pri vnetnih celic (slika 6B). Izraz TLR4 mRNA ni vplivala indukcijo razjede (slika 6c). TLR4 radioinkorporacijo opazili v apical delu epitelijske obloge na razjed robu in v nekaterih vnetnih celic v ulkusa posteljo (slika 6d).

so opazili velik up-regulacija RAGE mRNA na dan 9 po indukcija razjede (slika 6E). RAGE radioinkorporacijo opazili predvsem pri vnetnih celicah na robu ulkusa postelj in žilne endotelijske celične membrane (Slika 6F).

Obarvanje ulkusa tkiva iz TLR4 KO ali bes KO miši z anti-TLR4 protitelesa ali anti-RAGE protitelo, oziroma niso pokazale pozitivne signale, kar potrjuje specifičnost teh protiteles (podatki niso prikazani).

Pogovor

V tej študiji smo dokazali, da eksogeni odloži HMGB1 želodčne razjede zdravljenje, medtem ko se inducira TNFa izražanja in MPO aktivnost. Nasprotno, immunoneutralization od HMGB1 ali inhibicijo sproščanja HMGB1 pospešuje celjenje razjed, obenem pa zmanjšali TNFa izražanja in MPO aktivnost. Poleg tega, TLR4 in pomanjkanje RAGE pospešuje celjenje razjed in eksogeni HMGB1 ne upočasni celjenje razjed v TLR4 KO in bes KO miši. Ti rezultati kažejo, da je HMGB1 oteževalni dejavnik za celjenje želodčne razjede, ki deluje s pomočjo TLR4- in bes odvisna od poti. Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo razjasniti vlogo HMGB1 pri celjenju ran v prebavnem traktu.

Nekaj ​​študij obravnavala vlogo HMGB1 pri celjenju ran v drugih izven prebavil organov, vendar so rezultati teh raziskav so sporna [37-40]. Skladne z našimi rezultati, nekatere študije so pokazale, da ima HMGB1 zavira celjenje ran [37,38]. Zhang et al. je pokazala, da HMGB1 zmanjšuje rez celjenje ran z zmanjšanjem popravljalni odlaganje kolagena preko RAGE [37]. Goova sod. je pokazala, da blokira bes ligande, kot sta starost in HMGB1 z uporabo topno obliko receptorja za starost (sRAGE), pospešuje celjenje razjed in preprečuje ravni vnetnih citokinov [38]. Prejšnje študije so pokazale, da prekomerno vnetje oslabljeno celjenje ran. Na primer, naša Prejšnja študija je pokazala, da TNF prekomerno ekspresijo in pretirano infiltracijo nevtrofilcev se zapleta dejavnike pri oblikovanju in zdravljenje želodca [41]. Nadalje, v drugem vzorcu popravila tkiva, Goren et al. pokazale, da prekomerno nevtrofilcev in makrofagov infiltracija s TNFa prekomerno ekspresijo zavira celjenje poškodb miške kože [42]. Tako je možno, da HMGB1 zakasni želodčni ulkus celjenje skozi TNFa sprožilo vnetnih odzivov.

Nasprotno, nekatere študije in vitro kažejo, da so HMGB1 in njegove receptorje bistvenega pomena za celjenje ran [39,40]. Staraino sod. je pokazala, da HMGB1 pospešuje celjenje ran in regeneracijo s pospeševanjem migracije kožnih fibroblasti in keratinociti [39]. HMGB1 tudi pospešuje celjenje ran z 3T3 fibroblastov po inducira celične proliferacije in migracije skozi aktivacijo RAGE /zunajcelični-signala regulirano kinaze [40]. Ker so bile te študije in vitro izvaja brez vnetnih celic, so lahko razlike v eksperimentalnih metod za posledico različne ugotovitve o vlogi HMGB1 pri celjenju ran.

VEGF, ki je močan angiogenski rastni faktor, ima pomembno vlogo pri celjenje želodčne razjede [43,44]. Prejšnjih poročilih pokazala, da bi HMGB1 inducira ekspresijo VEGF v različnih tkivih in živalskih modelih [45-47]. Vendar pa v tej študiji, niti rHMGB1 niti anti-HMGB1 protitelesa prizadete VEGF ekspresijo v ulcerozni tkivu. Razlog za neskladje med našimi ugotovitvami in tistih iz prejšnjih raziskovalcev ni jasno, vendar pa so lahko povezane z uporabo različnih organov in eksperimentalnih modelih.

Obstajata 2 možni viri zunajcelični HMGB1: pasivno sprostitev od odmrlih celic [48] in aktivne sekrecije iz vnetnih celic [5]. V tej študiji so HMGB1 radioinkorporacijo opazili v citoplazmi kot tudi ožje, kar kaže, da so nekrotične celice vir HMGB1. Želodčne ravni mRNA HMGB1 pri celjenju razjed povečala, kar kaže, da vnetne celice proizvajajo in sprostitev HMGB1. Skupaj je bilo zvišanje serumskih HMGB1 povzročila zaradi pasivnega izpustitvi iz poškodovanih celic na želodca in aktivne sekrecije iz vnetnih celic.

serumu HMGB1 povečala po indukcijo želodca vendar se je zmanjšala v pozni fazi zdravljenja, čeprav je izraz HMGB1 in TNFa ostala visoka. Ti podatki povečati možnost sistema sistemskega HMGB1 pasti. V ta namen so poročali obstoj HMGB1 vezave na beljakovine. Trombomodulina, na površino celic glikoprotein, je primer za HMGB1 vezave na beljakovine. Rekombinantnega topnega trombomodulina humani inhibiral porast plazemskega HMGB1 z lipopolisaharid pri modelu podganjega [49] inducirane in vezan na HMGB1 prek lektin domene [50] preprečiti HMGB1 z interakcijo z drugimi receptorji [51]. V kliničnih aplikacijah, trombomodulina je koristna pri boleznih, povezanih s HMGB1 in pogojev, kot so sepsa zaradi svojih anti-HMGB1 lastnosti [52] prav. sRAGE, ki se nahajajo v obtoku, je še en primer HMGB1 vezave na beljakovine. sRAGE je topna oblika RAGE; deluje kot vabo za preprečevanje interakcijo med celično površinsko RAGE in njegovih ligandov, kot HMGB1 [53]. V tej študiji se lahko takšni sistemi za lovljenje igrajo tudi zaščitno vlogo pri preprečevanju širjenja vnetja, s čimer se spodbuja celjenje razjed.

Znano je, da so mnogi bolniki peptične razjede okuženi s Helicobacter pylori
. Čeprav je v tej raziskavi nismo raziskati vlogo HMGB1 na celjenje želodčne razjede pri miših, okuženih z H. pylori
, klinične in eksperimentalne študije kažejo, da bi bilo škodljivih vplivov na HMGB1 na celjenje želodčne razjede bolj izrazit pri bolnikih s H. pylori
okužbe kot pri tistih brez nje. Smo že pokazala, da je H. pylori
okužba povečuje nevtrofilcev infiltracijo v gnojne tkiva v mongolskih peščene [54]. Shimizu et al. tudi pokazala, da se število nevtrofilcev in makrofagov prodrli razjede marže višje stopnje pri bolnikih s H. pylori
okužbe kot pri tistih brez okužbe [55]. Velika količina HMGB1 je torej najverjetneje prisotna v ulkusa tkivu okuženi s H. pylori
, saj bi se izloča s temi vnetnih celic. Poleg tega Radin sod. poročali, da Vaca, glavni virulentni dejavnik tega organizma, povzroči programirano nekrozo želodčnih epitelnih celic in naslednji izdaji HMGB1 [56]. Tako pričakujemo, da bi bilo škodljivo za HMGB1 na celjenje razjed bolj izrazit v H. pylori
okuženimi bolniki.

TLR2, TLR4 in RAGE, ki posreduje provnetne odzive, so splošno znani HMGB1 receptorjev. Naši rezultati so jasno pokazali, da TLR4 in RAGE igrajo ključne vloge v celjenje želodčne razjede. Ta rezultat je v skladu s predhodnimi ugotovitvami o vnetnih odzivov s HMGB1 induciranih. Ena izmed najbolj uveljavljenih modelov vključujejo interakcijo med HMGB1 in teh receptorjev I-R poškodba. V jeter I-R poškodbe, miši TLR4 s pomanjkanjem razstavljena manj jeter I-R škodo; škoda pri miših TLR4-pomanjkljivo ni vplivala rHMGB1 ali anti-HMGB1 protitelesa [26]. Poleg tega je blokiranje RAGE zaščiteni pred jetrnih celic smrti in nekroze jeter I-R modelu škode [57]. V modelu srca I-R poškodbe, Andrassy et al. je pokazala, da miši RAGE s pomanjkanjem prikaže le rahlo vnetje, ki je posledica srčne I-R poškodbe; vnetje ni vplivala indukcijo rHMGB1 [27]. Te ugotovitve kažejo, da je TLR4-HMGB1 in bes-HMGB1 interakcije imajo ključno vlogo pri I-R poškodb, čeprav je treba upoštevati razlike v vsakem organu. Drugi sedež model je sistemska vnetja, kot so sepsa [5,8,58]. V poskusni model znotraj trebušne sepso, Susa et al. je pokazala, da je interakcija HMGB1-RAGE tesno povezano s sepso povzročeno diafragmalnega disfunkcije [58]. V vivo sistemskem modelu vnetja, ustvarjenega z injekcijo eksogenega HMGB1, Zoelen sod. pokazale, da HMGB1 sproži sproščanje citokinov, aktivacijo koagulacije in rekrutiranje nevtrofilcev preko TLR4 in RAGE [8]. Tako, TLR4 in RAGE igrajo ključne vloge v patogenezi jo posreduje-HMGB1 povezano poti, vključno s potjo v naši razjeda zdravilno modela.

Naši rezultati kažejo, da je TLR2 nobene povezave celjenje želodčne razjede: razjede v TLR2 KO miši spominjalo, da je v divjih miši. Čeprav in vitro študije z makrofag celičnih linij je pokazala, da TLR2 HMGB1 pot povzroča vnetne odzive [6,9], niso poročali vivo učinki TLR2 v HMGB1 posredovano patologije. Tako je na podlagi predhodnih ugotovitev [8] in naših rezultatov lahko HMGB1-TLR2 poti igrajo manjšo vlogo v popravilo in patogenezi poškodbe tkiva in vnetja.

Na koncu smo pokazali, da je HMGB1 zapleten dejavnik v procesu zdravljenja želodčne razjede, kakor tudi pri drugih bolezenskih stanj. Poleg tega smo pokazali, da HMGB1 zavira razjede zdravljenje z mehanizmom, ki vključuje TLR4, RAGE in previsokih vnetne odzive. Čeprav so zaviralci protonske pomp pogosto predpisano za zdravljenje želodčnih razjed, rešljive razjede še vedno predstavljajo klinični problem. Naš sedanji študija podpira nov koncept za zdravljenje neukrotljive želodčnih razjed, poleg zdravljenja z zaviralci protonske pomp.

Priznanja

Zahvaljujemo emi Suzuki-Yoshioka za tehnično pomoč. Prav tako bi se rad iskreno zahvalil članom osebja Osaka City University, ki nas podpira.

• Plos ONE: Mangiferin blaži želodčne razjede v Ishemija /reperfuziji podgane: Vključevanje PPAR-y, NF-κB in Nrf2 /HO-1 signalizacijo Pathways
• Plos ONE: Ne Združenje porabo kave z razjedo želodca, razjeda na dvanajstniku, refluksnega ezofagitisa, in neerozivne refluksna bolezen: v prerezu Študija 8,013 zdravih osebah v Japan