Ploche ONE: High-Mobility Group Box 1 inhibuje žalúdočný vred Liečenie cez Toll-like receptor 4 a receptora pre pokročilých glykácia End Products

abstraktné

High-mobilita časti 1 (HMGB1) bol pôvodne objavený ako jadrový proteín, ktorý interaguje s DNA ako non-proteín histónov chromatínu asociované stabilizovať nukleosomy a regulovať transkripciu mnohých génov v jadre. Raz unikli alebo aktívne sekretován do extracelulárneho prostredia, HMGB1 aktivuje zápalové cesty stimuláciou viac receptorov, vrátane Toll-like receptora (TLR) 2, TLR4, a receptor pre pokročilých glykácia produktov (RAGE), čo vedie k poškodeniu tkanív. Hoci schopnosť HMGB1 je vyvolať zápal bolo dobre zdokumentované, žiadna štúdia skúmala úlohu HMGB1 pri hojení rán v gastrointestinálne oblasti. Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť úlohu HMGB1 a jeho receptorov v liečení žalúdočných vredov. Skúmali sme tiež aký receptor medzi TLR2, TLR4, alebo RAGE sprostredkováva účinky HMGB1 o hojenie vredov. Žalúdočné vredy boli indukované serózna aplikácii kyseliny octovej u myší, a žalúdočné tkanivá boli spracované pre ďalšie hodnotenie. Indukcia vredov zvýšila imunohistochemické farbenie cytoplazmatického HMGB1 a zvýšené hladiny v sére s HMGB1. Veľkosť vred, myeloperoxidáze (MPO) Aktivita a expresie tumor nekrotizujúceho faktora a (TNF-a) mRNA vyvrcholil v deň 4. intraperitoneálnom podaní HMGB1 oneskorené hojenie vredov a zvýšenej MPO aktivitu a expresiu TNFa. Na rozdiel od toho podania anti-HMGB1 protilátky podporované hojenie vredu a zníženie MPO aktivitu a expresiu TNFa. TLR4 a nedostatok RAGE lepšie hojenie vredov a znižuje hladinu TNFa, zatiaľ čo hojenie vredov v TLR2 knockout (KO) myší bola podobná ako u myší divokého typu. V TLR4 KO a RAGE KO myší exogénny HMGB1 neovplyvňoval hojenie vredu a expresiu TNF. Takto sme ukázali, že HMGB1 je komplikujúcim faktorom v žalúdočný vred proces hojenia, ktorý pôsobí prostredníctvom TLR4 a RAGE vyvolať nadmerné zápalovej reakcie.

Citácia: Nadatani Y, Watanabe T, T Tanigawa, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) High Mobility Group-Box 1 inhibuje žalúdočný vred liečenie cez Toll-like receptor 4 a receptor pre pokročilých glykácia konečných produktov. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10,1371 /journal.pone.0080130

Editor: Mathias Chamaillard, INSERM, Francúzsko

prijatá: May 29, 2013; Prijaté: 30.Septembra 2013; Uverejnené: 11.11.2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. Kenji Watanabe - Grant /podporovala výskum od Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd.; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Rozprávanie a výučby: Abbott Japan Co., Ltd. Yasuhiro Fujiwara - rozprávanie a výučby: Eisai Co. Ltd Tetsuo Arakawa - poradné výbory alebo preskúmanie Panely: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. ďalší autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy existujú. To však nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

High-mobility group box proteín 1 (HMGB1), člen povrchy s vysokým divízie mobility proteín nadčeľade, je jadrový proteín [1]. HMGB1 interaguje s DNA ako nehistonové proteín chromatín-spojené k stabilizácii nukleosomy a regulovať transkripciu mnohých génov v jadre [2]. Pri úniku z bunky počas nekrotické bunkovej smrti [3] alebo aktívne sekretován do extracelulárneho prostredia, monocyty a makrofágy [3,4], s HMGB1 pôsobí ako alarmin so silnými protizápalovými vlastnosťami [5].

najlepšie preštudovaným HMGB1 receptors are receptor Toll-like (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], a prijímača Pre pokročilých glykácia výrobkov (RAGE) [6,8]. TLR2 a TLR4 sú členmi rodiny TLR, a hrajú kľúčovú úlohu pri vrodenej imunitnej odpovede na zárodky spojené molekulárnej vzory a molekúl, poškodenie súvisiace s molekulárnou vzor [10]. TLR2 primárne rozpoznáva zložiek bakteriálnej bunkovej steny gram-pozitívne a TLR4 primárne rozpoznáva lipopolysacharid, ktorý je hlavnou zložkou bunkovej steny gram-negatívnych baktérií. Spúšťanie TLR2 a TLR4 signálnych dráh vedie k aktivácii jadrového faktora kB (NF-kB), a to prostredníctvom vedľajšej proteín MyD88 a následné reguláciu imunitných a zápalových génov, vrátane zápalových cytokínov, ako je napríklad faktor nekrotizujúci nádory alfa (TNFa), s aktiváciu mitogénom aktivovaných proteínkináz [11-13]. Receptor pre pokročilých glykácia produktov (RAGE) je multi-ligand receptor, ktorý patrí do superrodiny imunoglobulínov [14]. Ďalšie známe RAGE ligandy sú amyloid [15] a S100 [16]. Viacnásobné pokusy naznačujú, že interakcia ligand-RAGE tiež aktivuje NF-kB a mitogénom aktivovaných proteínkináz [17-20].

Mnoho patologické stavy sú spojené s prozápalových vlastnosťou HMGB1. Predchádzajúce správy ukázali, že HMGB1 hrá kritickú úlohu v endotoxemií [21], akútna pankreatitída [22], syndróm akútnej respiračnej tiesne [23], niektoré autoimunitné ochorenia [24], cerebrálna ischémia zranenia [25], a ischémie-reperfúziou (IR) poranenie pečene [26], srdcové [27] a obličiek [28]. S ohľadom na gastrointestinálny trakt, HMGB1 je komplikujúcim faktorom v experimentálnej kolitídy [29,30], a nesteroidné protizápalové látky indukované tenkého čreva poranenia [31].

V súčasnosti je úloha HMGB1 v hojenie rán, je jasné, aj keď jeho schopnosť indukovať zápal bola dobre zdokumentovaná, ako je popísané vyššie. V zažívacom poli, žiadna štúdia skúmala úlohu HMGB1 pri hojení rán. Cieľom tejto štúdie bolo skúmať úlohu HMGB1 v žalúdočných vredov. Skúmali sme úlohu HMGB1 v procese hojenia pomocou zavedeného experimentálneho modelu chronickej žalúdočný vred vytvorený v hlodavcoch topickú aplikácií kyseliny octovej z žalúdočné strany serózna. Tento model verne napodobňuje ľudskú peptický žalúdočný vred histológie a morfológia [32]. Tiež sme skúmali, či HMGB1 ovplyvňuje hojenie vredu cez TLR2, TLR4, alebo RAGE.

Materiály a metódy

Zvieratá

TLR2- a TLR4-knockout (KO) myší, ktoré boli pôvodne vytvorené Dr. S. Akira (Osaka University, Osaka, Japonsko ) a backcrossed 8 krát na C57BL /6 pozadím, boli získané od Oriental BIOSERVICE, Inc. (Kyoto, Japonsko). RAGE-KO myší, ktoré boli spätne krížené do C57BL /6 pozadím, boli pôvodne generované a darček od Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japonsko). Divokého typu C57BL /6 myši boli zakúpené od Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japonsko) ako kontrolného kmeňa pre TLR2, TLR4 KO KO, a RAGE KO myší. Boli použité špecifické 12 týždňov starí samci patogén-free. Všetky zvieratá bola umiestnená v polykarbonátových klietkach s podstielkou papier čipu. Klietky boli umiestnené v klimatizovanej miestnosti s Biohazard cyklu svetlo-tma 12 h. Všetky experimentálne postupy boli schválené Výborom pre zvierat starostlivosť o Osaka City University Graduate School of Medicine (Permit číslo: 11006). Všetky operácie boli vykonávané pod izofluranom a bolo vynaložené úsilie, aby sa minimalizovalo utrpenie.

Experimentálne Indukcia vredov

žalúdočný vred bola vyvolaná spôsobom popísaným podrobne inde [33], s drobnými úpravami , Stručne povedané, v éterové narkóze sa brucha týchto zvierat boli narezané a žalúdok bol vystavený. Polypropylénové skúmavky (4 mm v priemere) bola umiestnená na serózna strany žalúdka. 80-ul alikvotná časť 60% kyseliny octovej sa pridá do skúmavky, ktorá sa udržuje v kontakte s povrchom serózna počas 30 s. Po okamžité odstránenie kyseliny octovej z rúrky odsatím, žalúdok bol vrátený do svojej pôvodnej polohy, a brucho bolo uzavreté. Predchádzajúce správy ukázali, že veľkosť žalúdočného vredu dosiahla maximum v deň 3 alebo 4 po indukcii vredov, a potom sa postupne znižoval [32,34]. Liečenie fáza experimentálne žalúdočného vredu začína v deň 4 po indukcii vredov

Experimentálne skupiny

Pre skúmanie účinku exogénne HMGB1, myši dostávali intraperitoneálna injekcia ľudského rekombinantného HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 ug /kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) alebo nosič (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom) dvakrát denne, počnúc 4 dni po indukcii vredov (od 4. dňa na deň 9).

Ďalej je účinok immunoneutralization HMGB1 o žalúdočných vredov bola hodnotená. Myši boli intraperitoneálne podané neutralizujúce anti-kuracie HMGB1 polyklonálna protilátka (5 mg /kg, Shino-Test Corporation, Tokyo, Japonsko) alebo normálne kuracie IgY (5 mg /kg, Sigma-Aldrich Co.) začínajúca na 4 dni po indukcii vredov ( od 4. dňa na deň 9). Okrem toho, na potvrdenie účinnosti uvoľňovaniu inhibítora HMGB1, etyl pyruvát alebo nosičom boli injikované dvakrát denne, počínajúc v deň 4. po indukcii vredov.

Okrem toho, pre stanovenie receptora zodpovednou za HMGB1 súvisiacich s žalúdočný vred hojenie, žalúdočné vredy boli indukované v TLR2 KO, TLR4 KO, a RAGE KO myší, s alebo bez intraperitoneálnou injekciou 1000 ug /kg rHMGB1 dvakrát denne počínajúc v deň 4 po indukcii vredov.

Žalúdok sa odstráni a veľkosť vred sa merala v deň 6 alebo 9 po indukcii vredov. Veľkosť vred bol vyjadrený ako index vred, súčin maximálnej dĺžky a minimálnej dĺžky (tj. Maximálna dĺžka sa vynásobí minimálnu dĺžku). Štúdie boli vykonané za použitia vzoriek 4-8. Vzorky žalúdočnej tkanivá boli spracované pre ďalšie hodnotenie.

mRNA expresie zápalových mediátorov v žalúdočnej tkanive určená Real-time kvantitatívne reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR),

real- doba kvantitatívnej RT-PCR bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [35]. V stručnosti, celková RNA bola izolovaná z črevnej tkaniva pomocou ISOGEN kit (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japonsko) podľa protokolu výrobcu. Komplementárna DNA bola získaná pomocou High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) podľa protokolu výrobcu. Real-time kvantitatívnej analýzy RT-PCR bola vykonaná za použitia Applied Biosystems 7500 Fast systému a softvéru real-time PCR (Life Technologies Corporation). Reakčná zmes bola pripravená podľa protokolu výrobcu s použitím TaqMan Universal PCR Master Fast zmesi (Life Technologies Corporation). Tepelné Podmienky cyklovania boli nasledujúce: 45 cyklov amplifikácie pri 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C po dobu 1 min. Celková RNA sa podrobí kvantitatívnej real-time RT-PCR pre meranie cieľových génov s použitím TaqMan glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy kontrolných činidiel (Life Technologies Corporation), ktorý bol použitý ako vnútorný štandard. Expresia mRNA kódujúci HMGB1, TLR4, RAGE, vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), interleukín-1-beta (IL-1β) a TNFa v ulcerácie a normálne žalúdočnej tkanive bol kvantifikovaný pomocou real time RT-PCR, a štandardizovaný na glyceraldehyd -3-fosfátdehydrogenázy mRNA. Expresia každej mRNA je označený ako pomer, vztiahnuté na strednú hodnotu v normálnej žalúdočnej tkanive. Primery a sondy použité pre RT-PCR sú uvedené v tabuľke 1.
Gene
spoločností primeru a sondy
TNF-αPrimer (dopredu) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Dopredu) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Dopredu) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Dopredu) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (reverznej) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (dopredu) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Dopredu) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (reverznej) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (dopredu) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (reverznej) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. Primery a sondy.
CSV stiahnuť súbor CSV

Imunohistochemické a imunofluorescencie

Tkanivové vzorky boli fixované 0,1 M fosfátového pufra (pH 7,4) s obsahom 4% paraformaldehydu. Vzorky boli vložené do parafínu a sériovej 5-um hrubé rezy boli upevnené na silanizovaná sklíčka (Dako, Tokyo, Japonsko). Vzorky boli ponorené do roztoku 3% H _{2O 2 v absolútnom metanole po dobu 5 minút za účelom inhibícia endogénnej peroxidázy a potom inkubované v 5% odstredeného mlieka po dobu 10 minút. Hematoxylínom a eosínu prebehla ako morfologických pozorovania. Králik monoklonálna protilátka anti-A HMGB1 (zriedeného 1: 250, abca, Cambridge, MA), bol aplikovaný ako primárnej protilátky a inkubované cez noc pri 4 ° C sa vzorky. Sekundárne protilátkou (Histofine Simple Stain MAX peroxidázy kit; Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japonsko) bola inkubovaná s vzoriek po dobu 1 hodiny v súlade s pokynmi výrobcu. Imunoreaktivita bola vizualizované spracovaním sekcií s Histofine Simple Stain a Diaminobenzidine roztoku (Nichirei Biosciences Inc.). Vzorky potom boli kontrastne hematoxylínom. Ďalšie, TLR2, TLR4 a RAGE expresie zistila postupom imunofluorescencia. Primárne protilátky použité v imunofluorescencie obsahovala myší monoklonálnu protilátku proti TLR2 (riedené 1: 200; abca), čo je myšou monoklonálnu protilátku proti TLR4 (riedené 1: 200; abca), a potkania monoklonálne protilátky proti RAGE (riedené 1: 250; abca). vzorky tkaniva, ktoré boli pripravené, ako je popísané vyššie, boli inkubované cez noc pri 4 ° C s primárnymi protilátkami a potom sa nechá reagovať so zodpovedajúcimi fluorescenčné sekundárnej protilátky konjugovanej s farbivom (abca) počas 2 hodín. Vzorky boli skúmané pomocou konfokálního mikroskopu vybaveného argónu a kryptónu argónom laserových zdrojov.}

Meranie Serum HMGB1 úrovňou

Blood (1000 ul) boli získané vzorky v separácii séra skúmaviek srdcovej punkciou. Po odstredení pri 3000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút, sérum sa zhromaždia a uložia pri -80 ° C. Sérové ​​koncentrácie HMGB1 boli merané za použitia HMGB1 sandwich ELISA kitu (Shino-Test Corporation) podľa protokolu výrobcu.

Meranie myeloperoxidasy (MPO) Aktivita

Metódy používané na meranie MPO aktivity sú podrobne popísané na inom mieste [36]. V stručnosti, vzorky sa homogenizujú v 50 mM pufri fosforečnanu draselného (pH 6,0) obsahujúci 0,5% hexadecyltrimethylammonium bromidu (Sigma Chemical Co.). Suspenzia sa odstredí, a MPO aktivita vo výslednom supernatantu bola stanovená spektrofotometrom. Jedna jednotka aktivity MPO bola definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré degradovalo 1 mikromol peroxidu /min pri teplote 25 ° C. Výsledky sú vyjadrené ako jednotky na gram žalúdočné tkaniva.

Štatistická analýza

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA), bol použitý pre testovanie významnosti rozdielov medzi skupinou sa rozumie ošetrenie, a výsledky boli analyzované pomocou Fisherovho chráneným najmenej významný rozdiel-testu. P-hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné.

Výsledky

Časový priebeh liečenia žalúdočných vredov

Pre vyhodnotenie procesu hojenia žalúdočných vredov, experimentálne žalúdočný vred sa indukuje lokálnej aplikácii kyseliny octovej zo žalúdočnej strany serózna , Vredy boli hodnotené mikroskopicky (1A, 1B) a makroskopicky. Veľkosť vredov dosiahla maximum v deň 4 a časom klesala potom (obrázok 1C). MPO aktivity (obrázok 1D) a expresie TNFa (obrázok 1E), a IL-1 (obrázok 1E) mRNA v vredy žalúdočné tkanive takisto dosiahla vrchol v deň 4, a ich hladiny boli v vredy tkanive vyššie ako v normálnej žalúdočnej tkanive v celom skúškové obdobie. Vredy tiež zvýšené expresiu VEGF mRNA (obr 1F).

HMGB1 Expression po ulcerácie

Ďalej sme posúdiť, či HMGB1 bol zapojený do žalúdočného vredu hojenie. Hladiny mRNA HMGB1 v žalúdočnej tkanive (obr 2A) a sérové ​​hladiny HMGB1 (obrázok 2B) dosiahla svoje maximum v deň 4. Úrovne HMGB1 mRNA boli v skúškovom období takmer konštantný, zatiaľ čo sérové ​​hladiny HMGB1 klesla na normálnu úroveň 6 dní po indukcie vredu. Imunohistochemicky, vredy vyvolané významné cytoplazmatickú farbenie HMGB1 v epiteliálnych bunkách, najmä v poranených oblastiach (obrázok 2c, 2d). Naproti tomu, v neporušenej žalúdočnej sliznice, HMGB1 lokalizácia bola obmedzená v jadrách buniek epitelu (obrázok 2e).

účinky vonkajších HMGB1, HMGB1 Immunoneutralization, a inhibíciu HMGB1 Release na žalúdočný vred liečenie

expresie mRNA a MPO aktivita bola hodnotená v deň 6 a index vred bola hodnotená v deň 9, v závislosti od predmetu štúdie času. Myši boli liečené rHMGB1 alebo anti-A HMGB1 protilátka intraperitoneálne po indukcii vredov. Podávanie rHMGB1 v dávke buď 100 ug /kg alebo 1000 ug /kg významne potlačená žalúdočných vredov (obrázok 3A), ktorá bola spojená so zvýšenou MPO aktivity (obrázok 3B) a expresie TNF-a mRNA v ulcerácie tkaniva (obrázok 3C). Na rozdiel od toho HMGB1 neutralizačné protilátky propagované hojenie vredov (obrázok 4A), so zníženou aktivitou MPO (obrázok 4B) a expresie TNF-a mRNA (obr 4C). Komplikovať vplyv exogénne rHMGB1 na žalúdočné vredy hojenie bol zrušený súčasným podávaním anti-HMGB1 protilátky (obr 4F). Expresia VEGF mRNA nebola ovplyvnená pôsobením (obrázok 3D, 3E) buď rHMGB1 alebo anti-HMGB1 protilátky (obrázok 4D, 4E). V normálnej žalúdočnej tkanive, podávanie rHMGB1 alebo anti-HMGB1 tiež nemala žiadny vplyv na expresiu cytokínu alebo MPO aktivitu (dáta nie sú uvedené). Okrem toho, podávanie etyl-pyruvátu, inhibítor uvoľňovanie HMGB1, výrazne podporované hojenie vredu, v porovnaní s ošetrením vehikulom. Liečenie bolo sprevádzané potlačenie expresie TNFa mRNA (dáta nie sú uvedené).

Role TLR2, TLR4, a RAGE v žalúdočných vredov

Ak chcete zistiť, či je TLR2, TLR4, a RAGE prispieť na HMGB1 sprostredkované žalúdočné hojenie vredov, experimentálne žalúdočné vredy boli indukované v TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO a kontrolných myší divokého typu. TLR4 a nedostatok RAGE podporoval tvorbu žalúdočný vred a zabránila zvýšeniu expresie TNFa mRNA po vredov, zatiaľ čo deficit TLR2 ovplyvnený ani index vred ani expresiu TNFa mRNA (obr 5A, 5B). Podávanie exogénneho HMGB1 nedotýka ani indexu vredu ani expresiu TNFa mRNA v oboch TLR4 KO alebo RAGE KO myší (5C-5F). Podávanie exogénneho HMGB1, však, oneskorené hojenie vredu u myší divokého typu a zníženej expresie TNF-a mRNA (obrázok 3).

Vyjadrenie TLR2, TLR4 a RAGE pri liečení žalúdočných vredov

Ďalej sme skúmali expresiu mRNA a imunoreaktivitu TLR2, TLR4 a hnevu u myší divokého typu. Významná up-regulácia mRNA TLR2 bola pozorovaná po indukcii vredov (obrázok 6A). TLR2 imunoreaktivita bola pozorovaná najmä v zápalových bunkách (obrázok 6B). Expresia TLR4 mRNA nebola ovplyvnená indukciu vredov (obrázok 6C). TLR4 imunoreaktivita bola pozorovaná v apikálnej časti epiteliálne výstelky na vredy okraj a v niektorých zápalových buniek v vredu lôžka (obrázok 6D).

bol pozorovaný významný up-regulácia mRNA RAGE v deň 9 po indukciu vredov (obrázok 6E). RAGE imunoreaktivita bola pozorovaná najmä v zápalových buniek na okraji vredu lôžok a v vaskulárny endoteliálny bunkovej membrány (obr 6F).

Farbenie vredy tkaniva TLR4 KO alebo RAGE KO myší anti-TLR4 protilátky alebo anti-RAGE protilátky, v danom poradí, neboli zistené žiadne pozitívne signály, čo potvrdzuje špecificitu týchto protilátok (dáta nie sú uvedené).

Diskusia

V tejto štúdii sme ukázali, že exogénny HMGB1 spomaľuje hojenie žalúdočného vredu, zatiaľ čo indukcia TNF expresiu a MPO aktivitu. Naopak, immunoneutralization HMGB1 alebo inhibícia uvoľňovania HMGB1 podporuje hojenie vredu pri súčasnom znížení TNFa expresiu a MPO aktivitu. Navyše, TLR4 a nedostatok RAGE podporuje hojenie vredu a exogénne HMGB1 nedokáže oddialiť hojenie vredu v TLR4 KO a Rage KO myší. Tieto výsledky naznačujú, že HMGB1 je komplikujúcim faktorom pre žalúdočné hojenie vredov, ktoré pôsobia prostredníctvom TLR4- a RAGE závislé dráh. Pokiaľ je nám známe, je toto prvá správa objasniť úlohu HMGB1 pri hojení rán v zažívacom trakte.

Niekoľko štúdií riešiť úlohu HMGB1 pri hojení rán v iných ako orgánov gastrointestinálneho traktu, ale výsledky týchto štúdií sú sporné [37-40]. V súlade s našimi výsledkami, niektoré štúdie preukázali, že HMGB1 má inhibičný účinok na hojenie rán [37,38]. Zhang et al. preukázané, že HMGB1 zhoršuje rez hojenie rán znížením reparatívne ukladanie kolagénu pomocou RAGE [37]. Goove et al. preukázali, že blokovanie zlosť ligandy ako je vek a HMGB1 pomocou rozpustnú formu receptora pre daný vek (sRAGE), urýchľuje hojenie vredu a potláča hladiny zápalových cytokínov [38]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že nadmerné zápal zhoršené hojenie rán. Napríklad naše predchádzajúce štúdie preukázali, že TNFa nadmerná expresia a nadmerné infiltrácie neutrofilov komplikujú faktory pri tvorbe a liečenie žalúdočných vredov [41]. Ďalej, v inom modeli opravy tkaniva, Goren et al. preukázané, že nadmerná neutrofilov a makrofágov infiltrácie s TNF-over-expresiu inhibuje hojenie poranení kože myší [42]. Je teda možné, že HMGB1 oneskoruje žalúdočné hojenie vredu pomocou TNF-a spustená zápalových odpovedí.

Na rozdiel od toho niektoré štúdie in vitro naznačujú, že HMGB1 a jeho receptory sú dôležité pre hojenie rán [39,40]. Staraino et al. preukázali, že HMGB1 urýchľuje proces hojenia rán a regeneráciu posilnením migráciu kožných fibroblastov a keratinocytov [39]. HMGB1 tiež podporuje hojenie rán 3T3 fibroblastov indukciou bunkovej proliferácie a migrácie prostredníctvom aktivácie RAGE /extracelulárnej signál regulované kinázy [40]. Vzhľadom k tomu, že tieto štúdie in vitro boli vykonané v neprítomnosti zápalových buniek, rozdiely v experimentálnych metód môže viesť k nekonzistentné závery týkajúce sa úlohy HMGB1 pri hojení rán.

VEGF, silný angiogénny rastový faktor, hrá dôležitú role v žalúdočných vredov [43,44]. Predchádzajúce správy ukázali, že HMGB1 by mohlo vyvolať expresiu VEGF v niekoľkých tkanivách a na zvieracích modeloch [45-47]. Avšak, v tejto štúdii, ani rHMGB1 ani anti-HMGB1 protilátky ovplyvnený expresiu VEGF v vredovej tkanive. Dôvod pre rozdiely medzi našich zistení a tých starších vyšetrovatelia nie je jasný, ale môže byť spojená s použitím rôznych orgánov a experimentálnych modeloch.

K dispozícii sú 2 možných zdrojov extracelulárnej HMGB1: pasívne prepustenie z odumretých buniek [48] a aktívna sekrécia z zápalových buniek [5]. V tejto štúdii, HMGB1 imunoreaktivita bola pozorovaná v cytoplazme, rovnako ako jadro, čo naznačuje, že nekrotické bunky sú zdrojom HMGB1. Žalúdočné hladiny mRNA HMGB1 vzrástla počas hojenia vredov, čo naznačuje, že zápalové bunky produkujú a uvoľňujú HMGB1. Súhrnne zvýšenie sérového HMGB1 za následok bol spôsobený pasívnym prepustenie z poranených buniek pri žalúdočných vredov a aktívnej sekrécie zápalových buniek.

sérové ​​hladiny HMGB1 zvýšila po indukcii žalúdočných vredov, ale klesla na neskorú fázu hojenia, aj keď je expresia TNFa HMGB1 a zostala vysoká. Tieto údaje zvýšiť možnosť systémového HMGB1 záchytným systémom. Za týmto účelom bola hlásená existencia väzbového proteínu HMGB1. Thrombomodulin, bunka-povrchový glykoproteín, je jedným z príkladov z väzbového proteínu HMGB1. Rekombinantný ľudský rozpustný thrombomodulin inhibuje zvýšenie plazmatických HMGB1 indukované lipopolysacharid na potkaním modelu [49], a naviazané na HMGB1 prostredníctvom lektínovú odbore [50], aby sa zabránilo HMGB1 v interakcii s inými receptormi, [51]. V klinických aplikáciách, thrombomodulin je tiež užitočné u chorôb súvisiacich s HMGB1 a podmienok, ako je sepsa, pretože jeho anti-HMGB1 vlastností [52]. sRAGE, nájdené v obehu, je ďalším príkladom väzbového proteínu HMGB1. sRAGE je rozpustná forma RAGE; to sa chová ako návnadu, aby sa zabránilo interakcii medzi bunkového povrchu RAGE a jeho ligandy, ako HMGB1 [53]. V tejto štúdii, také lovu systémy môžu tiež zohrávať ochrannú úlohu pri prevencii šírenia zápalu, a tým podporovať hojenie vredu.

Je známe, že mnoho pacientov žalúdočného vredu je nakazených vírusom Helicobacter pylori
. Hoci v tejto štúdii sme nemali skúmať úlohu HMGB1 pri žalúdočných vredov u myší infikovaných H. pylori
, klinickej a experimentálnej štúdie naznačujú, že škodlivý účinok na žalúdočné HMGB1 vredov by bolo výraznejšie u pacientov s H. pylori
infekcií ako u pacientov bez nej. Už skôr sme ukázali, že H. pylori
infekcie zvyšuje infiltráciu neutrofilov do vredy tkaniva v mongolských Gerbil [54]. Shimizu et al. tiež ukázala, že neutrofily a makrofágy infiltrujú vred marža vo väčšej miere u pacientov s H. pylori
infekcií ako u pacientov bez infekcie [55]. Veľké množstvo HMGB1 je teda pravdepodobné, že prítomný v vredy tkanive infikované H. pylori
, pretože by to byť vylučovaný týchto zápalových buniek. Okrem toho, Radin et al. uvádzajú, že Vaca, hlavný faktor virulencie tohto organizmu, spôsobuje nekrózu programovaný žalúdočných epiteliálnych buniek a následné uvoľnenie HMGB1 [56]. Preto očakávame, že zhubný HMGB1 na hojenie vredov by byť viac prominentnú v H. pylori
-infected pacientov.

TLR2, TLR4, a RAGE, ktoré sprostredkovávajú prozápalové odpovede, sú všeobecne známe HMGB1 receptory. Naše výsledky jasne ukazujú, že TLR4 a RAGE hrajú zásadnú úlohu v žalúdočných vredov. Tento výsledok je v súlade s predchádzajúcimi poznatkami o zápalových odpovedí indukovaných HMGB1. Jeden z najviac zavedených modelov zahŕňajúcich interakciu medzi HMGB1 a tieto receptory je poranenie I-R. Pri poškodení pečene I-R, TLR4-myší s deficitom vykazovali menej pečene I-R škody; škoda v TLR4 u myší s deficitom nebola ovplyvnená rHMGB1 alebo anti-HMGB1 protilátky [26]. Navyše blokovanie RAGE chránené proti hepatocelulárny smrti a nekrózy v pečeňové modeli I-R zranenia [57]. V modeli poranenia srdcové I-R, Andrassy et al. ukázal, že RAGE-myší s deficitom zobrazená iba mierny zápal, poškodením srdca I-R; zápal nebola ovplyvnená indukciou rHMGB1 [27]. Tieto zistenia naznačujú, že TLR4-HMGB1 a RAGE-HMGB1 interakcie hrajú kľúčovú úlohu pri poranení I-R, aj keď je potrebné vziať do úvahy rozdiely v každom orgáne. Druhý zavedený model je systémový zápal, ako je sepsa [5,8,58]. V experimentálnom modeli vnútrobrušného sepsa, Susa a kol. preukázané, že interakcia HMGB1-RAGE bol úzko spojený so sepsou indukovanú bránicový dysfunkciou [58]. V systémovej in vivo modeli zápalu vytváraného vstrekovaním exogénne HMGB1, Zoelen et al. preukázali, že HMGB1 indukuje uvoľňovanie cytokínov, aktivácia koagulácie, a neutrofilné náboru prostredníctvom TLR4 a RAGE [8]. Tak, TLR4 a RAGE hrať kľúčovú úlohu v patogenéze sprostredkovaný HMGB1 spojené s cestou, vrátane ciest v našom vredov modelu.

Naše výsledky ukazujú, že TLR2 nemá žiadny vzťah k žalúdočnej hojenie vredov: hojenie vredu v TLR2 KO myší pripomínal, že u myší divokého typu. Aj keď štúdie in vitro za použitia bunkových línií makrofágov je uvedené, že TLR2-HMGB1 cesta indukuje zápalovú odpoveď [6,9], neboli pozorované in vivo účinky TLR2 v HMGB1-sprostredkované patologických stavov. Teda, na základe predchádzajúcich zistení [8] a našich výsledkov je HMGB1-TLR2 dráha môže hrať menšiu úlohu v oprave a patogenéze poranenia tkaniva a zápalu.

Na záver sme ukázali, že HMGB1 je komplikujúcim faktorom v procese hojenia žalúdočných vredov, rovnako ako v iných patologických stavov. Navyše sme ukázali, že HMGB1 inhibuje hojenie vredu pomocou mechanizmu, ktorý zahŕňa TLR4, zlosť a nadmerné zápalové reakcie. Hoci inhibítory protónovej okázalosť sú bežne predpísané pre žalúdočné vredy, vredy neriešiteľné naďalej predstavovať klinický problém. Naša súčasná štúdia podporuje novú koncepciu pre liečbu neriešiteľných žalúdočných vredov, okrem inhibítorov protónovej terapie okázalosť.

Poďakovanie

Ďakujeme Emi Suzuki Yoshioka pre technickú pomoc. Tiež by som chcel vyjadriť svoju úprimnú vďačnosť počet zamestnancov Osaka City University, ktorí nás podporili.

• Ploche ONE: mangiferín zmierňuje žalúdočný vred v ischémia /reperfúziou Rats: Zapojenie PPAR-y, NF-kB a Nrf2 /HO-1 signálnych dráh
• Ploche ONE: Nie Association of Coffee spotrebe žalúdočného vredu, vredu dvanástnika, refluxná ezofagitída, a non-erozívnou refluxnej choroby: priečny rez Štúdia 8,013 zdravých jedincov v J…