PLoS ONE: Aukštos Mobilumas Grupė dėžutė 1 Slopina skrandžio opos gydymas per Toll-tipo receptorių 4 ir receptorius Išplėstinė Glycation End Products

Anotacija

Aukštos mobilumo grupė dėžutė 1 (HMGB1) iš pradžių buvo atrasta kaip branduolinės baltymas, kuris sąveikauja su DNR kaip chromatino-susijęs ne-Histonas baltymų stabilizuoti nukleosoma ir reguliuoti daug genų atomo branduolyje transkripciją. Kai nutekėjo ar aktyviai išskiriamas į tarpląstelinio aplinkoje, HMGB1 aktyvina uždegiminių kelius stimuliuoja kelis receptorių, įskaitant Toll-kaip receptorių (TLR) 2, TLR4, ir receptoriaus pažengusiems glycation galutinių produktų (RAGE), todėl audinių traumos. Nors HMGB1 gebėjimas sukelti uždegimą buvo gerai dokumentuota, jokių tyrimai nagrinėjo HMGB1 vaidmenį žaizdų gijimą virškinimo srityje. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti HMGB1 ir jo receptorių vaidmenį skrandžio opų gijimui. Mes taip pat tyrė, kokia receptorių tarp TLR2, TLR4 arba RAGE tarpininkauja HMGB1 anketa poveikį opoms. Skrandžio opos buvo sukeltos serosal taikymo acto rūgštimi pelių ir skrandžio audiniai buvo apdorojami tolesnio vertinimo. Iš opalige indukcija padidino imunohistocheminės dažymas citoplazmos HMGB1 ir padidėjęs serumo HMGB1 lygiais. Opa dydis, myeloperoxidase (MPO) veikla, o naviko nekrozės faktoriaus alfa išraiška (TNF) iRNR pasiekė apie 4 diena pilvaplėvės ertmę HMGB1 atidėtas opų gydymo ir padidėjusi MPO veiklą ir NNF išraiška. Priešingai, administravimas anti-HMGB1 antikūnų skatina opų gijimą ir sumažinti MPO veiklą ir NNF išraiška. TLR4 ir RAGE trūkumas sustiprintas opos gydymas ir sumažino TNF lygį, o opos gydymas ir TLR2 nokautas (ko) pelėms buvo panašus į tą, laukinio tipo pelėms. Be TLR4 KO ir RAGE KO pelių egzogeninė HMGB1 neturėjo įtakos opų gijimą ir NNF išraiška. Taigi, mes parodė, kad HMGB1 yra apsunkina skrandžio opa gijimo procesą, kuris veikia per TLR4 ir RAGE sukelti pernelyg didelio uždegimo atsaką.

nurodomoji dalis: Nadatani Y Watanabe T Tanigawa T Ohkawa F "Takeda" S Higashimori A et al., (2013) Aukštos Mobilumas Grupė 1 langelis slopina skrandžio opos gydymas per Toll-tipo receptorių 4 ir receptorių Pažangiosios Glycation galutiniams produktams gaminti. PLoS ONE 8 (11): e80130. Doi: 10,1371 /journal.pone.0080130

redaktorius: Motiejus Chamaillard, INSERM, Prancūzija

Įstojo: Gegužės 29, 2013; Priimta rugsėjo 30, 2013 m Paskelbta 11 Lapkričio 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Nadatani et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų. Kenji Watanabe - Grantas /Moksliniai tyrimai parama Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation "," Abbott Japonijos Co., LTD .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation "; Kalbėjimo ir mokymas: Abbott Japan Co, Ltd ". Yasuhiro Fujiwara - Partnerio ir mokymas: Eisai Co Ltd "Tetsuo Arakawa - patariamieji komitetai arba peržiūrėti Panels: Eisai Co Ltd", Otsuka Pharmaceutical Co Ltd kiti autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja. Tai nekeičia autorių laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Aukštos mobilumo grupė dėžutė baltymas 1 (HMGB1), iš dideliai narys mobilumo grupė baltymų superšeimai, yra branduolinė baltymų [1]. HMGB1 sąveikauja su DNR kaip chromatino-susijęs nonhistone baltymų stabilizuoti nukleosoma ir reguliuoti daug genų transkripciją į [2] branduolio. Kai per nekrotinio ląstelių mirtis nutekėjo iš ląstelių [3] arba aktyviai išskiriamas į tarpląstelinio aplinkai monocitų ir makrofagų [3,4], HMGB1 veikia kaip alarmin su stipriais prouždegiminių savybių [5].

geriausiai mokėsi HMGB1 receptoriai yra Toll-tipo receptorius (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9] ir receptorius Išplėstinė glycation galutinių produktų (RAGE) [6,8]. TLR2 ir TLR4 nariai TLR šeima, ir jie atlieka labai svarbų vaidmenį įgimto imuniteto atsaką į patogenais susijęs molekulinės modelius ir žalą, susijusių molekulinės modelio molekulių [10]. TLR2 visų pirma pripažįsta komponentus gramteigiamų bakterijų ląstelės sienelės, ir TLR4 visų pirma pripažįsta lipopolisacharido kiekis, kuris yra pagrindinė ląstelių sienelės komponento, gram-neigiamų bakterijų. Paleidimo TLR2 ir TLR4 signalizacijos kelius veda prie branduolinių faktoriaus κB (NF-κB) aktyvavimo, per aksesuaras baltymų MyD88, o vėliau reguliavimas imuninių ir uždegiminių genų, įskaitant uždegiminių citokinų, tokių kaip naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNF), su iš mitogenu aktyvinto proteino kinazės [11-13] aktyvacijos. Receptorių pažengusiems glycation galutinių produktų (RAGE) yra multi-ligando receptorius, siejamas su imunoglobulino superfamily [14]. Kiti žinomi Pyktis ligandų yra amiloido [15], ir S100 [16]. Keli eksperimentai parodė, kad ligando-RAGE sąveika taip pat aktyvuoja NF-κB ir mitogenas aktyvuota proteinkinazes [17-20].

Daugelis patologinės būklės, yra susiję su priešuždegiminiais savybių HMGB1. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad HMGB1 vaidina lemiamą vaidmenį endotoksemijos [21], ūminis pankreatitas [22], ūminis respiracinio distreso sindromas [23], kai autoimuninių ligų [24], smegenų išemija žalos [25], ir išemija-reperfuzijos (IR) traumų kepenų [26], širdies [27] ir inkstų [28]. Atsižvelgiant į virškinimo traktą, HMGB1 yra apsunkina eksperimentinį kolitas [29,30] ir nesteroidinis priešuždegiminis vaistas sukeltų plonųjų žarnų žalos [31].

Šiuo metu HMGB1 žaizdų gijimą vaidmuo yra neaiškus, nors jos gebėjimas sukelti uždegimą buvo gerai dokumentuota, kaip aprašyta aukščiau. Skrandžio ir žarnų srityje, joks tyrimas išnagrinėjo HMGB1 vaidmenį žaizdų gijimą. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti HMGB1 vaidmenį skrandžio opoms. Mes tyrė HMGB1 gijimo procesą vaidmenį, naudojant nustatytą eksperimentinę lėtinis skrandžio opa modelį, sukurtą graužikų iki tepant acto rūgštį iš skrandžio serosal pusėje. Modelis glaudžiai imituoja žmogaus skrandžio skrandžio opos histologiją ir morfologijos [32]. Mes taip pat tyrė, ar HMGB1 paveikia opos gydymas per TLR2, TLR4 arba RAGE.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnai

TLR2- ir TLR4-nokautas (ko) pelės, kurios iš pradžių buvo sukurtas Dr S. Akira (Osaka University, Osaka, Japonija ) ir backcrossed 8 kartus ant linija C57BL /6 fone, buvo gauti iš Rytų BIOSERVICE, Inc. (Kioto, Japonija). Rage-KO pelės, kurios buvo backcrossed ant linija C57BL /6 fone, iš pradžių buvo sukurtas ir dovana dr Y. Yamamoto (Kanazawa medicinos universitetas, Kanazawa, Japonija). Laukinio tipo C57BL /6 pelėms buvo įsigytas iš Charles River Japonijoje, Inc. "(Atsugi, Japonija), kaip kontrolės padermę TLR2 KO, TLR4 KO, ir RAGE KO pelių. buvo naudojami specifiniai patogenais neužkrėsti 12 savaičių amžiaus vyriškos lyties gyvūnai. Visi gyvūnai buvo laikomi polikarbonato narvuose su popieriaus drožlių kraikas. Narveliai buvo įsikūręs oro kondicionieriumi biologinio pavojaus kambaryje su 12 h šviesos ir tamsos ciklo. Visi eksperimentiniai procedūras patvirtino Gyvūnų priežiūros komiteto Osaka City University Graduate School of Medicine (leidimo numeris: 11006). Visos operacijos buvo atliktos pagal izofluranas ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų.

Eksperimentinis indukcija opa

Skrandžio opa buvo sukeltas pagal aprašytą metodą detaliai kitur [33], su nedideliais pakeitimais , Trumpai tariant, pagal eterio anesteziją, gyvūnų abdomens buvo įpjauti ir skrandis buvo veikiami. Polipropileno vamzdis (4 mm skersmens) buvo patalpintas prieš serosal pusės į skrandį. 80-pL alikvotinė dalis 60% acto rūgšties buvo įtraukta į vamzdžio, kuris buvo laikomi liečiasi su serosal paviršiaus 30 s. Po to, kai nedelsiant pašalinti acto rūgštį iš vamzdžio aspiracijos, skrandžio buvo grąžintas į pradinę padėtį, ir pilvo dalis buvo baigta. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad skrandžio opa dydis pasiekė maksimumą apie 3 ar 4 diena po opa indukcijos, o vėliau jis palaipsniui mažėjo [32,34]. Gijimo metu eksperimentinės skrandžio opa prasideda 4 dieną po opa indukcijos

eksperimentines grupes

Jei ištirti egzogeninės HMGB1 poveikį, pelėms į pilvo ertmę injekcijų žmogaus rekombinantinio HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 mikrogramų /kg kūno svorio; Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO) arba transporto priemonė (fosfato buferinis fiziologinis) du kartus per parą, pradedant nuo 4 dienas po opa indukcijos (nuo 4 dienos 9 dieną).

Be to, iš immunoneutralization HMGB1 skrandžio opų gydymo poveikis buvo įvertintas. Pelių buvo pilvaplėvę vartojamas neutralizuojančių vištienos anti-HMGB1 polikloninis antikūnas (5 mg /kg kūno svorio; Shino bandymų Corporation ", Tokijas, Japonija) arba normalus vištienos IgY (5 mg /kg kūno svorio; Sigma-Aldrich Co) pradeda praėjus 4 dienoms po opa indukcijos ( iš 4-ąją dieną 9 dieną). Be to, siekiant patvirtinti išleidimo kurio HMGB1 inhibitorių poveikį, etilo piruvato ar transporto priemone buvo suleistas du kartus per parą, pradedant nuo 4 dieną po opa indukcija.

Be to, siekiant nustatyti receptorių, atsakingą už HMGB1 susijusių skrandžio opa gijimą, skrandžio opos buvo sukeltas TLR2 KO, TLR4 KO, ir RAGE KO pelių su arba be injekciją į pilvą apsaugai rHMGB1 1000 mikrogramų /kg du kartus per parą pradžioje 4-tą dieną po opa indukcija.

skrandžio buvo pašalintas ir opa dydis buvo matuojamas 6 arba 9 dieną po to, kai opa indukcijos. Opa dydis buvo išreikšta opa indeksas, didžiausio ilgio ir minimalaus ilgio produkto (pvz maksimalus ilgis buvo padaugintas iš minimalios trukmės). Tyrimai buvo atliekami naudojant 4-8 mėginius. Skrandžio audinio mėginiai buvo apdorojami tolesnio vertinimo.

iRNR raiška uždegimo mediatorių skrandžio audinių nustatomam realaus laiko kiekybine atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (AT-PGR)

Real- laiko kiekybine RT-PGR buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [35]. Trumpai tariant, iš viso RNR buvo išskirta iš žarnyno audinių naudojant ISOGEN rinkinį (Nippon Gene Co, Ltd, Tokijas, Japonija) pagal gamintojo protokolą. Papildoma DNR buvo įsigyta naudojant didelės talpos RNR į kDNR Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) pagal gamintojo protokolą. Realaus laiko kiekybine PGR tyrimai buvo atliekami naudojant Applied Biosystems 7500 Greitas Realaus laiko PGR sistema ir programinė įranga (Life Technologies Corporation). Reakcijos mišinys paruoštas pagal gamintojo protokolą naudojant TaqMan Greitas Universalus PCR Master mišinys (Life Technologies Corporation). Cikliškas kaitinimas sąlygos buvo taip: 45 ciklų amplifikacijos ne mažesnis nei 95 ° C temperatūroje 15 S ir 60 ° C temperatūroje 1 min. Bendras RNR buvo atliktas realaus laiko kiekybine RT-PGR metodu dėl tikslinių genų, naudojant TaqMan gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės kontrolės reagentus matavimo (Life Technologies Corporation), kurios buvo naudojamos kaip vidinio etalono. MRNR, koduojanti HMGB1 išraiška, TLR4, RAGE, kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), interleukino-1-beta (IL-1β), ir TNF į opą ir įprastomis skrandžio audinių buvo įvertintas naudojant realaus laiko RT-PGR ir standartizuotas iki gliceraldehid -3-fosfato dehidrogenazės iRNR lygiui. Kiekvieno mRNR išraiška yra nurodyta kaip santykis, lyginant su vidutinės vertės, normalaus skrandžio audinio. Naudojamos RT-PCR pradmenys ir zondai parodyta 1 lentelėje
Gene
Gruntas ir zondo
TNF-αPrimer (pirmyn) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Į priekį) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Į priekį) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Į priekį) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (reversas) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-Tamra-3'TLR4Primer (pirmyn) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Į priekį) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (reversas) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-Tamra-3'VEGFPrimer (pirmyn) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (reversas) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-Tamra-3'Table 1. gruntai ir zondai.
CSV Atsisiųsti CSV

Imunohistocheminiais ir imunofluorescenciniam

Audinių mėginiai buvo fiksuotas 0,1 M fosfatinio buferio (pH 7,4), kuriame yra 4% paraformaldehidas. Mėginiai buvo įdėta į parafiną, ir serijos 5-mkm storio sekcijos buvo montuojamas ant silanized skaidres (DaKo, Tokijas, Japonija). Bandiniai buvo panardinti į 3% H _{2O 2 tirpalo absoliučiame metanolį, 5 min tam, kad slopinti endogeninio peroksidazės aktyvumo ir tada inkubuojami 5% lieso pieno 10 min. Hematoksilinu ir eozinas dažymo buvo atlikta morfologinių pastabas. Triušis monokloninis anti-HMGB1 antikūnas (praskiestas 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) buvo taikomas kaip pirminės antikūno ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje su mėginiais. Antrinis antikūnas (Histofine Paprasta Dėmių MAX peroksidazės komplektas; Nichirei biomokslai Inc, Tokijas, Japonija) buvo inkubuojama su egzempliorių 1 h pagal gamintojo instrukcijas. Reaktyvumas buvo regimos gydyti skyrius su Histofine Simple dėmių ir diaminobenzidinas tirpalo (Nichirei biomokslai Inc.). Tada bandiniai buvo counterstained hematoksilinu. Kitą, TLR2, TLR4 ir RAGE išraiška buvo nustatomas pagal imunofluorescencinis metodu. Naudojami imunofluorescenciniam pirminiai antikūnai įtraukta pelės monokloninis antikūnas prieš TLR2 (praskiestas 1: 200; Abcam), pelės monokloninis antikūnas prieš TLR4 (praskiestas 1: 200; Abcam), ir žiurkė monokloniniai antikūnai prieš RAGE (santykiu 1: 250; Abcam). Audinio mėginiai, kurie buvo paruošti, kaip aprašyta aukščiau, buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje su pirminių antikūnų ir po to reaguoja su atitinkamomis liuminescencinių dažų-konjuguoto antrinių antikūnų (Abcam) 2 h. Mėginiai buvo ištirti su mikroskopas įrengta argono ir argono-kriptono lazeriniuose šaltinių.}

Matavimas Serumas HMGB1 lygiai

Kraujo (1000 pl) mėginiai buvo imami kraujo serume selektyvinius vamzdžių iki širdies punkciją. Po to, kai centrifuguojant 3000 apsisukimų per minutę 10 min, serume buvo kaupiami ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Serume HMGB1 buvo matuojamas naudojant HMGB1 daugiasluoksnis ELISA rinkinys (Shino bandymų Corporation) pagal gamintojo protokolą.

Matavimas Myeloperoxidase (MPO) Veiklos

metodų, naudojamų išmatuoti MPO veikla yra išsamiai aprašyti kitur [36]. Trumpai tariant, mėginiai buvo homogenizuoti 50 mM kalio fosfato buferio (pH 6,0), kuriame yra 0,5% heksadeciltrimetilamonio bromido (Sigma Chemical Co.). Suspensijos buvo centrifuguojamas, ir MPO veikla gautame supernatanto buvo tirta su spektrofotometru. Vienas vienetas MPO veiklos buvo apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris zdegradowanych 1 mkmol peroksido /min, esant 25 ° C temperatūroje. Rezultatai yra išreikšti kaip vienetai grame skrandžio audinio.

Statistinė analizė

Vertybės yra išreiškiamas kaip vidurkis ± standartinė paklaida vidurkio (SEM). Vienpusis dispersinė analizė (ANOVA) buvo naudojama patikrinti tų skirtumų reikšmę tarp gydymo grupėje reiškia, o rezultatai buvo analizuojami su Fišerio saugomos mažiausiai reikšmingas Diferencijuotas testą. P-masė yra mažesnė 0,05 buvo laikomi statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Laikas kursas Skrandžio opos gydymas

Jei įvertinti gijimo procesą skrandžio opos, eksperimentinė skrandžio opa, buvo sukeltas tepant acto rūgštį iš skrandžio serosal pusėje , Kad opos buvo įvertintas mikroskopu (pav 1A, 1B) ir makroskopiškai. Iš opos dydis pasiekė maksimalų 4 dieną ir mažėjo kada vėliau (1c pav). MPO veikla (1D pav) ir TNF (1E pav) ir IL-1β (pav 1e) mRNR ekspresija opą skrandžio audiniuose taip pat pasiekė 4-tą dieną, ir jų lygis buvo didesnis opą audinyje nei skrandžio audinio visoje nagrinėjamuoju laikotarpiu. Išopėjimas taip pat padidėjusi VEGF mRNR (1F paveikslas) išraiška.

HMGB1 išraiška po išopėjimas

Kitas įvertinta, ar HMGB1 dalyvavo skrandžio opoms. HMGB1 iRNR lygiai skrandžio audinyje (2a pav) ir serume HMGB1 (2b pav) pasiekė savo maksimumą esant dieną 4. HMGB1 iRNR kiekis buvo beveik pastovus per nagrinėjimo laikotarpį, o serume HMGB1 sumažėjo iki normalaus lygio 6 dienų po iš opa indukcija. Immunohistochemically, išopėjimas sukeltas svarbų citoplazmos dažymas HMGB1 į epitelio ląsteles, ypač sužeisti srityse (pav 2c, 2d). Priešingai, intaktiniame skrandžio gleivinės, HMGB1 lokalizacijos buvo tik į vidų epitelinės ląstelės (2e pav) branduolių.

Efektai egzogeninių HMGB1, HMGB1 Immunoneutralization ir slopinimas HMGB1 spaudai skrandžio opos gydymas

iRNR raiška ir MPO veikla buvo įvertintas 6 dieną, o opa puslapis buvo įvertintas 9 dieną, pagal laikui bėgant tyrimas. Pelių buvo skiriami rHMGB1 ar anti-HMGB1 antikūnas į pilvo ertmę po to, kai opa indukcijos. Administracija rHMGB1 esant arba 100 mikrogramų /kg kūno svorio arba 1000 mg /kg, reikšmingai slopino skrandžio opoms (3a paveikslas), kuris buvo susijęs su padidėjusiu MPO veiklos (3b pav) ir TNF iRNR išraiškos Pūžņojošs audinių (3c pav) dozę. Priešingai, HMGB1 neutralizuojančių antikūnų skatinama opos gydymas (4A pav) riboto MPO veikla (4b paveikslas) ir TNF iRNR išraiškos (4c pav). Apsunkina poveikis egzogeninės rHMGB1 skrandžio opų gydymo buvo atšauktas kartu vartojamas anti-HMGB1 antikūnų (4F pav.) Išraiška VEGF mRNR nebuvo paveikti gydant abiejų rHMGB1 (3D figūra, 3E) arba Anti-HMGB1 antikūnų (pav 4D, 4E). Esant normaliai skrandžio audinio, administravimas rHMGB1 ar anti-HMGB1 taip pat neturėjo jokio poveikio citokinų išraiškos ar MPO veiklos (duomenys neparodyti). Be to, etilo piruvato, An HMGB1 išleidimo inhibitorių administravimas, gerokai paaukštintas opos gydymas, palyginti su transporto priemonės gydymą. Gydymas buvo lydi TNF iRNR išraiškos slopinimo (duomenys neparodyti).

vaidmuo TLR2, TLR4 ir RAGE skrandžio opos gydymas

ištirti, ar TLR2, TLR4 ir RAGE prisidėti į HMGB1 tarpininkaujant skrandžio opoms, eksperimentiniai skrandžio opos buvo sukeltas TLR2 KO, TLR4 KO, Rage KO, ir kontrolės laukinio tipo pelėms. TLR4 ir RAGE trūkumas skatina skrandžio opa formavimas ir užkirto kelią į TNF iRNR išraiškos padidėjimą po opų, o TLR2 trūkumas paveikė nei opa indeksą, nei su TNF mRNR (Paveikslas 5A, 5B) išraiška. Administracija egzogeninės HMGB1 įtakos nei opa indeksą, nei su TNF mRNR išraišką arba TLR4 KO ar RAGE KO pelėms (pav 5C-5F). Administracija egzogeninės HMGB1, tačiau atidėtas opos gydymas laukinio tipo pelių ir sumažinti TNF iRNR raiška (3 paveikslas).

išraiška TLR2, TLR4 ir rage per Skrandžio opos gydymas

Kitas tiriamas iRNR raiška ir reaktyvumas iš TLR2, TLR4 ir Pyktis laukinio tipo pelėms. buvo stebimas reikšmingas iki-reguliavimas TLR2 iRNR po opos (6a pav) indukcija. TLR2 reaktyvumas buvo stebimas daugiausia uždegiminių ląstelių (6b pav.) Iš TLR4 mRNR ekspresijos nebuvo paveikti opalige indukcijos (6c pav.) TLR4 reaktyvumas buvo pastebėtas viršūninio dalis epitelio gleivine ties opa krašto ir kai kuriose uždegiminių ląstelių opa lova (6d pav.)

buvo pastebėtas 9 dieną Nemaža iki reguliavimas Rage iRNR po iš opa indukcinės (6E pav.) RAGE reaktyvumas buvo stebimas daugiausia uždegiminių ląstelių ties opos lovos krašto ir kraujagyslių endotelio ląstelės membranos (6F pav.)

Dažymo ir opą audinio nuo TLR4 KO ar RAGE KO pelių su anti-TLR4 antikūnų ar anti-RAGE antikūnų, atitinkamai, neatskleidė jokių teigiamus signalus, patvirtinantis šių antikūnų specifiškumas (nerodomas duomenys).

Diskusijos

Šiame tyrime mes parodė, kad egzogeniniai HMGB1 vėlavimų skrandžio opos gydymas, o paskatinti NNF išraišką ir MPO veiklą. Priešingai, immunoneutralization HMGB1 ar slopina HMGB1 spaudai skatina opų gijimą, kartu mažinant NNF išraišką ir MPO veiklą. Be to, TLR4 ir RAGE trūkumas skatina opų gijimą, ir egzogeninė HMGB1 nepavyksta atidėti opos gydymas TLR4 KS ir RAGE KO pelių. Šie rezultatai rodo, kad HMGB1 yra apsunkina skrandžio opoms, kad veikia per TLR4- ir RAGE priklauso nuo kelių. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita paaiškinti HMGB1 vaidmenį žaizdų gijimą per virškinimo traktą.

Keletas tyrimų kreipėsi į HMGB1 vaidmenį žaizdų gijimo, išskyrus virškinimo trakto organų, tačiau šių tyrimų rezultatai prieštaringi [37-40]. Suderinamas su mūsų rezultatus, kai kurie tyrimai parodė, kad HMGB1 turi slopina žaizdų gijimą [37,38]. Zhang ir kt. parodė, kad HMGB1 susilpnina pjūvis žaizdų gijimą mažinant restoratyvinę kolageno nusėdimo per RAGE [37]. Goova ir kt. parodė, kad blokuoja Pyktis ligandų, pavyzdžiui, amžių ir HMGB1 naudojant tirpią formą receptorius amžius (sRAGE), greitina opų gijimą ir slopina uždegiminių citokinų [38] lygį. Ankstesni tyrimai parodė, kad per didelis uždegimas pablogėjęs žaizdų gijimą. Pavyzdžiui, mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad TNF per saviraiškos ir pernelyg neutrofilų infiltracija yra apsunkina veiksnius formavimo ir gijimą skrandžio opa [41]. Be to, kitoje audinių remonto, Goren et al modelį. parodė, kad per didelis neutrofilų ir makrofagų infiltracija TNF per išraiškos slopina pelių odos traumų gijimą [42]. Tokiu būdu, ji yra įmanoma, kad HMGB1 pailgina skrandžio opos gydymas per TNF-alfa sukėlė uždegimo reakcijas.

Priešingai, kai in vitro tyrimai parodė, kad HMGB1 ir jo receptoriai yra būtini žaizdų gijimą [39,40]. Staraino ir kt. parodė, kad HMGB1 pagreitina žaizdų gijimą ir regeneraciją didinant odos fibroblastų ir keratinocitų [39] migracija. HMGB1 taip pat skatina žaizdų gijimą 3T3 fibroblastų stimuliuoja ląstelių proliferaciją ir migraciją per madingam /tarpląstelinio signalo reguliuojamas kinazės keliu [40] aktyvacijos. Kadangi šių in vitro tyrimai buvo atlikti uždegiminių ląstelių negauta, eksperimentiniais metodais skirtumai gali sukelti nenuoseklių išvadas dėl HMGB1 vaidmenį žaizdų gijimą.

VEGF, stiprus angiogeninis augimo faktoriaus, vaidina svarbų vaidmuo skrandžio opų gydymo [43,44]. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad HMGB1 gali sukelti VEGF išraišką kelių audinių ir gyvūnų modelių [45-47]. Tačiau šiame tyrime, nei rHMGB1 nei prieš HMGB1 antikūnai įtakos VEGF išraišką opinį audinio. Dėl tarp mūsų išvadomis ir tų ankstesnių tyrėjų skirtumų priežastis nėra aiški, tačiau ji gali būti susijęs su įvairių organų ir eksperimentiniais modeliais ir naudojimą.

Yra 2 galimi šaltiniai tarpląstelinio HMGB1: pasyvus išsiskyrimas iš nudžiūvusiuose ląstelių [48] ir aktyvios sekrecijos nuo uždegimo [5] ląsteles. Šiame tyrime, HMGB1 reaktyvumas buvo pastebėtas į citoplazmą, taip pat branduolio, tai rodo, kad nekroziniai ląstelės yra HMGB1 šaltinis. per opų gydymo skrandžio HMGB1 iRNR kiekis padidėjo, rodo, kad uždegimo ląstelės gamina ir atleiskite HMGB1. Bendrai apie HMGB1 serume aukštis lėmė lėmė pasyvų paleidimo iš sužalotų ląstelių esant skrandžio opa ir aktyvi sekrecija iš uždegiminių ląstelių.

Serumo HMGB1 kiekis padidėjo po to, skrandžio opa indukcijos bet sumažėjo bent pabaigoje etapo gijimą, nors HMGB1 ir TNF išraiška išliko aukštas. Šie duomenys kelti sisteminę HMGB1 sugaudymo sistemoje, galimybę. Siekiant šio tikslo, buvo nurodyta, ar HMGB1 privalomu baltymų buvimą. Trombomodulinas, ląstelių paviršius glikoproteinas, yra vienas pavyzdys HMGB1 privalomu baltymų. Rekombinantinis žmogaus tirpus trombomodulinas slopino plazmos HMGB1 sukeltos lipopolisacharidų į žiurkių modelį [49] ir saistomas HMGB1 per savo lėktino domeno [50], kad būtų išvengta HMGB1 iš bendrauja su kitais receptoriais [51] padidėjimą. Klinikinių paraiškų, trombomodulinas, yra taip pat naudinga į HMGB1 susijusių ligų ir sąlygų, tokių kaip sepsis, nes jos anti-HMGB1 savybių [52]. sRAGE, rasti kraujotakos, yra dar vienas, kurio HMGB1 IGF pavyzdys. sRAGE yra tirpus forma RAGE; jis veikia kaip masalui išvengti sąveikos tarp ląstelės paviršiaus pyktis ir jo ligandų, pavyzdžiui HMGB1 [53]. Šiame tyrime, tokios spąstais sistemos taip pat gali atlikti apsauginį vaidmenį užkertant kelią uždegimui plisti, taip skatinant opos gydymas.

Tai žinoma, kad daugelis pepsinės opos pacientai užsikrėtę Helicobacter pylori
. Nors šiame tyrime mes ne ištirti HMGB1 vaidmenį skrandžio opos gydymas užsikrėtusių H pelių. pylori
, klinikiniai ir eksperimentiniai tyrimai rodo, kad žalingas poveikis HMGB1 skrandžio opoms būtų ryškesnis pacientams su H. Helicobacter pylori infekcija
nei tie, ir be jo. Mes anksčiau parodė, kad H. pylori
infekcija padidina neutrofilų infiltraciją į opą audinių mongolų smiltpelėms [54]. Shimizu ir kt. Taip pat parodė, kad neutrofilų ir makrofagų įsiskverbti opos maržas į aukštesnį laipsnį pacientai su H. Helicobacter pylori infekcija
nei tiems, kurie neturi infekcijos [55]. Daug HMGB1 Todėl, tikėtina, esančių opą audinio užsikrėtę H. pylori
, nes ji būtų išskiriami šių uždegiminių ląstelių. Be to, Radin ir kt. Pranešama, kad Vaca, pagrindinis virulentiškumo faktorius šio organizmo, sukelia užprogramuotą nekrozę skrandžio epitelinių ląstelių ir vėliau išleisti HMGB1 [56]. Taigi, mes tikimės, kad HMGB1 žalingas nuo opų gijimą būtų ryškesni H. pylori
-infected pacientus.

TLR2, TLR4 ir RAGE, kuris tarpininkauja prouždegiminių atsakymus, dažniausiai žinomi HMGB1 receptoriams. Mūsų rezultatai aiškiai parodė, kad TLR4 ir RAGE žaisti lemiamus vaidmenis skrandžio opoms. Šis rezultatas yra suderinamas su ankstesnėmis išvadomis dėl uždegiminių reakcijų, kurias sukelia HMGB1. Vienas iš labiausiai pripažintų modelių, susijusių su tarp HMGB1 ir šių receptorių sąveika yra I-R žalos. Kepenų Aš-R traumos, TLR4 trūkumas pelių eksponuojami mažiau kepenų Aš-R žalą; Į TLR4 trūkumas pelių žala nebuvo paveikti rHMGB1 ar anti-HMGB1 antikūnų [26]. Be to, blokuoja RAGE apsaugoti nuo kepenų mirties bei nekrozė kepenų Aš-R žalos modelį [57]. , Širdies I-R traumos modelį, Andrassy ir kt. parodė, kad RAGE trūkumas pelių rodoma tik šiek tiek uždegimo gautą iš širdies aš-R žalos; uždegimas nebuvo įtakos rHMGB1 [27] indukcija. Šie rezultatai rodo, kad TLR4-HMGB1 ir pyktis-HMGB1 sąveika vaidina lemiamą vaidmenį I-R traumos, nors tai būtina atsižvelgti į kiekvieno organo skirtumus. Kita nustatyta modelis yra sisteminio uždegimo, pavyzdžiui, sepsis [5,8,58]. Be eksperimentinio modelio pilvo sepsis, Susa et al., parodė, kad HMGB1-RAGE sąveika buvo glaudžiai susijusi su sepsio sukeltas diafragmos disfunkcija [58]. In vivo sisteminio uždegimo modelio generuoja injekcijos egzogeninės HMGB1, Zoelen ir kt. parodė, kad HMGB1 skatina citokinų išsiskyrimą, aktyvavimo koaguliacija, ir neutrofilų įdarbinimo per TLR4 ir RAGE [8]. Taigi, TLR4 ir RAGE vaidina svarbų vaidmenų patogenezės tarpininkaujant HMGB1 susijęs keliu, įskaitant mūsų opos gydymas modelio keliu.

Mūsų rezultatai rodo, kad TLR2 neturi ryšio su skrandžio opų gydymo opos gydymas TLR2 KO pelių priminė, kad laukinio tipo pelėms. Nors in vitro tyrimai, naudojant makrofagų ląstelių linijas nurodė, kad TLR2-HMGB1 kelias skatina uždegimines atsakymus [6,9], nebuvo pranešta vivo poveikis TLR2 į HMGB1 tarpininkaujant patologijų. Taigi, remiantis ankstesniais [8] išvadas ir mūsų rezultatus, HMGB1-TLR2 kelias gali vaidinti antraeilį vaidmenį remontu ir patogenezė audinių traumų ir uždegimas.

Taigi, mes parodė, kad HMGB1 yra apsunkina gijimo procesą skrandžio opa, taip pat nuo kitų patologinių būklių. Be to, mes parodėme, kad HMGB1 slopina opos gydymas taikant mechanizmą, įtraukia TLR4 Rage ir pernelyg didelio uždegimo atsaką. Nors protonų pomp inhibitoriai paprastai yra nustatytas skrandžio opos, sunkiai valdomi opos, vis dar kelia klinikinį problemą. Mūsų dabartinis tyrimas parodė naują koncepciją neišsprendžiamų skrandžio opoms gydyti, be to protonų pomp inhibitorių terapija.

Padėka

Mes dėkojame Emi Suzuki Yoshioka techninei pagalbai. Taip pat norėčiau išreikšti nuoširdžią padėką darbuotojų nariais Osaka City University, kurie mus palaiko.

• PLoS ONE: Mangiferin sumažina skrandžio opos Išemija /reperfuzija Rats: dalyvavimas PPAR-gama, NF-κB ir Nrf2 /HO-1 signalinė kelius
• PLoS ONE: Nėra asociacija kavos vartojimas su skrandžio opa, dvylikapirštės žarnos opa, refliuksas ir ne erozinis refliukso liga: skerspjūvio tyrimas 8,013 sveikų Japonijoje