PLoS ONE: High-Mobility Group Box 1 Estää mahahaavan Healing kautta Toll-kaltainen reseptori 4 ja Reseptori pitkälle Glycation End Products

tiivistelmä

Korkea liikkuvuusryhmän box 1 (HMGB1) oli alun perin löydettiin Ydinvoimalaitoksen proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa DNA kromatiinin liittyvä ei-histoni proteiinin vakauttamiseksi nukleosomeihin ja säätelemään monien geenien transkription tumassa. Kun vuotanut tai aktiivisesti erittyy solunulkoiseen ympäristöön, HMGB1 aktivoi tulehduksellinen reittejä stimuloimalla useita reseptoreita, kuten Toll-kaltainen reseptori (TLR) 2, TLR4, ja reseptori glykaation lopputuotteiden (RAGE), mikä johtaa kudosvaurioita. Vaikka HMGB1 kyky aiheuttaa tulehdusta on hyvin dokumentoitu, eikä tutkimuksissa on tarkasteltu roolia HMGB1 haavan paranemiseen maha kenttään. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida roolia HMGB1 ja sen reseptorien paranemista mahahaavan. Tutkimme myös mikä reseptori keskuudessa TLR2, TLR4 tai RAGE välittää HMGB1 vaikutuksista haavojen paranemiseen. Mahahaavan indusoitiin herakalvon soveltaminen etikkahappoa hiirillä, ja mahalaukun kudoksia käsiteltiin lisäarviointia. Induktio haavauma lisäsi immunohistokemiallisella värjäyksellä sytoplasmisen HMGB1 ja seerumin HMGB1 tasoilla. Haavauma koko, myeloperoksidaasi (MPO) aktiivisuus, ja ilmentyminen tuumorinekroositekijä α (TNFa) mRNA saavutti päivänä 4. intraperitoneaalisesti HMGB1 viivästyneen haavan paranemisessa ja koholla MPO toimintaa ja TNFa ilme. Sen sijaan hallinnon anti-HMGB1 vasta-edistänyt haavojen paranemiseen ja vähentää MPO aktiivisuus ja TNFa ilme. TLR4 ja RAGE puutos parannettu haavauman paranemista ja vähentää taso TNFa, kun taas haavojen paranemiseen vuonna TLR2 Knockout (KO) hiirillä oli samanlainen kuin villityypin hiirillä. Vuonna TLR4 KO ja RAGE KO hiiret, ulkoiset HMGB1 ei vaikuttanut haavauman paranemista ja TNFa ilme. Näin osoitimme, että HMGB1 on vaikeuttava tekijä on mahahaava paranemista, joka toimii kautta TLR4 ja RAGE aiheuttaa liiallista tulehdusreaktioita.

Citation: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) High-Mobility Group Box 1 Estää mahahaavan Healing kautta Toll-kaltainen reseptori 4 ja reseptori glykaation lopputuotteisiin. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10,1371 /journal.pone.0080130

Editor: Mathias CHAMAILLARD, INSERM, Ranska

vastaanotettu: toukokuu 29, 2013; Hyväksytty: 30 syyskuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Kenji Watanabe - Grant /Research Support päässä Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Puhuminen ja opetus: Abbott Japan Co., LTD. Yasuhiro Fujiwara - puhuminen ja opetus: Eisai Co. Ltd Tetsuo Arakawa - neuvottelukunnat tai Review Paneelit: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Muut kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Korkea liikkuvuusryhmän box proteiini 1 (HMGB1), jäsen korkea- liikkuvuusryhmän proteiini superperheen, on ydinvoima proteiini [1]. HMGB1 vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa, kuten kromatiinin liittyvä nonhistone proteiinin vakauttamiseksi nukleosomeihin ja säätelemään monien geenien transkription tumassa [2]. Kun vuotanut solusta aikana nekroottisen solukuoleman [3] tai aktiivisesti erittyy solunulkoiseen ympäristöön monosyytit ja makrofagit [3,4], HMGB1 toimii alarmin, jolla on voimakas tulehdusta edistäviä ominaisuuksia [5].

Paras tutkittu HMGB1 reseptorit ovat Toll-kaltainen reseptori (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], ja reseptori glykaation lopputuotteiden (RAGE) [6,8]. TLR2 ja TLR4 ovat jäseniä TLR perheen, ja niillä on ratkaiseva rooli synnynnäisen immuunivasteen taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuvioita ja vaurioita liittyvä molekyyli kuvio molekyylejä [10]. TLR2 ensisijaisesti tunnistaa komponentit gram-positiivisten bakteerien soluseinä, ja TLR4 ensisijaisesti tunnistaa lipopolysakkaridi, joka on merkittävä soluseinän komponenttia gram-negatiivisten bakteerien. Laukaisu TLR2 ja TLR4 signalointireittejä johtaa aktivoitumiseen Nukleaaritekijä KB (NF-KB) kautta lisälaite proteiini MyD88, ja myöhemmin sääntelyn immuunijärjestelmän ja tulehduksellisten geenien, mukaan lukien tulehduksellisten sytokiinien, kuten tuumorinekroositekijä α (TNFa), jossa aktivoituminen mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien [11-13]. Reseptori pitkälle edenneen glykaation lopputuotteiden (RAGE) on monen ligandin reseptorin, joka kuuluu immunoglobuliini-superperheen [14]. Muita tunnettuja RAGE ligandeista ovat amyloidi [15] ja S100 [16]. Useita kokeita ovat ehdottaneet, että ligandi-RAGE vuorovaikutus aktivoi myös NF-KB: n ja mitogeeni-aktivoituja proteiini-kinaasien [17-20].

Monet patologisia tiloja, jotka liittyvät tulehdusta edistäviä ominaisuuksia HMGB1. Aiemmat raportit osoittivat, että HMGB1 on ratkaiseva rooli endotoksemiassa [21], akuutti haimatulehdus [22], akuutti hengitysvaikeusoireyhtymä [23], jotkut autoimmuunisairauksien [24], aivoiskemia vamma [25], ja iskemia-reperfuusio (IR) vammat maksan [26], sydän [27], ja munuaisten [28]. Mitä ruoansulatuskanavassa, HMGB1 on ongelmatekijä kokeellisen koliitin [29,30], ja steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden lääkkeen aiheuttama ohutsuolen vahinko [31].

Tällä hetkellä rooli HMGB1 haavan paranemiseen on epäselvä, vaikka sen kyky aiheuttaa tulehdusta, on hyvin dokumentoitu, kuten edellä on kuvattu. Maha kenttään, mikään tutkimus on tutkinut roolin HMGB1 haavan paranemisen. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia roolia HMGB1 mahahaava paranemista. Tutkimme roolia HMGB1 paranemista käyttämällä vakiintunutta kokeellinen krooninen mahahaavan malli luotiin jyrsijän pintakuvion etikkahappoa mahalaukun seröösisiä puolella. Malli jäljittelee läheisesti ihmisen peptinen mahahaava histologian ja morfologian [32]. Tutkimme myös, onko HMGB1 vaikuttaa haavojen paranemiseen kautta TLR2, TLR4 tai RAGE.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

TLR2- ja TLR4-pudotuspelit (KO) hiiriä, jotka oli alun perin tuotettu tohtori S. Akira (Osakan yliopisto, Osaka, Japani ) ja takaisinristeytettiin 8 kertaa päälle C57BL /6 tausta, saatiin Oriental Bioservice, Inc. (Kioto, Japani). RAGE-KO hiiriä, jotka oli takaisinristeytettiin päälle C57BL /6 tausta, alun perin tuotettu ja lahja Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japani). Villityypin C57BL /6-hiiret ostettiin Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japani), koska kontrollikantaa TLR2 KO, TLR4 KO, ja RAGE KO-hiirissä. Erityisiä patogeenittomassa 12 viikkoa vanhoja urospuolisia eläimiä käytettiin. Kaikki Eläimiä pidettiin polykarbonaattia häkeissä paperilla siru vuodevaatteet. Häkit sijaitsivat ilmastoitu tartuntavaara huone, jossa on 12 tunnin valo-pimeä sykli. Kaikki koetoimenpiteet oli hyväksynyt Animal Care komitean Osakan City University Graduate School of Medicine (Luvan numero: 11006). Kaikki leikkauksia tehtiin isofluraani, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Kokeellinen induktio haavauma

mahahaava aiheutettiin menetelmällä kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [33], pienin muutoksin . Lyhyesti, eetterianestesiassa, vatsat eläimet viillettävä ja vatsan paljastui. Polypropyleeniputkessa (4 mm: n halkaisija) asetettiin vasten herakalvon puolella vatsaan. 80 ul: n näyte 60%: ista etikkahappoa lisättiin putkeen, joka pidettiin kosketuksessa herakalvon pinta 30 s. Sen jälkeen välittömästi poiston etikkahappoa putkesta imemällä, mahan palautettiin alkuperäiseen asentoonsa, ja vatsa suljettiin. Aiemmat raportit osoittivat, että koko mahahaavan saavutti maksimin päivänä 3 tai 4 jälkeen haavauma induktion, ja sen jälkeen se vähitellen laski [32,34]. Paranemista vaihe kokeellisen mahahaavan alkaa päivänä 4 sen jälkeen, kun haava induktion.

Kokeellinen Ryhmät

vaikutuksen tutkimiseksi eksogeenisen HMGB1 hiiret saivat intraperitoneaalisesti injektoimalla ihmisen rekombinantti HMGB1 (rHMGB1; 100 -1000 ug /kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) tai vehikkeliä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos) kahdesti päivässä, alkaen 4 päivää sen jälkeen, kun haava induktion (päivästä 4 päivään 9).

Seuraavaksi vaikutus immunoneutralisaatio HMGB1 on mahahaavan paranemista arvioitiin. Hiiret intraperitoneaalisesti neutraloivat kanan anti-HMGB1 polyklonaalista vasta-ainetta (5 mg /kg; Shino-Test Corporation, Tokio, Japani) tai normaali kanan IgY (5 mg /kg, Sigma-Aldrich Co.), joka alkaa 4 päivää sen jälkeen, kun haava induktion ( päivästä 4 päivään 9). Lisäksi vahvistaa vaikutus vapautumisen estäjä HMGB1, etyyli- pyruvaattia tai ajoneuvon injektoitiin kahdesti päivässä, alkaen päivänä 4 sen jälkeen, kun haava induktion.

Lisäksi, määrittää reseptoriin vastuussa HMGB1 liittyvien mahahaava paranemista, mahahaavan indusoitiin TLR2 KO, TLR4 KO, ja RAGE KO hiirten kanssa tai ilman vatsaonteloon 1000 ug /kg rHMGB1 kahdesti päivässä alkaen päivänä 4 sen jälkeen haava induktion.

vatsa poistettiin ja haava koko mitattiin päivänä 6 tai 9 jälkeen haava induktion. Haavauma koko ilmaistiin haavauma-indeksi, tuote on maksimipituus ja minimipituus (ts maksimipituus kerrottiin vähimmäispituus). Tutkimukset suoritettiin käyttäen 4-8 näytettä. Näytteet mahalaukun kudosta käsiteltiin lisäarviointia varten.

mRNA Expression tulehdusväliaineiden mahalaukun Tissue Määritettynä Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Real- kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin suolen kudoksesta käyttämällä ISOGEN kit (Nippon Gene Co., Ltd., Tokio, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. Täydentävä DNA hankittiin käyttäen High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) valmistajan protokollaa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmän ja ohjelmiston (Life Technologies Corporation). Reaktioseos valmistettiin valmistajan protokollan avulla TaqMan Fast Universal PCR Master-seos (Life Technologies Corporation). Lämpökäsittelyyn-olosuhteet olivat seuraavat: 45 monistussykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min. Kokonais-RNA suoritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR mittaamiseen kohdegeenien käyttäen TaqMan glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin kontrollireagensseja (Life Technologies Corporation), joita käytettiin sisäisenä standardina. MRNA: n ilmentämistä, joka koodaa HMGB1, TLR4, RAGE, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), interleukiini-1-beeta (IL-1β), ja TNFa: n haavaumia ja normaaleissa mahan kudoksissa kvantitoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä ja standardoitu glyseraldehydi -3-fosfaattidehydrogenaasi mRNA-tasoja. Jokaisen näistä mRNA on merkitty suhde, suhteessa keskiarvoon normaalilta mahan kudoksessa. Alukkeet ja koettimet, joita käytetään RT-PCR on esitetty taulukossa 1.
Gene
Primer ja Probe
TNF-αPrimer (forward) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'-aluke (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Eteenpäin) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'-aluke (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Eteenpäin) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'-aluke (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Eteenpäin) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'-aluke (reverse) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (forward) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'-aluke (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Eteenpäin) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'-aluke (reverse) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (forward) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'-aluke (reverse) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. alukkeita ja koettimia.
CSV Lataa CSV

immunohistokemiallinen ja Immunofluoresenssivärjäys

kudosnäytteitä kiinnitettiin 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 7,4), joka sisälsi 4% paraformaldehydiä. Näytteet upotettiin parafiiniin, ja sarja 5-pm paksu leikkeet kiinnitettiin silanoidaan dioja (Dako, Tokio, Japani). Näytteet upotettiin liuokseen 3% H _{2O 2 absoluuttiseen metanoliin 5 min inhiboimiseksi endogeenisen peroksidaasin ja sitten inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa 10 minuuttia. Hematoksyliinillä ja eosiini-värjäys suoritettiin morfologinen havaintoja. Kanin monoklonaalista anti-HMGB1-vasta-ainetta (laimennettu 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) käytettiin primaarisena vasta-aineena ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa näytteet. Toissijainen vasta-aine (Histofine Simple Stain MAX Peroksidaasisysteemit kit; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japani) inkuboitiin näytteitä 1 h mukaan valmistajan ohjeiden. Immunoreaktiivisuus visualisoitiin käsittelemällä jaksoon Histofine Simple Stain ja diaminobentsidiini ratkaisu (Nichirei Biosciences Inc.). Sitten koekappaleet vastavärjät- hematoksyliinillä. Seuraavaksi TLR2, TLR4 ja RAGE ilmentyminen määritettiin immunofluoresenssilla menetelmällä. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään immunofluoresenssivärjäyksen sisälsi hiiren monoklonaalinen vasta-aine TLR2 (laimennettu 1: 200, Abcam), hiiren monoklonaalinen vasta-aine TLR4 (laimennettu 1: 200, Abcam) ja rotan monoklonaalinen vasta-aine RAGE (laimennettu 1: 250; Abcam). Kudosnäytteitä, jotka oli valmistettu kuten edellä on kuvattu, inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden ja saatetaan sitten reagoimaan vastaavan fluoresoivalla-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Abcam) 2 tuntia. Näytteet tutkittiin konfokaalisella mikroskoopilla varustettu argon ja argon-krypton laser lähteistä.}

mittaus Serum HMGB1 Levels

Blood (1000 ui) näytteet saatiin seeruminerotusputkiin sydänpunktiolla. Kun oli sentrifugoitu 3000 rpm: llä 10 minuutin ajan, seerumi kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Seerumin HMGB1 mitattiin käyttäen HMGB1 sandwich-ELISA-kittiä (Shino-Test Corporation) mukaan valmistajan protokollaa.

Measurement myeloperoksidaasin (MPO) Activity

menetelmät käytetään mittaamaan MPO toimintaa kuvataan yksityiskohtaisesti muualla [36]. Lyhyesti, näytteet homogenisoitiin 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,0), joka sisälsi 0,5% heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidia (Sigma Chemical Co.). Suspensiot sentrifugoitiin, ja MPO aktiivisuus saatu supernatantti määritettiin spektrofotometrillä. Yksi yksikkö MPO-aktiivisuus määritellään se määrä entsyymiä, joka hajoaa 1 umol vetyperoksidin /min 25 ° C: ssa. Tulokset ilmaistaan ​​yksiköinä per gramma mahalaukun kudosta.

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin testaamaan merkitystä erot hoitoryhmässä tarkoittaa, ja tulokset analysoitiin Fisherin suojattua pienimmän-merkitsevä-eron testiä. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

ajankulku mahahaavan Healing

arvioimiseksi paranemisprosessia mahahaavan, kokeellinen mahahaava aiheutettiin paikallisesti etikkahappoa mahan seröösisiä puolella . Haavat arvioitiin mikroskoopilla (kuvio 1A, 1 B) ja makroskooppisesti. Koko haavaumat saavutti maksimin päivänä 4 ja väheni ajan sen jälkeen (kuvio 1 C). MPO aktiivisuus (kuvio 1 D) ja ilmaisu TNFa (kuvio 1 E) ja IL-1β (kuvio 1 E) mRNA haavauma mahalaukun kudoksesta myös saavutti huippunsa päivänä 4, ja niiden tasot olivat korkeammat haavainen kudoksen kuin normaalissa mahan kudoksessa koko tarkastelujakson aikana. Haavaumat kohonneet myös VEGF: n ilmentymistä mRNA: n (kuva 1 F).

HMGB1 Expression seuraavat Haavauma

Seuraava arvioidaan, onko HMGB1 oli mukana mahahaava paranemista. HMGB1 mRNA-tasot mahan kudoksessa (kuvio 2A) ja seerumin HMGB1 (kuvio 2B) saavuttivat maksiminsa päivänä 4. HMGB1 mRNA-tasot olivat lähes vakiona tarkastelujakson aikana, kun taas seerumin HMGB1 laski normaalitasolle 6 päivää sen jälkeen, kun induktio haava. Immunohistokemiallisesti, haavaumat aiheuttama näkyvä sytoplasmista värjäytymistä HMGB1 epiteelisoluissa, etenkin loukkaantunut alueilla (kuvio 2C, 2D). Sitä vastoin ehjä mahan limakalvoa, HMGB1 lokalisointi on rajoitettu sisällä tumiin epiteelisolujen (kuvio 2E).

ulkosyntyisten HMGB1, HMGB1 immunoneutralisaatio, ja esto HMGB1 Tiedote mahahaava Healing

mRNA ilmaisun ja MPO aktiivisuus arvioitiin päivänä 6, ja haavaindeksi arvioitiin päivänä 9, mukaan ajan kulku tutkimuksessa. Hiirille annettiin rHMGB1 tai anti-HMGB1 vasta-aineen vatsakalvonsisäisesti induktion jälkeen haava. Anto rHMGB1 annoksella joko 100 ug /kg tai 1000 ug /kg merkittävästi tukahdutti mahahaavan paranemista (kuvio 3A), joka on yhteydessä lisääntyneeseen MPO aktiivisuutta (kuvio 3B) ja TNFa: n mRNA: n ekspression haavaumia kudoksissa (kuvio 3C). Sen sijaan, HMGB1 neutraloivat vasta-aineet edistivät haavan paranemisessa (kuvio 4A) ja vähensi MPO aktiivisuutta (kuvio 4B) ja TNFa: n mRNA: n ilmentymisen (kuvio 4C). Vaikeuttaa Ulkoisten rHMGB1 on mahahaava paranemista peruttiin samanaikaisesti annetun anti-HMGB1 vasta-aineella (kuvio 4F). VEGF: n ilmentymistä mRNA: n ei vaikuttanut käsittelemällä joko rHMGB1 (kuvio 3D, 3E) tai anti-HMGB1 vasta-aineella (kuvio 4D, 4E). Normaalilta mahan kudoksessa, anto rHMGB1 tai anti-HMGB1 ei myöskään ole vaikutuksia sytokiinin ilmentymistä tai MPO aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi hallinnon etyylipyruvaatin, estäjä HMGB1 julkaisu, selvästi edistänyt haavojen paranemiseen verrattuna ajoneuvon käsittelyä. Healing mukana oli tukahduttaminen TNFa mRNA: n ilmentymisen (tuloksia ei ole esitetty).

rooli TLR2, TLR4, ja RAGE mahahaava Healing

Sen tutkimiseksi, TLR2, TLR4, ja RAGE myötävaikuttaa että HMGB1 välittämää mahahaava paranemista, kokeellinen mahahaavan indusoitiin TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO, ja ohjaus villityypin hiirillä. TLR4 ja RAGE puute edistää mahahaavan muodostumisen ja esti kasvua TNFa mRNA ilmaisun jälkeen haavaumia, kun taas TLR2 puute ei vaikuttaisi haavaindeksi eikä ilmaisua TNFa mRNA (kuvio 5A, 5B). Eksogeenisen HMGB1 ei vaikuttaisi haavaindeksi eikä ilmaisua TNFa mRNA joko TLR4 KO tai RAGE KO hiiret (kuvio 5C-5F). Eksogeenisen HMGB1 kuitenkin viivästynyt haavan paranemisessa villityypin hiirissä ja vähentää TNFa-mRNA: n ilmentymistä (kuvio 3).

Expression TLR2, TLR4 ja RAGE aikana mahahaava Healing

Seuraava tutkittu mRNA: n ilmentymisen ja immunoreaktiivisuus TLR2, TLR4 ja RAGE villityypin hiirillä. Merkittävä up-regulation of TLR2 mRNA havaittiin induktion jälkeen haava (kuvio 6A). TLR2-immunoreaktiivisuus havaittiin pääasiassa tulehdussolujen (kuvio 6B). Ilmaisu TLR4 mRNA ei vaikuttanut induktio haava (kuvio 6C). TLR4 immunoreaktiivisuus havaittiin apikaalisella osa epiteelisolujen klo haava reuna ja joissakin tulehduksellisten solujen haava sängyssä (kuvio 6D).

Huomattava säätely ylöspäin RAGE mRNA havaittiin päivänä 9 jälkeen induktio haava (kuvio 6E). RAGE immunoreaktiivisuus havaittiin pääasiassa tulehdussolujen reunalla haava sänkyä ja verisuonten solukalvojen (kuvio 6F).

Värjäys haavaumia kudoksen TLR4 KO tai RAGE KO hiirten anti-TLR4 vasta- tai anti-RAGE-vasta vastaavasti havaittu mitään positiivista signaalia, mikä vahvistaa spesifisyys näiden vasta-aineiden (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että eksogeeninen HMGB1 viiveet mahahaava paranemista, kun taas asiakkuutta TNFa ilmaisun ja MPO toimintaa. Kääntäen, immunoneutralisaatio HMGB1 tai estämällä vapauttamaan HMGB1 edistää haavojen paranemiseen ja vähentää TNFa ilmaisun ja MPO toimintaa. Lisäksi TLR4 ja RAGE puute edistää haavauman paranemista, ja eksogeeninen HMGB1 ei viivästyttää haavojen paranemiseen vuonna TLR4 KO ja RAGE KO hiirillä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HMGB1 on vaikeuttava tekijä mahahaavan paranemista, joka toimii kautta TLR4- ja RAGE-riippuvainen reittejä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti selventää roolia HMGB1 haavan paranemiseen ruoansulatuskanavassa.

Muutamat tutkimukset osoitettu rooli HMGB1 haavan paranemiseen elimissä muissa kuin ruoansulatuskanavassa, mutta näiden tutkimusten tulokset ovat ristiriitaisia ​​[37-40]. Vastaa meidän tuloksia, jotkut tutkimukset osoittivat, että HMGB1 on estävä vaikutus haavan paranemiseen [37,38]. Zhang et ai. osoittivat, että HMGB1 heikentää viilto haavan paranemista vähentämällä reparative kollageenin kertymistä kautta RAGE [37]. Goova et ai. osoittivat, että esto RAGE ligandit, kuten AGE ja HMGB1 käyttäen liukoista muotoa reseptori AGE (sRAGE), nopeuttaa haavan paranemisessa ja estää tasot inflammatoristen sytokiinien [38]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että liiallinen tulehdusta heikentynyt haavan paranemista. Esimerkiksi edellisessä Tutkimus osoitti, että TNFa yli-ilmentyminen ja liiallinen neutrofiilikeräytymän ovat riskitekijöitä muodostumiseen ja paranemista mahahaavan [41]. Lisäksi toinen malli kudosten korjaamiseen, Goren et al. osoittaneet, että liiallinen neutrofiilien ja makrofagien tunkeutuminen TNFa yli-ilmentyminen estää paranemista hiiren ihon vammoja [42]. Näin ollen, on mahdollista, että HMGB1 viivästää mahahaavan paranemista TNFa-laukeaa tulehdusreaktioita.

Sen sijaan jotkut in vitro viittasivat siihen, että HMGB1 ja sen reseptorit ovat olennaisia ​​haavan paranemiseen [39,40]. Staraino et ai. osoittivat, että HMGB1 nopeuttaa haavojen paranemista ja uudistumista tehostamalla kulkeutumista ihon fibroblastien ja keratinosyyttien [39]. HMGB1 edistää myös haavan paranemista 3T3 fibroblastien indusoimalla solujen lisääntymisen ja maahanmuuton aktivoinnista RAGE /ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasireittiä [40]. Koska nämä in vitro -tutkimukset tehtiin ilman tulehdussolujen, erot kokeelliset menetelmät voivat johtaa ristiriidassa päätelmät roolista HMGB1 haavan paranemisen.

VEGF, joka on tehokas angiogeeninen kasvutekijä, on tärkeä rooli mahahaava paranemista [43,44]. Aiemmissa raporteissa osoittaneet, että HMGB1 voisi indusoida VEGF useissa kudoksissa ja eläinmalleissa [45-47]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa ei rHMGB1 eikä anti-HMGB1 vasta vaikutti VEGF ilmentymistä haavautunut kudoksessa. Syynä erot tulokset ja niitä aikaisempien tutkijoiden ei ole selvä, mutta se voi liittyä käyttöön eri elimiin ja kokeellisissa malleissa.

On 2 mahdollisia lähteitä solunulkoisen HMGB1: passiivinen vapautuminen nekroottisten solujen [48] ja aktiivista erittymistä tulehdussolujen [5]. Tässä tutkimuksessa, HMGB1 immunoreaktiivisuus havaittiin sytoplasmassa sekä ytimen, viittaa siihen, että nekroottisten solujen ovat lähde HMGB1. Mahalaukun HMGB1 mRNA-tasot nousivat haavojen paranemiseen, mikä viittaa siihen, että tulehdussolujen tuottamaan ja vapauttamaan HMGB1. Kollektiivisesti seerumin HMGB1 johti johtui passiivisesta vapautumista vaurioituneet solut on mahahaava ja aktiivinen eritys tulehdussolujen.

Seerumin HMGB1 nousivat induktion jälkeen mahahaava mutta laski klo loppuvaiheessa paranemista, vaikka ilmaus HMGB1 ja TNFa pysyi korkeana. Nämä tiedot esitetään mahdollisuus systeeminen HMGB1 loukkusysteemillä. Tätä varten olemassaolo HMGB1 sitovan proteiinin on raportoitu. Trombomoduliinin, solun pinnan glykoproteiinin, on yksi esimerkki HMGB1 sitovan proteiinin. Rekombinantti ihmisen liukoisen trombomoduliinin esti nousun plasman HMGB1 indusoitu lipopolysakkaridilla rottamallissa [49] ja sitoutunut HMGB1 kautta lektiinidomeeni [50], jotta HMGB1 vuorovaikutuksessa muiden reseptorien [51]. Kliinisissä sovelluksissa, trombomoduliini on myös käyttökelpoinen HMGB1 liittyvien sairauksien ja tilojen, kuten sepsis, koska sen anti-HMGB1 ominaisuudet [52]. sRAGE, havaitaan verenkierrossa, on toinen esimerkki HMGB1 sitovan proteiinin. sRAGE on liukoinen muoto RAGE; se toimii houkutuslintuna estää vuorovaikutusta solupinnan RAGE ja sen ligandien, kuten HMGB1 [53]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kuten sieppaussysteemejä voi olla suojaava rooli leviämisen estämiseksi tulehdus, mikä edistää haavojen paranemiseen.

Tiedetään, että monet mahahaava potilaat ovat sairastuneet Helicobacter pylori
. Vaikka tässä tutkimuksessa ei tutkittu roolia HMGB1 mahahaava paranemiseen hiirillä tartunnan H. pylori
, kliiniset ja kokeelliset tutkimukset viittaavat siihen, että haitallinen vaikutus HMGB1 on mahahaavan paranemista olisi voimakkaampi potilailla, joilla on H. pylori
infektio kuin näissä ilman sitä. Olemme aiemmin osoittaneet, että H. pylori
infektio lisää neutrofiilien infiltraatio haavaumia kudoksiin Mongolian gerbiilit [54]. Shimizu et ai. osoittivat myös, että neutrofiilit ja makrofagit tunkeutua haavauma marginaalit korkeampi potilailla, joilla H. pylori
infektio kuin näissä ilman infektiota [55]. Suuri määrä HMGB1 on siis todennäköisesti esiintyy haavaumia kudoksessa tartunnan H. pylori
, koska se erittää ne tulehdussolujen. Lisäksi Radin et ai. kertoi, että VacA, tärkeä virulenssitekijä tästä organismista, aiheuttaa ohjelmoidun kuolion mahan epiteelisolujen ja vapautuivat HMGB1 [56]. Niinpä onkin odotettavissa, että haitallisia on HMGB1 on haavojen paranemiseen olisivat näkyvämmin H. pylori
infektoiduista potilaista.

TLR2, TLR4, ja RAGE, jotka välittävät proinflammatorisia vasteita, ovat yleisesti tunnettuja HMGB1 reseptoreihin. Tuloksemme osoittavat selvästi, että TLR4 ja RAGE keskeisessä asemassa ovat mahahaava paranemista. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien havainnot tulehdusreaktioita aiheuttama HMGB1. Yksi vakiintunut malleja, joihin liittyy vuorovaikutus HMGB1 ja nämä reseptorit on I-R vahinkoa. Maksan I-R vamma, TLR4-hiirillä osoittivat vähemmän maksa I-R vahinkoa; vahingon TLR4-hiirissä ei ollut vaikutusta rHMGB1 tai anti-HMGB1 vasta-aine [26]. Lisäksi esto RAGE suojattu hepatosellulaarisia kuolemaa ja kuolion maksan I-R vamman malli [57]. Mallissa sydämen I-R vamma, Andrassyn et al. osoittivat, että RAGE-hiirillä näkyy vain lievää tulehdusta johtuvat sydämen I-R vamman; tulehdus ei vaikuttanut induktion rHMGB1 [27]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että TLR4-HMGB1 ja RAGE-HMGB1 vuorovaikutuksilla on ratkaiseva rooli I-R vamma, vaikka se on tarpeen tarkastella eroja kussakin elimessä. Toinen vakiintunut malli on systeeminen tulehdus, kuten sepsis [5,8,58]. Kokeellisessa mallissa vatsaontelonsisäisestä sepsis, Susan et ai. osoittivat, että HMGB1-RAGE vuorovaikutus oli tiiviisti sepsiksen aiheuttamasta diaphragmatic toimintahäiriö [58]. In vivo systeemisen tulehduksen malli muodostetaan injektoimalla eksogeenista HMGB1, Zoelen et ai. osoittivat, että HMGB1 indusoi sytokiinien aktivointi hyytymisen, ja neutrofiilien kautta TLR4 ja RAGE [8]. Siten TLR4 ja RAGE kriittisiä rooleja synnyssä välittämien HMGB1 liittyvä reittiin, mukaan lukien polku meidän haavojen paranemiseen malli.

Tuloksemme osoittavat, että TLR2 ei ole suhdetta mahahaava paranemiseen: haava paranemista TLR2 KO hiirissä muistutti villityypin hiirillä. Vaikka in vitro -tutkimukset makrofaagisolukantoja osoitti, että TLR2-HMGB1 reitin indusoi tulehdusreaktioita [6,9], in vivo vaikutukset TLR2 HMGB1 välittämän patologioita ei ole raportoitu. Siten perustuvat aiempia havaintoja [8] ja meidän tulokset, HMGB1-TLR2 reitti voi olla vähäinen merkitys korjaus ja patogeneesi kudosvaurioiden ja tulehdus.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että HMGB1 on vaikeuttava tekijä paranemista mahahaavan sekä muihin sairauksiin. Lisäksi olemme osoittaneet, että HMGB1 estää haavojen paranemiseen mekanismilla, johon TLR4, RAGE, ja liiallinen tulehdusreaktioita. Vaikka protoni loisto estäjiä yleisesti määrätty mahahaavat, hankala haavaumat aiheuttavat edelleen kliinisen ongelman. Nykyinen tutkimus tukee uuden konseptin hoitoon hankala mahahaavan lisäksi protoni loisto estäjiä hoito.

Kiitokset

Kiitämme Emi Suzuki-Yoshiokan tekniseen tukeen. Haluan myös ilmaista vilpittömät kiitokseni henkilökunnan jäsenille Osaka University, jotka tukivat meitä.

• PLoS ONE: Mangiferin lievittää mahahaavan Iskemia /reperfuusio Rats: osallistuminen PPAR-γ, NF-KB ja Nrf2 /HO-1: n signaloinnin Pathways
• PLoS ONE: Ei Association of Coffee Kulutus mahahaava, pohjukaissuolihaava, refluksiesofagiitti, ja nonerosiivinen refluksisairaus: poikkileikkaus tutkimus 8013 terveille Japan