PLoS ONE: High-Mobility Group Box 1 Sperrt Magengeschwür Heilung durch Toll-like Rezeptor 4 und Rezeptor für Advanced Glycation End Products

Abstrakt

Hoch Mobility Group Box 1 (HMGB1) wurde zunächst als entdeckt Kernprotein, das mit DNA als Chromatin-assoziierte nicht-Histon-Protein in Wechselwirkung tritt Nukleosomen zu stabilisieren und die Transkription vieler Gene im Zellkern zu regulieren. Sobald durchgesickert oder aktiv in die extrazelluläre Umgebung sezerniert wird, aktiviert HMGB1 Entzündungswege durch mehrere Rezeptoren stimulieren, einschließlich der Toll-like Rezeptor (TLR) 2, TLR4 und Rezeptor für Advanced Glycation Endprodukten (RAGE), was zu einer Gewebeverletzung. Obwohl HMGB1 Fähigkeit Entzündung zu induzieren, wurde gut dokumentiert, wurden keine Studien, die die Rolle von HMGB1 in Wundheilung im gastrointestinalen Bereich untersucht. Das Ziel dieser Studie war es, die Rolle von HMGB1 und seinen Rezeptoren in der Heilung von Magengeschwüren zu bewerten. Wir untersuchten auch die Rezeptor unter TLR2, TLR4, oder RAGE vermittelt HMGB1 die Auswirkungen auf die Heilung von Geschwüren. Magengeschwüren wurden durch Serosa Anwendung von Essigsäure in Mäusen induziert und Magengewebe wurden zur weiteren Auswertung aufbereitet. Die Induktion von Geschwüren erhöhte die immunhistochemische Färbung von Cytoplasma-HMGB1 und erhöhte Serum-HMGB1 Ebenen. Ulkus Größe, Myeloperoxidase (MPO) Aktivität und die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) mRNA erreichte am Tag 4. Die intraperitoneale Verabreichung von HMGB1 verzögerte Heilung von Geschwüren und erhöhte MPO-Aktivität und TNF-Expression. Im Gegensatz dazu ist die Verabreichung von Anti-HMGB1-Antikörper förderte die Heilung von Geschwüren und reduziert MPO-Aktivität und TNFa Expression. TLR4 und RAGE-Mangel verbessert die Heilung von Geschwüren und reduziert das Niveau von TNFa, während die Heilung von Geschwüren in TLR2 Knockout (KO) Mäusen, die ähnlich war in Wildtyp-Mäusen. In TLR4 KO und RAGE KO-Mäuse, exogene HMGB1 hatte keinen Einfluss auf die Heilung von Geschwüren und TNFa Ausdruck. So konnten wir zeigen, dass HMGB1 ein erschwerender Faktor in der Magengeschwür Heilungsprozess ist, die TLR4 und RAGE wirkt durch übermäßige Entzündungsreaktionen zu induzieren.

Citation: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) Hoch Mobility Group Box 1 Sperrt Magengeschwür Heilung durch Toll-like Rezeptor 4 und Receptor for Advanced Glycation End Products. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10.1371 /journal.pone.0080130

Editor: Mathias Chamaillard, INSERM, Frankreich

Empfangen: 29. Mai 2013; Akzeptiert: 30. September 2013; Veröffentlicht: 11. November 2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Autoren keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

Konkurrierende Interessen:. Kenji Watanabe - Gewährung /Forschungsunterstützung von der Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Sprechen und Lehre: Abbott Japan Co., LTD. Yasuhiro Fujiwara - Sprechen und Lehre: Eisai Co. Ltd Tetsuo Arakawa - Beratungsausschüsse oder Prüfungsgremien: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Die anderen Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen. Dabei werden nicht die Einhaltung der Autoren ändern, um alle Politiken PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Hoch mobility group box protein 1 (HMGB1), ein Mitglied des Hoch Mobility Group Protein-Superfamilie, ist ein Kernprotein [1]. HMGB1 Wechselwirkung mit DNA als Chromatin-assoziiertes Protein nonhistone Nukleosomen zu stabilisieren und die Transkription vieler Gene im Zellkern zu regulieren [2]. Wenn sie von einer Zelle während des nekrotischen Zelltods durchgesickerten [3] oder aktiv in die extrazelluläre Umgebung sezerniert durch Monozyten und Makrophagen [3,4], HMGB1 wirkt als ein Alarmeingang mit potenter proinflammatorischer Eigenschaften [5].

Die am besten untersuchten HMGB1-Rezeptoren sind Toll-like Rezeptor (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9] und Rezeptor für Advanced Glycation Endprodukten (RAGE) [6,8]. TLR2 und TLR4 sind Mitglieder der TLR-Familie, und sie spielen eine entscheidende Rolle bei der angeborenen Immunantwort zu pathogen-associated molecular patterns und beschädigungs associated molecular pattern Moleküle [10]. TLR2 erkennt hauptsächlich Komponenten der gram-positive Bakterienzellwand und TLR4 erkennt vor allem Lipopolysacchariden, welche die Hauptzellwandkomponente von gram-negativen Bakterien ist. TLR2 und TLR4 Auslösesignalwegen führt zur Aktivierung des nukleären Faktors &kgr; B (NF &kgr; B) durch das akzessorische Protein MyD88, und die nachfolgende Regelung der Immun- und Entzündungsgenen, einschließlich entzündlicher Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF &agr;), mit die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen [11-13]. Rezeptor für Advanced Glycation Endproducts (RAGE) ist ein Multi-Ligandenrezeptor, der zur Immunglobulin-Superfamilie gehört [14]. Andere bekannte RAGE-Liganden schließen Amyloid [15] und S100 [16]. Mehrere Versuche haben ergeben, dass der Ligand-RAGE-Interaktion aktiviert auch NF-kappaB und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen [17-20].

Viele pathologische Zustände sind auf die proinflammatorischen Eigenschaften von HMGB1 bezogen. Früheren Berichte zeigten, dass HMGB1 eine kritische Rolle in Endotoxämie spielt [21], akute Pankreatitis [22], acute respiratory distress syndrome [23], einige Autoimmunerkrankungen [24], zerebrale Ischämie Verletzung [25], und Ischämie-Reperfusions (IR) Verletzungen der Leber [26], Herz [27], und Niere [28]. Im Hinblick auf den Magen-Darm-Trakt, ist HMGB1 ein erschwerender Faktor bei experimenteller Colitis [29,30] und nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneimittel induzierten Dünndarmverletzung [31].

Derzeit ist die Rolle von HMGB1 in Wundheilung ist unklar, obwohl seine Fähigkeit, Entzündung zu induzieren, wurde gut dokumentiert, wie oben beschrieben. Im Magen-Darm-Bereich hat keine Studie die Rolle von HMGB1 in der Wundheilung untersucht. Das Ziel dieser Studie war es, die Rolle von HMGB1 in Magengeschwür Heilung zu untersuchen. Wir untersuchten die Rolle von HMGB1 in den Heilungsprozess durch einen etablierten experimentellen chronischen Magengeschwür-Modell in Nagetier aus dem Magen-Serosaseite durch topische Applikation von Essigsäure erstellt. Das Modell ahmt menschliche Magen-Darm-Magengeschwür in der Histologie und Morphologie [32]. Wir untersuchten auch, ob HMGB1 Heilung von Geschwüren durch TLR2, TLR4, oder RAGE beeinflusst.

Materialien und Methoden

Tiere

TLR2- und TLR4-Knockout (KO) Mäusen, die ursprünglich von Dr. S. Akira (Osaka University generiert wurden, Osaka, Japan ) und Rückkreuzungs 8 mal auf eine C57BL /6 Hintergrund wurden von Oriental Bioservice, Inc. (Kyoto, Japan) erhalten. RAGE-KO-Mäuse, die auf einem C57BL /6-Hintergrund zurückgekreuzt worden war, wurden ursprünglich erzeugt durch und ein Geschenk von Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japan). Wildtyp C57BL /6-Mäuse wurden von Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japan) als Kontrollstamm für TLR2 KO, TLR4 KO, und RAGE KO-Mäuse erworben. Spezifische pathogen-free 12 Wochen alten männlichen Tieren wurden verwendet. Alle Tiere wurden in Polycarbonatkäfigen mit Papier Chip Betten untergebracht. Die Käfige wurden in einem klimatisierten Biohazard Zimmer mit einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus befindet. Alle experimentellen Verfahren wurden von der Animal Care Committee der Osaka City University Graduate School of Medicine (: 11006 Zulassungsnummer) zugelassen. Alle Operationen wurden unter Isofluran durchgeführt und wurden alle Anstrengungen unternommen, Leiden zu minimieren.

Experimentelle Induktion von Ulkus

Magengeschwür durch ein Verfahren induziert wurde an anderer Stelle ausführlich [33], mit geringfügigen Modifikationen beschrieben . Kurz gesagt, unter Etheranästhesie wurden die Bäuche der Tiere eingeschnitten und der Magen wurde freigelegt. Ein Polypropylenrohr (4 mm im Durchmesser) wurde gegen die Serosa-Seite des Magen gelegt. Ein 80-ul-Aliquot von 60% Essigsäure wurden zu dem Röhrchen zugegeben, das für 30 s in Kontakt mit der Serosaoberfläche gehalten wurde. Nach sofortiger Entfernung der Essigsäure aus dem Rohr durch Aspiration wurde der Magen in seine ursprüngliche Position zurückgeführt, und wurde das Abdomen geschlossen. Früheren Berichte zeigten, dass die Größe des Magengeschwür ein Maximum an Tag 3 oder 4 nach Ulkus Induktions erreicht, und danach wird es allmählich verringert [32,34]. Die Heilungsphase des experimentellen Magengeschwür beginnt am Tag 4 nach Geschwür Induktion

Experimental Gruppen aus

, um die Wirkung von exogenen HMGB1 Um zu untersuchen, Mäuse intraperitoneale Injektionen von humanen rekombinanten HMGB1 (rHMGB1 erhalten;. 100 -1000 ug /kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) oder Vehikel (phosphatgepufferte Salzlösung) zweimal täglich, 4 Tage nach Geschwür Induktion beginnen (von Tag 4 bis Tag 9).

Als nächstes wird die Wirkung der immunoneutralization von HMGB1 auf die Heilung Magengeschwüren wurde beurteilt. Mäuse wurden intraperitoneal Huhn verabreicht neutralisierenden Anti-HMGB1 polyklonalen Antikörper (5 mg /kg; Shino Test Corporation, Tokio, Japan) oder normale Huhn IgY (5 mg /kg; Sigma-Aldrich Co.) in 4 Tagen nach Ulkus Induktions beginnen ( von Tag 4 bis Tag 9). Darüber hinaus wurden die Auswirkungen der Freisetzung eines Inhibitors von HMGB1, Ethylpyruvat oder Fahrzeug zu bestätigen zweimal täglich injiziert, beginnend am Tag 4 nach Geschwür Induktion.

Weiteren den Rezeptor für HMGB1 bedingten Magengeschwüren zu bestimmen, Heilung wurden Magengeschwüren in TLR2 KO, TLR4 KO induziert und RAGE KO-Mäuse mit oder ohne intraperitoneale Injektion von 1000 ug /kg rHMGB1 zweimal täglich, beginnend am Tag 4 nach Geschwür Induktion.

wurde der Magen entfernt und die Größe des Geschwürs wurde am Tag 6 oder 9 nach Geschwür Induktion gemessen. Ulkusgröße als Ulkus-Index ausgedrückt wurde, das Produkt aus der maximalen Länge und der minimalen Länge (d.h. maximale Länge wurde durch minimale Länge multipliziert). Die Studien wurden 4-8 Proben durchgeführt. Die Proben von Magengewebe wurden zur weiteren Auswertung weiterverarbeitet.

mRNA Expression von Entzündungsmediatoren in Magen-Gewebe, bestimmt durch quantitative Echtzeit-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Real- time quantitative RT-PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [35]. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus Darmgewebe isoliert durch eine ISOGEN Kit (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Komplementäre DNA wurde ein hoher Kapazität unter Verwendung von RNA-to-cDNA-Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) nach dem Protokoll des Herstellers gewonnen. Real-time quantitative RT-PCR-Analysen wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 7500 durchgeführt schnelle Echtzeit-PCR-System und Software (Life Technologies Corporation). Das Reaktionsgemisch wurde nach dem Protokoll des Herstellers hergestellt, indem das TaqMan schnelles Universal PCR Master Mischung (Life Technologies Corporation) verwendet. Thermozyklusbedingungen waren wie folgt: 45 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min. Gesamt-RNA wurde für die Messung von Zielgenen unterzogen, um quantitative RT-PCR in Echtzeit unter Verwendung von TaqMan-Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Kontrollreagenzien (Life Technologies Corporation), das als interner Standard verwendet. Die Expression von mRNA HMGB1 kodiert, TLR4, RAGE, vascular endothelial growth factor (VEGF), Interleukin-1-beta (IL-1β) und TNFa in ulzeriert und normalem Magengewebe wurde unter Verwendung von Echtzeit-RT-PCR quantifiziert und standardisiert Glycerinaldehyd -3-phosphat-Dehydrogenase-mRNA-Spiegel. Die Expression von jeder mRNA wird als Verhältnis, bezogen auf den Mittelwert in normalen Magengewebe angegeben. Die Primer und Sonden für die RT-PCR verwendet, sind in Tabelle 1
Gene gezeigt
Primer und Sonde
TNF-αPrimer (vorwärts) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'-Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Vorwärts) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'-Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Vorwärts) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'-Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Vorwärts) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'-Primer (rückwärts) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (vorwärts) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'-Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Vorwärts) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'-Primer (rückwärts) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (vorwärts) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'-Primer (rückwärts) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. Primer und Sonden.
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immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung

Gewebeproben mit 0,1 M Phosphatpuffer fixiert wurden (pH 7,4), enthaltend 4% Paraformaldehyd. Die Proben wurden in Paraffin eingebettet und serielle 5 um dicke Schnitte wurden auf silanisierte Objektträger (Dako, Tokyo, Japan) montiert ist. Die Proben wurden in einer Lösung von 3% H _{2 O 2 in absolutem Methanol für 5 min getaucht, um endogene Peroxidase zu-Aktivität hemmen, und dann für 10 min in 5% Magermilch inkubiert. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung wurde für die morphologischen Beobachtungen durchgeführt. Ein Kaninchen monoklonale Anti-HMGB1-Antikörper (verdünnt 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) wurde als primärer Antikörper verwendet und über Nacht bei 4ºC mit den Proben inkubiert. Ein sekundärer Antikörper (Histofine Einfache Stain MAX Peroxidase Kit; Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) wurde 1 h mit den Proben inkubiert, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Immunreaktivität wurde durch Behandlung der Schnitte mit Histofine Einfache Stain und Diaminobenzidin-Lösung (Nichirei Biosciences Inc.) sichtbar gemacht. Die Proben wurden dann mit Hämatoxylin gegengefärbt. Als nächstes wurde TLR2, TLR4 und RAGE-Expression durch eine Immunofluoreszenz-Methode bestimmt. Die primären Antikörper in Immunfluoreszenzfärbung verwendet, enthalten einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen TLR2 (verdünnt 1: 200; Abcam), einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen TLR4 (verdünnt 1: 200; Abcam) und eines Ratten monoklonalen Antikörper gegen RAGE (verdünnt 1: 250 Abcam). Gewebeproben, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden über Nacht bei 4 ° C mit den primären Antikörpern inkubiert und anschließend mit den entsprechenden Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern (Abcam) für 2 h. Die Proben wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit Argon und Krypton-Argon-Laserquellen ausgestattet sucht.}

Messung von Serum HMGB1 Levels

Blood (1000 ul) Proben wurden in Serumtrennröhrchen durch Herzpunktur erhalten. Nach Zentrifugation bei 3.000 Upm für 10 min wurde das Serum gesammelt und bei -80 ° C gelagert. Serumspiegel von HMGB1 wurden unter Verwendung eines HMGB1 Sandwich-ELISA-Kits gemessen (Shino Test Corporation) nach dem Protokoll des Herstellers.

Die Messung der Myeloperoxidase (MPO) Aktivität

Methoden verwendet MPO-Aktivität zu messen, werden im Detail an anderer Stelle [36] beschrieben. Kurz gesagt, wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Sigma Chemical Co.) die Proben homogenisiert. Suspensionen wurden zentrifugiert und die MPO-Aktivität in dem resultierenden Überstand wurde mit einem Spektrophotometer bestimmt. Eine Einheit der MPO-Aktivität wurde als die Menge an Enzym definiert, die 1 umol Peroxid abgebaute /min bei 25 ° C. Die Ergebnisse sind als Einheiten pro Gramm Magengewebe exprimiert.

Statistical Analysis

Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zu testen zwischen Behandlungsgruppe bedeutet, und die Ergebnisse wurden mit Fishers geschützten Niedrigstwertiges-Differenz-Test analysiert. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse |

Zeitverlauf der Magengeschwür Heilung

Um den Heilungsprozess von Magengeschwüren, experimentelle Magengeschwür zu bewerten wurde durch topische Anwendung von Essigsäure aus dem Magen-Serosaseite induziert . Die Geschwüre wurden mikroskopisch (1A, 1B) und makroskopisch bewertet. Die Größe der Geschwüre erreichte ein Maximum am Tag 4 und verringert im Laufe der Zeit danach (1C). MPO-Aktivität (Figur 1D) und die Expression von TNF &agr; (1E) und IL-1β (1E) mRNA in der ulzeriert Magengewebe erreichte auch an Tag 4, und ihre Werte waren höher in ulzeriert Gewebe als in normalem Magengewebe im ganzen Prüfungszeitraum. Ulceration erhöht auch die Expression von VEGF mRNA (Figur 1F).

HMGB1 Expression folgende Ulzerationen

Wir untersuchten als nächstes, ob HMGB1 in Magengeschwür Heilung beteiligt war. HMGB1-mRNA-Spiegel in Magengewebe (2A) und die Serumspiegel von HMGB1 (2B) erreicht ihr Maximum an Tag 4. HMGB1-mRNA-Spiegel im Untersuchungszeitraum nahezu konstant waren, wohingegen die Serumspiegel von HMGB1 sank auf normalen Niveaus 6 Tage nach die Induktion von Geschwüren. Immunhistochemisch, Ulzeration prominent zytoplasmatische Färbung von HMGB1 in Epithelzellen induziert wird, insbesondere in verletzten Bereiche (2C, 2D). Im Gegensatz dazu wurde in intakten Magenschleimhaut, HMGB1 Lokalisation innerhalb der Kerne von Epithelzellen (2E) begrenzt.

Effekte von exogenen HMGB1, HMGB1 immunoneutralization und Hemmung von HMGB1 Veröffentlichung auf Magengeschwür Heilung

mRNA-Expression und MPO-Aktivität wurden am Tag ausgewertet 6 und der Ulkus-Index wurde am Tag 9 bewertet, entsprechend der Zeitverlaufsstudie. Die Mäuse wurden rHMGB1 oder Anti-HMGB1-Antikörper intraperitoneal nach der Induktion von Geschwüren verabreicht. Verabreichung von rHMGB1 bei einer Dosis von entweder 100 &mgr; g /kg oder 1000 &mgr; g /kg signifikant Magengeschwür Heilung (3A) unterdrückt wird, die mit einer erhöhten MPO-Aktivität (3B) und TNFa-mRNA-Expression in ulzeriert Gewebe (3C) verbunden war. Im Gegensatz dazu neutralisierende Antikörper HMGB1 Heilung von Geschwüren gefördert (4A) mit reduzierter MPO-Aktivität (4B) und TNFa-mRNA-Expression (4C). Die komplizieren Wirkung der exogenen rHMGB1 auf Magengeschwür Heilung wurde durch die gleichzeitige Gabe von Anti-HMGB1-Antikörper (4F) abgebrochen. Die Expression von VEGF-mRNA wurde durch die Behandlung nicht beeinflusst entweder mit rHMGB1 (3D, 3E) oder Anti-HMGB1-Antikörper (4D, 4E). In normalen Magengewebe, Verabreichung von rHMGB1 oder Anti-HMGB1 auch keine Auswirkungen auf die Cytokin-Expression oder MPO-Aktivität hatte (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ist die Verabreichung von Ethyl-Pyruvat, einem Inhibitor der HMGB1 Freisetzung, deutlich gefördert Heilung von Geschwüren, verglichen mit der Vehikelbehandlung. Heilung durch die Unterdrückung von TNF-mRNA-Expression begleitet wurde (Daten nicht gezeigt).

Die Rolle von TLR2, TLR4 und RAGE in Magengeschwür Heilung

Um zu untersuchen, ob TLR2, TLR4 und RAGE beitragen zu HMGB1-vermittelten wurden in TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO Magengeschwür Heilung, experimentelle Magengeschwüren Wildtyp-Mäusen und Kontrolle induziert. TLR4 und RAGE-Mangel begünstigt die Bildung Magengeschwür und verhindert den Anstieg der TNF-mRNA-Expression nach Ulzerationen, während TLR2 Mangel betroffen weder das Geschwür Index noch die Expression von TNF-mRNA (5A, 5B). Die Verabreichung von exogenen HMGB1 in das Geschwür Index noch die Expression von TNF-mRNA beeinflusst weder entweder TLR4 KO oder RAGE KO-Mäuse (5C-5F). Die Verabreichung von exogenen HMGB1 jedoch verzögerte Heilung von Geschwüren in Wildtyp-Mäusen und reduziert TNFa-mRNA-Expression (Abbildung 3).

Die Expression von TLR2, TLR4 und RAGE bei Magengeschwür Heilung

Wir untersuchten neben mRNA-Expression und Immunreaktivität von TLR2, TLR4 und RAGE in Wildtyp-Mäusen. Eine signifikante Hochregulation von TLR2 mRNA wurde nach der Induktion eines Geschwürs (6A) beobachtet. TLR2 Immunreaktivität wurde hauptsächlich beobachtet in Entzündungszellen (6B). Die Expression von TLR4 mRNA wurde nicht durch die Induktion von Geschwüren (6C) berührt. TLR4 Immunreaktivität wurde im apikalen Teil des Epithels am Geschwür Rand und in einigen Entzündungszellen in das Geschwür Bett (6D) beobachtet.

Eine signifikante Hochregulation der RAGE-mRNA am Tag beobachtet wurde 9 nach die Induktion von Geschwüren (6E). RAGE Immunreaktivität wurde hauptsächlich am Rand des Geschwürs Betten und in den vaskulären endothelialen Zellmembran (6F).

Anfärbung von ulzeriert Gewebe von TLR4 KO oder RAGE KO-Mäusen mit einem Anti-TLR4-Antikörper in Entzündungszellen beobachtet oder anti-RAGE-Antikörper, bzw. zeigten keine positive Signale, was bestätigt die Spezifität dieser Antikörper (Daten nicht gezeigt).

Diskussion

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass exogene HMGB1 Verzögerungen Heilung Magengeschwür, während Induktion TNFa Expression und MPO-Aktivität. Im Gegensatz dazu fördert immunoneutralization von HMGB1 oder Hemmung der Freisetzung von HMGB1 Heilung von Geschwüren, während TNFa Expression und MPO-Aktivität. Darüber hinaus fördert die Heilung Geschwür TLR4 und RAGE-Mangel, und exogene HMGB1 versagt die Heilung von Geschwüren in TLR4 KO und RAGE KO-Mäuse zu verzögern. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HMGB1 ein erschwerender Faktor für Magengeschwür Heilung ist, der wirkt durch TLR4- und RAGE-abhängige Wege. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Rolle von HMGB1 in Wundheilung im Gastrointestinaltrakt zu klären.

Einige Studien befasste sich mit der Rolle von HMGB1 bei der Wundheilung in anderen Organen als dem Magen-Darm-Trakt, aber die Ergebnisse dieser Studien sind umstritten [37-40]. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen zeigten einige Studien, dass HMGB1 auf die Wundheilung [37,38] eine hemmende Wirkung hat. Zhang et al. gezeigt, dass durch die Reduzierung reparative Kollagenablagerung über RAGE Inzision Wundheilung [37] HMGB1 beeinträchtigt. Goova et al. gezeigt, daß Liganden RAGE wie Alter und HMGB1 durch Verwendung einer löslichen Form des Rezeptors für AGE (sRAGE), beschleunigt die Heilung von Geschwüren und unterdrückt die Spiegel inflammatorischer Zytokine [38] blockiert. Frühere Studien zeigten, dass eine übermäßige Entzündung Wundheilung beeinträchtigt. Zum Beispiel demonstriert unsere früheren Studie, dass TNFa Überexpression und übermäßige neutrophile Infiltration sind Faktoren bei der Entstehung und Heilung von Magengeschwüren zu komplizieren [41]. Weiterhin wird in einem anderen Modell der Gewebereparatur, Goren et al. gezeigt, dass mit TNFa übermäßige Neutrophilen und Makrophagen-Infiltration Überexpression die Heilung von Hautverletzungen Maus [42] hemmt. Somit ist es möglich, dass HMGB1 Magengeschwür Heilung durch TNFa-ausgelöste Entzündungsreaktionen verzögert.

Im Gegensatz dazu einige In-vitro-Studien vorgeschlagen, dass HMGB1 und seine Rezeptoren für die Wundheilung wichtig sind [39,40]. Staraino et al. gezeigt, dass HMGB1 den Wundheilungsprozess und die Regeneration durch die Migration von Fibroblasten der Haut zu verbessern und Keratinozyten [39] beschleunigt. HMGB1 fördert auch die Wundheilung von 3T3-Fibroblasten durch Zell induzierenden Proliferation und Migration durch die Aktivierung des RAGE /extrazelluläre Signal-regulierte Kinase-Weg [40]. Da diese in vitro Studien wurden in Abwesenheit von Entzündungszellen durchgeführt wird, kann resultieren die Unterschiede in experimentellen Methoden in inkonsistenten Rückschlüsse auf die Rolle von HMGB1 in Wundheilung.

VEGF, ein potenter angiogenetischer Wachstumsfaktor spielt eine wichtige Rolle bei Magengeschwür Heilung [43,44]. Frühere Berichte zeigten, dass HMGB1 die Expression von VEGF in verschiedenen Geweben induzieren könnten und Tiermodellen [45-47]. Doch in dieser Studie weder rHMGB1 noch Anti-HMGB1-Antikörper die VEGF-Expression in ulcerous Gewebe betroffen. Der Grund für den Unterschied zwischen unseren Ergebnissen und denen von früheren Forschern ist nicht klar, aber es kann mit der Verwendung von verschiedenen Organen und experimentellen Modellen zugeordnet werden.

Es gibt zwei mögliche Ursachen für extrazelluläre HMGB1: passive Freisetzung von nekrotischen Zellen [48] und aktive Sekretion von Entzündungszellen [5]. In dieser Studie HMGB1-Immunreaktivität wurde in das Zytoplasma und den Zellkern, was darauf hindeutet, dass nekrotischen Zellen sind eine Quelle von HMGB1 beobachtet. Gastric HMGB1-mRNA-Spiegel während der Heilung von Geschwüren erhöht, was darauf hindeutet, dass Entzündungszellen produzieren und freisetzen HMGB1. Insgesamt führte die Erhöhung der Serum-HMGB1 wurde durch passive Freisetzung von verletzten Zellen in der Magengeschwür und aktive Sekretion von Entzündungszellen.

Serum HMGB1 Spiegel erhöht nach der Induktion von Magengeschwüren, aber in der späten Phase der Heilung zurückgegangen, obwohl die Expression von HMGB1 und TNFa hoch blieb. Diese Daten erhöhen die Möglichkeit einer systemischen HMGB1-Trapping-System. Zu diesem Zweck hat die Existenz eines HMGB1 bindenden Proteins berichtet. Thrombomodulin ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, ist ein Beispiel eines bindenden Proteins HMGB1. Rekombinantes humanes lösliches Thrombomodulin inhibiert den Anstieg der Plasma HMGB1 durch Lipopolysaccharid in einem Rattenmodell induziert [49] und HMGB1 durch die Lectin-Domäne gebunden ist [50] HMGB1 zu verhindern, mit anderen Rezeptoren interagieren [51]. In der klinischen Anwendung ist Thrombomodulin auch nützlich bei der HMGB1-bedingten Krankheiten und Erkrankungen wie Sepsis aufgrund seiner anti-HMGB1 Eigenschaften [52]. sRAGE, im Kreislauf gefunden wird, ist ein weiteres Beispiel eines HMGB1-Bindungsprotein. sRAGE ist die lösliche Form von RAGE; es wirkt als ein Köder Wechselwirkung zwischen Zelloberflächen-RAGE und seinen Liganden, wie HMGB1 [53] zu verhindern. In der vorliegenden Studie könnten solche Fangsysteme auch eine schützende Rolle spielen, um die Ausbreitung der Entzündung zu verhindern, wodurch die Heilung von Geschwüren fördern.

Es ist bekannt, dass viele Magengeschwür-Patienten infiziert sind mit Helicobacter pylori
. Obwohl in der vorliegenden Studie haben wir nicht die Rolle von HMGB1 in Magengeschwür Heilung bei Mäusen untersuchen infiziert mit H. pylori
, klinische und experimentelle Studien deuten darauf hin, dass die schädliche Wirkung von HMGB1 auf Heilung Magengeschwüren bei Patienten stärker ausgeprägt mit einem H wäre. pylori
Infektion als in denen ohne. Wir haben bereits gezeigt, dass H. pylori
Infektion erhöht neutrophile Infiltration in ulzeriert Gewebe in der mongolischen Wüstenrennmäusen [54]. Shimizu et al. auch gezeigt, dass die neutrophilen Granulozyten und Makrophagen Geschwür Margen in einem höheren Maße bei Patienten mit H infiltrieren. pylori
Infektion als bei Patienten ohne die Infektion [55]. Eine große Menge von HMGB1 ist daher wahrscheinlich in der ulzeriert Gewebe infiziert mit H. pylori
, da sie von den Entzündungszellen sezerniert werden würde. Weiterhin Radin et al. berichtet, dass VacA ein wichtiger Virulenzfaktor dieses Organismus, programmierten Nekrose von Magenepithelzellen und anschließender Freisetzung von HMGB1 [56] verursacht. Daher erwarten wir, dass die schädlichen von HMGB1 auf die Heilung von Geschwüren wäre noch ausgeprägter in H. pylori
infiziertem Patienten.

TLR2, TLR4 und RAGE, die entzündungsfördernde Reaktionen vermitteln, sind allgemein bekannt HMGB1-Rezeptoren. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass TLR4 und RAGE eine entscheidende Rolle bei Magengeschwür Heilung spielen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen über die Entzündungsreaktionen durch HMGB1 induziert. Eines der etablierten Modelle der Interaktion zwischen HMGB1 und diese Rezeptoren beteiligt ist I-R-Schaden. In der Leber I-R Verletzung zeigte TLR4-defizienten Mäusen weniger Leber I-R Schaden; der Schaden in TLR4-defizienten Mäusen wurde nicht von rHMGB1 oder Anti-HMGB1-Antikörper [26] betroffen. Darüber hinaus blockiert RAGE geschützt gegen hepatozelluläre Tod und Nekrosen in der Leber-I-R-Schaden-Modell [57]. In einem Modell von Herz I-R-Schaden, der Andrassy et al. Herz-I-R Verletzung zeigte, dass RAGE-defiziente Mäuse aus nur leichte Entzündung angezeigt; Die Entzündung wurde durch die Induktion von rHMGB1 [27] berührt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die TLR4-HMGB1 und RAGE-HMGB1 Interaktionen eine entscheidende Rolle bei der I-R Verletzung spielen, obwohl es notwendig ist, um die Unterschiede in jedem Organ zu betrachten. Das andere etablierte Modell ist eine systemische Entzündung, wie Sepsis [5,8,58]. In einem experimentellen Modell der intra-abdominalen Sepsis, Susa et al. gezeigt, dass die Interaktion HMGB1-RAGE eng mit Sepsis-induzierten Zwerchfell Dysfunktion [58] verbunden war. In einem in vivo-Modell systemische Entzündung, die durch Injektion von exogenen HMGB1, Zoelen et al. gezeigt, dass HMGB1 die Freisetzung von Zytokinen, Aktivierung der Koagulation induziert, und Neutrophilen-Rekrutierung durch TLR4 und RAGE [8]. Somit wird durch die HMGB1-assoziierten Weg vermittelt TLR4 und RAGE spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese, einschließlich der Weg in unsere Heilung von Geschwüren Modell.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass TLR2 keine Beziehung zu Magengeschwür Heilung hat: Heilung Geschwür in TLR2 KO-Mäuse ähnelte, dass in Wildtyp-Mäusen. Obwohl in vitro Studien Makrophagenzelllinien angegeben, dass die Verwendung von TLR2-HMGB1 Stoffwechselweg Entzündungsreaktionen induziert [6,9], in vivo-Effekte von TLR2 in Pathologien HMGB1-vermittelten wurden nicht berichtet. Somit basiert auf früheren Ergebnissen [8] und unsere Ergebnisse kann der HMGB1-TLR2 Weg eine untergeordnete Rolle bei der Reparatur und Pathogenese von Gewebeverletzungen und Entzündungen spielen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass HMGB1 ist ein erschwerender Faktor bei der Heilung von Magengeschwüren sowie in anderen pathologischen Zuständen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass HMGB1 Heilung von Geschwüren durch einen Mechanismus hemmt, die TLR4, RAGE und übermäßige Entzündungsreaktionen verbunden ist. Obwohl Proton Pomp-Hemmer häufig für Magengeschwüren verschrieben werden, stellen hartnäckige Geschwüre noch ein klinisches Problem. Unsere vorliegende Studie unterstützt ein neues Konzept für die Behandlung von hartnäckigen Magengeschwüren, neben Proton Pomp-Hemmer-Therapie.

Acknowledgments

Wir danken Emi Suzuki-Yoshioka für technische Unterstützung. Ich möchte auch meinen aufrichtigen Dank an die Mitarbeiter der Osaka City University zum Ausdruck bringen, die uns unterstützt.

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