PLoS ONE: Høy Mobility Gruppe Box en hemmer magesår Healing gjennom Toll-like receptor 4 og Reseptor for Advanced Glycation End Products

Abstract

Høy mobilitet gruppeboksen 1 (HMGB1) ble først oppdaget som en nuclear protein som interagerer med DNA som en kromatin-tilhørende ikke-histon-proteinet for å stabilisere nukleosomer og for å regulere transkripsjonen av mange gener i cellekjernen. Når lekket eller aktivt skilles ut i ekstracellulære miljøet, aktiverer HMGB1 provoserende trasé ved å stimulere flere reseptorer, inkludert Toll-like receptor (TLR) 2, TLR4, og reseptor for avanserte glykerte endeprodukter (RAGE), som fører til vevsskade. Selv HMGB1 evne til å indusere betennelse har vært godt dokumentert, har ingen studier undersøkt hvilken rolle HMGB1 i sårheling i mage-feltet. Målet med denne studien var å vurdere rollen til HMGB1 og dets reseptorer i helbredelsen av magesår. Vi har også undersøkt hvilke reseptor blant TLR2, TLR4, eller RAGE medierer HMGB1 effekter på sårtilheling. Magesår ble indusert av serøse anvendelse av eddiksyre i mus, og mage vev ble behandlet for videre evaluering. Induksjon av sår økte immunhistokjemisk farging av cytoplasmisk HMGB1 og forhøyede serumnivåer HMGB1. Sår størrelse, myeloperoxidase (MPO) aktivitet, og uttrykk for tumornekrosefaktor α (TNF-alfa) mRNA toppet seg på dag 4. intraperitoneal administrering av HMGB1 forsinket sårtilheling og forhøyet MPO aktivitet og TNFa uttrykk. I motsetning til dette administrering av anti-HMGB1 antistoff fremmet sårtilheling og redusert MPO aktivitet og TNFa ekspresjon. TLR4 og RAGE mangel forbedret sårtilheling og redusert nivå av TNFa, mens sårtilheling i TLR2 knockout (KO) mus var lik som i villtype mus. I TLR4 KO og RAGE KO mus, gjorde eksogene HMGB1 ikke påvirke sårtilheling og TNFa uttrykk. Dermed viste vi at HMGB1 er en kompliserende faktor i magesår helbredelsesprosessen, som virker gjennom TLR4 og RAGE å indusere dreven inflammatoriske responser.

Citation: Nadatani Y, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, et al. (2013) High-Mobility Gruppe Box 1 hemmer magesår helbredelse gjennom Toll-like receptor 4 og Reseptor for Advanced Glycation sluttprodukter. PLoS ONE 8 (11): e80130. doi: 10,1371 /journal.pone.0080130

Redaktør: Mathias Chamaillard, INSERM, Frankrike

mottatt: 29. mai 2013; Godkjent: 30 september 2013; Publisert: 11.11.2013

Copyright: © 2013 Nadatani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

Konkurrerende interesser:. Kenji Watanabe - Grant /forskningsstøtte fra Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., Ltd .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Snakker og Undervisning: Abbott Japan Co., LTD. Yasuhiro Fujiwara - Snakker og Undervisning: Eisai Co Ltd Tetsuo Arakawa - Advisory Committees eller anmeldelse Panels: Eisai Co Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co Ltd De andre forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.

Innledning

Høy mobilitet gruppeboksen protein 1 (HMGB1), et medlem av høy- mobilitet gruppe protein super, er en kjernefysisk protein [1]. HMGB1 interagerer med DNA som en kromatin-assosiert nonhistone proteinet for å stabilisere nukleosomer og for å regulere transkripsjonen av mange gener i cellekjernen [2]. Når lekket fra en celle i løpet av nekrotisk celledød [3] eller aktivt utskilt i det ekstracellulære miljøet ved hjelp av monocytter og makrofager [3,4], HMGB1 virker som en alarmin med potente proinflammatoriske egenskaper [5].

De beste studert HMGB1 reseptorene er Toll-like receptor (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], og reseptor for avanserte glycation end produkter (RAGE) [6,8]. TLR2 og TLR4 er medlemmer av TLR familien, og de spiller en avgjørende rolle i medfødte immunresponser til patogen-forbundet molekylære mønstre og skade-forbundet molekylær mønster molekyler [10]. TLR2 gjenkjenner primært komponenter av gram-positive bakteriecellevegg, og TLR4 gjenkjenner primært lipopolysakkarid, som er den største celleveggkomponent av gram-negative bakterier. Utløsing TLR2 og TLR4 signalveier som fører til aktivering av nukleær faktor KB (NF-kB), gjennom tilbehøret protein MyD88, og den etterfølgende regulering av immun- og inflammatoriske gener, inkludert inflammatoriske cytokiner slik som tumornekrosefaktor α (TNF-alfa), med aktivering av mitogenaktiverte proteinkinaser [11-13]. Reseptor for avanserte glykerte endeprodukter (RAGE) er et multi-ligand-reseptor som tilhører immunglobulin super [14]. Andre kjente RAGE ligander inkluderer amyloid [15] og S100 [16]. Flere forsøk har antydet at den ligand-interaksjon RAGE også aktiverer NF-kB og mitogenaktiverte proteinkinaser [17-20].

Mange patologiske tilstander er knyttet til proinflammatoriske egenskaper HMGB1. Tidligere rapporter har vist at HMGB1 spiller en kritisk rolle i endotoksemi [21], akutt pankreatitt [22], akutt lungesviktsyndrom [23], noen autoimmune sykdommer [24], cerebral ischemi skade [25], og iskemi-reperfusjon (IR) skader på leveren [26], hjerte [27], og nyre [28]. Med hensyn til mage-tarmkanalen, er HMGB1 en kompliserende faktor i eksperimentell kolitt [29,30], og ikke-steroid antiinflammatorisk legemiddel-indusert intestinal liten skade [31].

I dag er den rolle HMGB1 i sårheling er uklar, selv om dens evne til å indusere inflammasjon er vel dokumentert, som beskrevet ovenfor. I mage-feltet, har ingen studie undersøkt rollen til HMGB1 i sårheling. Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle HMGB1 i magesår helbredelse. Vi har undersøkt rollen til HMGB1 i helbredelsesprosessen ved hjelp av en etablert eksperimentelt kronisk magesår modell laget i gnagere ved topisk påføring av eddiksyre fra mave serosale side. Modellen etterligner menneske peptic magesår i histologi og morfologi [32]. Vi undersøkte også om HMGB1 påvirker sårtilheling gjennom TLR2, TLR4, eller RAGE.

Materialer og metoder

Dyr

TLR2- og TLR4-knockout (KO) mus, som opprinnelig ble generert av Dr. S. Akira (Osaka University, Osaka, Japan ) og backcrossed 8 ganger på en C57BL /6 bakgrunn ble oppnådd fra Oriental Bioservice, Inc. (Kyoto, Japan). RAGE-KO mus, som hadde blitt backcrossed på en C57BL /6 bakgrunn, ble opprinnelig generert av og en gave fra Dr. Y. Yamamoto (Kanazawa Medical University, Kanazawa, Japan). Villtype C57BL /6 mus ble kjøpt fra Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Japan) som kontroll påkjenning for TLR2 KO, TLR4 KO, og raseri KO mus. Spesifikke patogenfrie 12-ukers gamle hann dyr ble anvendt. Alle dyr ble huset i polykarbonat bur med papir chip senger. Burene ble plassert i en luftkondisjonerte biohazard rom med en 12-timers lys-mørke-syklusen. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Animal Care komité i Osaka City University Graduate School of Medicine (Permit Number: 11006). Alle operasjoner ble utført under isofluran, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte.

Ulcer Experimental Induksjon av

Magesår ble indusert ved en metode som er beskrevet i detalj et annet sted [33], med mindre modifikasjoner . Kort beskrevet under eterbedøvelse, de underlivet til dyrene ble skåret opp, og magen ble eksponert. En polypropylen-rør (4 mm i diameter) ble plassert mot den serosale side av magen. En 80 pl alikvot av 60% eddiksyre ble tilsatt til røret, som ble holdt i kontakt med den serosale overflate i 30 sek. Etter umiddelbar fjerning av eddiksyre fra røret ved aspirasjon, ble magen returnert til sin opprinnelige posisjon, og magen ble lukket. Tidligere rapporter har vist at størrelsen av magesår nådde et maksimum på dag tre eller fire etter sår induksjon, og deretter, gradvis redusert [32,34]. Den helbredende fasen av den eksperimentelle magesår starter på dag 4 etter sår induksjon

eksperimentelle grupper

For å undersøke effekten av eksogene HMGB1, mus fikk intraperitoneale injeksjoner av humant rekombinant HMGB1 (rHMGB1;. 100 -1000 ug /kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller bærer (fosfat-bufret saltvann) to ganger daglig, begynnende ved 4 dager etter induksjon sår (fra dag fire til dag 9).

Deretter effekten av immunoneutralization av HMGB1 på magesår helbredelse ble vurdert. Mus ble administrert intraperitonealt nøytraliserende anti-kylling HMGB1 polyklonalt antistoff (5 mg /kg; Shino Test-Corporation, Tokyo, Japan) eller normale kylling IgY (5 mg /kg; Sigma-Aldrich Co.) begynnende ved 4 dager etter induksjon sår ( fra dag 4 til dag 9). Dessuten, for å bekrefte effekten av frigivelse av en inhibitor av HMGB1, ble etyl-pyruvat eller bærer injisert to ganger daglig, begynnende på dag 4 etter sår induksjon.

Videre, for å bestemme reseptoren ansvarlig for HMGB1 relaterte magesår healing, magesår ble indusert i TLR2 KO, TLR4 KO, og raseri KO mus med eller uten intraperitoneal injeksjon på 1000 mikrogram /kg av rHMGB1 to ganger daglig med start på dag 4 etter sår induksjon.

Magen ble fjernet og sår Størrelsen ble målt på dag 6 eller 9 etter sår induksjon. Sår størrelse ble uttrykt som en sårindeks, produktet av maksimal lengde og minimale lengden (dvs. maksimal lengde ble multiplisert med minimumslengde). Studier ble utført ved anvendelse av 4-8 prøver. Prøvene av gastrisk vev ble behandlet for videre evaluering.

mRNA uttrykk av inflammatoriske mediatorer i Gastric Tissue Avgjøres etter Real-time kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

Real- tid kvantitativ RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [35]. I korte trekk, ble total RNA isolert fra tarmvevet ved anvendelse av et kit ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan) ifølge produsentens protokoll. Komplementær DNA ble kjøpt ved hjelp av en høy kapasitet RNA-til-cDNA Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. Sanntids kvantitative RT-PCR analyser ble utført ved hjelp av et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system og programvare (Life Technologies Corporation). Reaksjonsblandingen ble fremstilt i henhold til produsentens protokoll ved hjelp av TaqMan PCR Fast Universal Master-blanding (Life Technologies Corporation). Termisk sykling var som følger: 45 sykluser med amplifisering ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Totalt RNA ble underkastet sanntid kvantitativ RT-PCR for måling av målgener ved hjelp av TaqMan glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase kontroll reagenser (Life Technologies Corporation), som ble anvendt som en intern standard. Ekspresjonen av mRNA som koder for HMGB1, ble TLR4, RAGE, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interleukin-1-beta (IL-1β), og TNFa i sårdannelse og normal gastrisk vev kvantifisert ved anvendelse av sanntids RT-PCR og standardisert til glyceraldehyd -3-fosfat dehydrogenase mRNA nivåer. Ekspresjonen av hvert mRNA er angitt som et forhold i forhold til den midlere verdi i normal gastrisk vev. De primere og prober som brukes for RT-PCR er vist i tabell 1.
Gene
Primer og Probe
TNF-αPrimer (fremover) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Fremover) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Fremover) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Fremover) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (revers) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (fremover) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Fremover) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (revers) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (fremover) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (revers) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. primere og prober.
CSV ned CSV

Immunhistokjemisk og immunfluorescens Farging

Vevsprøver ble fikset med 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 4% paraformaldehyd. Prøvene ble dyppet i parafin, og serie 5-mikrometer tykke seksjoner ble montert på silanerte lysbilder (Dako, Tokyo, Japan). Prøvene ble neddykket i en løsning av 3% H _{2o 2 i absolutt metanol i 5 minutter for å inhibere endogen peroksidaseaktivitet og deretter inkubert i 5% skummet melk i 10 min. Hematoxylin og eosin-farging ble utført for de morfologiske observasjoner. En kanin monoklonalt anti-HMGB1 antistoff (fortynnet 1: 250, Abcam, Cambridge, MA) ble påført som det primære antistoff og inkubert over natten ved 4 ° C med prøvene. Et sekundært antistoff (Histofine Simple Stain MAX Peroxidase kit; Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) ble inkubert med prøvene i 1 time i henhold til produsentens instruksjoner. Immunoreaktivitets ble visualisert ved å behandle seksjonene med Histofine Simple Stain og diaminobenzidin løsning (Nichirei Biosciences Inc.). Prøvene ble deretter motfarget med hematoksylin. Deretter ble TLR2, TLR4 og RAGE uttrykk bestemmes av en immunfluorescens metode. De primære antistoffene anvendt i immunofluorescens-farging inkludert et mus monoklonalt antistoff mot TLR2 (fortynnet 1: 200; Abcam), et mus monoklonalt antistoff mot TLR4 (fortynnet 1: 200; Abcam), og et rotte monoklonalt antistoff mot RAGE (fortynnet 1: 250; Abcam). Vevsprøver, som ble fremstilt som beskrevet ovenfor, ble inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer og deretter omsatt med de tilsvarende fluorescerende fargestoff-konjugerte sekundære antistoffer (Abcam) i 2 timer. Prøvene ble undersøkt med en konfokalmikroskop utstyrt med argon og argon-krypton laserkilder.}

Måling av serum HMGB1 Levels

Blood (1000 mL) Prøver ble tatt i serum separator rør av hjertestans punktering. Etter sentrifugering ved 3000 rpm i 10 minutter ble serum oppsamlet og lagret ved -80 ° C. Serumnivåene til HMGB1 ble målt ved anvendelse av en HMGB1 sandwich-ELISA-sett (Shino Test-Corporation) i henhold til produsentens protokoll.

Måling av Myeloperoxidase (MPO) Aktivitets

Metoder som brukes til å måle MPO aktivitet er beskrevet i detalj andre steder [36]. I korte trekk, ble prøvene homogenisert i 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0,5% heksadecyltrimetylammoniumbromid (Sigma Chemical Co.). Suspensjonene ble sentrifugert, og MPO aktivitet i den resulterende supernatant ble bestemt med et spektrofotometer. En enhet av MPO-aktivitet ble definert som den mengde enzym som nedbrytes 1 umol peroksyd /min ved 25 ° C. Resultatene er uttrykt som enheter per gram av gastrisk vev.

Statistical Analysis

Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å teste betydningen av forskjellene mellom behandlingsgruppe betyr, og resultatene ble analysert med Fishers beskyttede minste signifikante forskjell-test. P-verdier som er mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Tid Løpet av magesår Healing

For å evaluere den helbredende prosessen med magesår, ble eksperimentelt magesår indusert ved lokal applikasjon av eddiksyre fra mage serøse side . De sår ble evaluert mikroskopisk (figur 1A, 1B) og makroskopisk. Størrelsen av sårene nådde et maksimum på dag 4 og redusert over tid deretter (figur 1C). MPO aktivitet (figur 1D) og ekspresjon av TNFa (figur 1E) og IL-1β (figur 1E) mRNA i sårdannelse gastrisk vev også en topp på dag 4, og deres nivåer var høyere i sårdannelse vev enn i normal gastrisk vev i hele eksamensperioden. Sår også forhøyet uttrykk av VEGF mRNA (figur 1F).

HMGB1 Expression følgende Sår

Vi har evaluert ved om HMGB1 var involvert i magesår helbredelse. HMGB1 mRNA nivåer i mage vev (figur 2A) og serumnivåer av HMGB1 (figur 2B) nådde sitt maksimum på dag 4. HMGB1 mRNA nivåer var nesten konstant i eksamensperioden, mens serumnivåene av HMGB1 falt til normalt nivå 6 dager etter induksjon av sår. Immunhistokjemisk, sårdannelse fremkalt fremtredende cytoplasmisk farging av HMGB1 i epitelceller, spesielt i skadede områder (figur 2C, 2D). I motsetning til dette, i intakte gastriske slimhinne, ble HMGB1 lokalisering begrenset til innenfor kjernen av epiteliale celler (figur 2E).

Effekter av eksogene HMGB1, HMGB1 Immunoneutralization, og Hemming av HMGB1 versjonen på magesår Healing

mRNA uttrykk og MPO aktivitet ble undersøkt på dag 6, og sår indeksen ble evaluert på dag 9, i henhold til den tidsforløpsstudium. Mus ble administrert rHMGB1 eller anti-antistoff HMGB1 intraperitonealt etter induksjon av sår. Administrering av rHMGB1 i en dose på enten 100 ug /kg eller 1000 pg /kg undertrykte betydelig magesår helbredelse (figur 3A), som var assosiert med øket MPO aktivitet (figur 3B) og TNFa-mRNA-ekspresjon i sårdannelse vev (Figur 3C). I motsetning til dette, HMGB1 nøytraliserende antistoffer som markedsføres sårtilheling (figur 4A) med redusert MPO aktivitet (figur 4B) og TNFa mRNA ekspresjon (figur 4C). Den kompliserende effekten av eksogent rHMGB1 på magesår helbredelse ble avbrutt ved samtidig administrering av anti-HMGB1 antistoff (Figur 4F). Ekspresjon av VEGF mRNA ble ikke påvirket av behandling med enten rHMGB1 (figur 3D, 3E) eller anti-HMGB1-antistoff (figur 4D, 4E). I normal mage vev, administrasjon av rHMGB1 eller anti-HMGB1 heller ikke har noen effekt på cytokin uttrykk eller MPO aktivitet (data ikke vist). Videre har administrasjon av etyl-pyruvat, en inhibitor av HMGB1 frigivelse, markant fremmet sårtilhelingen, sammenlignet med bærer-behandling. Healing ble ledsaget av undertrykkelse av TNFa mRNA uttrykk (data ikke vist).

rolle TLR2, TLR4, og RAGE i magesår Healing

For å undersøke om TLR2, TLR4, og RAGE bidra til HMGB1-mediert magesår helbredelse, ble forsøks magesår indusert i TLR2 KO, TLR4 KO, RAGE KO, og kontroll villtype mus. TLR4 og RAGE mangel fremmet magesår formasjon og forhindret økningen i TNFa mRNA uttrykk etter sårdannelse, mens TLR2 mangel påvirket verken sår indeksen heller ikke uttrykk for TNFa mRNA (Figur 5A, 5B). Administrasjon av eksogent HMGB1 påvirket verken sår indeksen heller ikke uttrykk for TNFa mRNA i enten TLR4 KO eller raseri KO-mus (figur 5C-5F). Administrasjon av eksogent HMGB1 imidlertid forsinket sårtilheling i villtype-mus og redusert TNFa mRNA ekspresjon (figur 3).

Uttrykk for TLR2, TLR4 og RAGE under magesår Healing

Vi neste undersøkt mRNA uttrykk og immunoreaktivitets av TLR2, TLR4 og RAGE i villtype mus. En betydelig oppregulering av TLR2 mRNA ble observert etter induksjon av et sår (figur 6A). TLR2 immunoreaktivitets ble observert hovedsakelig i inflammatoriske celler (Figur 6b). Ekspresjon av TLR4 mRNA ble ikke påvirket av induksjon av sår (figur 6C). TLR4 immunoreaktivitet ble observert i den apikale delen av epitelbelegg på sår kant og i noen inflammatoriske celler i sår seng (figur 6D).

En betydelig oppregulering av RAGE-mRNA ble observert på dag 9 etter induksjon av sår (figur 6E). RAGE immunoreaktivitets ble observert hovedsakelig i betennelsesceller på kanten av sår senger og i den vaskulære endotelceller membran (Figur 6F).

Farging av sårdannelse vev fra TLR4 KO eller raseri KO mus med et anti-TLR4 antistoff eller anti-RAGE-antistoff, respektivt, viste ingen positive signaler, noe som bekrefter spesifisiteten av disse antistoff (data ikke vist).

Diskusjoner

I denne studien, viste vi at eksogene HMGB1 forsinkelser magesår helbredelse, mens indusere TNFa uttrykk og MPO aktivitet. Motsatt immunoneutralization av HMGB1 eller hemme frigjøring av HMGB1 fremmer sårtilheling samtidig redusere TNFa uttrykk og MPO aktivitet. I tillegg TLR4 og RAGE mangel fremmer sårtilheling, og eksogene HMGB1 unnlater å forsinke sårtilheling i TLR4 KO og raseri KO mus. Disse resultatene tyder på at HMGB1 er en kompliserende faktor for magesår helbredelse som virker gjennom TLR4- og raseri-avhengige veier. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten for å avklare hvilken rolle HMGB1 i sårheling i mage-tarmkanalen.

Noen få studier rettet rolle HMGB1 i sårheling i andre enn mage-tarmkanalen organer, men resultatene av disse studiene er kontroversielle [37-40]. I samsvar med våre resultater, noen studier vist at HMGB1 har en hemmende effekt på sårtilheling [37,38]. Zhang et al. viste at HMGB1 svekker snittet sårtilheling ved å redusere reparerende kollagen deponering via RAGE [37]. Goova et al. demonstrert at blokkering av RAGE-ligander som alder og HMGB1 ved hjelp av en løselig form av reseptoren for AGE (sRAGE), akselererer sårtilheling og undertrykker nivåene av inflammatoriske cytokiner [38]. Tidligere studier har vist at overdreven betennelse svekket sårheling. For eksempel, vår tidligere studie viste at TNFa over-uttrykk og overdreven nøytrofile infiltrasjon er kompliserende faktorer i dannelsen og helbredelse av magesår [41]. Videre, i en annen modell for vevsreparasjon, Goren et al. viste at overdreven neutrofil og makrofag infiltrering med TNFa over-ekspresjon hindrer helbredelse av mus hudskader [42]. Dermed er det mulig at HMGB1 forsinker magesår helbredelse gjennom TNFa-utløst inflammatoriske responser.

I motsetning til enkelte in vitro-studier antydet at HMGB1 og dets reseptorer er avgjørende for sårheling [39,40]. Staraino et al. viste at HMGB1 akselererer sårheling og regenerering prosessen ved å øke migreringen av hud-fibroblaster og keratinocytter [39]. HMGB1 også fremmer sårheling av 3T3 fibroblaster ved indusering av celle proliferasjon og migrasjon gjennom aktivering av RAGE /ekstracellulære signalregulerte kinasereaksjonsveien [40]. Fordi disse in vitro-undersøkelser ble utført i fravær av inflammatoriske celler, kan forskjellene i eksperimentelle metoder resulterer i inkonsekvent konklusjoner på rollen til HMGB1 i sårheling.

VEGF, en potent angiogen vekstfaktor, spiller en viktig rolle i magesår helbredelse [43,44]. Tidligere rapporter viste at HMGB1 kan indusere ekspresjon av VEGF i flere vev og dyremodeller [45-47]. Men i denne studien, verken rHMGB1 eller anti-HMGB1 antistoffer påvirket VEGF uttrykk i ulcerøs vev. Årsaken til forskjellen mellom våre funn og de av tidligere forskere er ikke klar, men det kan være forbundet med bruk av forskjellige organer og eksperimentelle modeller.

Det er 2 mulige kilder til ekstracellulære HMGB1: passiv utgivelse fra nekrotiske celler [48] og aktiv sekresjon fra inflammatoriske celler [5]. I denne studien ble HMGB1 immunreaktivitet observert i cytoplasma og cellekjernen, noe som tyder på at nekrotiske celler er en kilde til HMGB1. Gastric HMGB1 mRNA nivåer økte i løpet sårtilheling, noe som tyder på at betennelsesceller produsere og frigjøre HMGB1. Kollektivt, heving av serum HMGB1 resulterte skyldes passiv utgivelse fra skadde celler ved magesår og aktiv sekresjon fra betennelsesceller.

Serum HMGB1 nivåene økte ved induksjon av magesår, men falt i sen fase av healing, selv om uttrykket av HMGB1 og TNFa holdt seg høy. Disse dataene øke muligheten for en systemisk HMGB1 fangstsystem. For å oppnå dette, har eksistensen av en HMGB1 bindende protein blitt rapportert. Trombomodulin, et celleoverflate-glykoprotein, er ett eksempel på en HMGB1 bindende protein. Rekombinant humant løselig trombomodulin hemmet økningen i plasma HMGB1 indusert av lipopolysakkarid i en rottemodell [49] og bundet til HMGB1 gjennom sitt lectin domene [50] for å hindre HMGB1 fra samspill med andre reseptorer [51]. I kliniske applikasjoner, er trombomodulin også nyttig i HMGB1 relaterte sykdommer og tilstander som sepsis på grunn av sin anti-HMGB1 egenskaper [52]. sRAGE, som finnes i sirkulasjon, er et annet eksempel på en HMGB1 bindende protein. sRAGE er løselig form av RAGE; det fungerer som en lokkedue for å forhindre interaksjon mellom celleoverflaten RAGE og dets ligander, slik HMGB1 [53]. I denne studien, kan slike fangstsystemer også spille en beskyttende rolle i å forebygge spredning av betennelse, og dermed fremme sårtilheling.

Det er kjent at mange magesår pasienter er smittet med Helicobacter pylori
. Selv om det i denne studien vi ikke undersøke hvilken rolle HMGB1 i magesår helbredelse i mus infisert med H. pylori
, kliniske og eksperimentelle studier tyder på at den skadelige effekten av HMGB1 på magesår helbredelse ville være mer uttalt hos pasienter med en H. pylori
smitte enn hos de uten. Vi har tidligere vist at H. pylori
infeksjon øker nøytrofile infiltrasjon i sårdannelse vev i mongolske ørkenrotte [54]. Shimizu et al. også vist at nøytrofile granulocytter og makrofager infiltrere sår marginer i større grad hos pasienter med H. pylori
smitte enn i de uten infeksjon [55]. En stor mengde HMGB1 er derfor sannsynlig er tilstede i sårdannelse vev infisert med H. pylori
, siden det ville bli utskilt av disse inflammatoriske celler. Videre Radin et al. rapportert at Vaca, en stor virulens faktor på denne organismen, fører programmert nekrose av mage epitelceller og påfølgende utslipp av HMGB1 [56]. Derfor forventer vi at skadelig for HMGB1 på sårtilheling ville være mer fremtredende i H. pylori
-infected pasienter.

TLR2, TLR4, og RAGE, som formidler proinflammatoriske reaksjoner, er allment kjent HMGB1 reseptorer. Våre resultater viste tydelig at TLR4 og RAGE spille viktige roller i magesår helbredelse. Dette resultatet er i tråd med tidligere funn på de inflammatoriske responser som induseres av HMGB1. En av de mest etablerte modeller som involverer samvirket mellom HMGB1 og disse reseptorene er I-R-skade. Lever I-R skade, TLR4-mangelfull mus viste mindre lever I-R skade; skaden i TLR4-manglende mus ble ikke påvirket av rHMGB1 eller anti-HMGB1 antistoff [26]. Videre blokkerer RAGE beskyttet mot lever død og nekrose i lever I-R skade modell [57]. I en modell av kardial I-R-skade, Andrassy et al. viste at RAGE-mangelfull mus vises bare liten betennelse som følge av hjertestans I-R skade; betennelsen ble ikke påvirket av induksjon av rHMGB1 [27]. Disse funnene tyder på at TLR4-HMGB1 og raseri-HMGB1 interaksjoner spiller en avgjørende rolle i I-R skade, selv om det er nødvendig å vurdere forskjellene i hvert organ. Den andre etablerte modell er systemisk inflammasjon, slik som sepsis [5,8,58]. I en eksperimentell modell av intra-abdominal sepsis, Susa et al. viste at HMGB1-RAGE interaksjon var nært forbundet med sepsis-indusert magen dysfunksjon [58]. I en in vivo-systemisk inflammasjon modell generert ved injeksjon av eksogene HMGB1, Zoelen et al. viste at HMGB1 induserer frigjøring av cytokiner, aktivering av koagulering, og nøytrofile rekruttering gjennom TLR4 og RAGE [8]. Dermed TLR4 og RAGE spiller avgjørende roller i patogenesen mediert av HMGB1-assosiert vei, herunder sti i vår sårtilheling modell.

Våre resultater tyder på at TLR2 har noe forhold til magesår helbredelse: sårtilheling i TLR2 KO mus lignet at i villtype mus. Selv om in vitro-studier med makrofagcellelinjer indikerte at TLR2-HMGB1 veien induserer inflammatoriske responser [6,9], in vivo effekter av TLR2 i HMGB1-mediert patologi har ikke blitt rapportert. Dermed er basert på tidligere funn [8] og våre resultater kan HMGB1-TLR2 pathway spiller en mindre rolle i reparasjon og patogenesen av vev skader og betennelser.

I konklusjonen, har vi vist at HMGB1 er en kompliserende faktor i helbredelsesprosessen av magesår så vel som i andre patologiske tilstander. Videre har vi vist at HMGB1 hemmer sårtilheling gjennom en mekanisme som involverer TLR4, RAGE, og overdreven inflammatoriske responser. Selv proton Pumper hemmere blir ofte foreskrevet for magesår, vanskelige sår fortsatt utgjør en klinisk problem. Vår nåværende studie støtter et nytt konsept for behandling av uregjerlige magesår, foruten proton Pumper hemmere terapi.

Takk

Vi takker Emi Suzuki-Yoshioka for teknisk assistanse. Jeg vil også gjerne uttrykke min oppriktige takknemlighet til de ansatte i Osaka City University som støttet oss.

• PLoS ONE: Mangiferin reduserer magesår i iskemi /reperfunderes Rats: Involvering av PPAR-γ, NF-kB og Nrf2 /HO-1 signalveier
• PLoS ONE: Ingen Association of Coffee Forbruk med magesår, duodenalsår, refluksøsofagitt, og ikke-Erosive reflukssykdom: En tverrsnittsundersøkelse av 8,013 friske personer i Japan