Противомикробные деятельность эвенгол и коричный против человеческого желудка патоген Helicobacter Pylori

Противомикробные деятельность эвенгол и коричный против патогена желудка человека Helicobacter Pylori

Аннотация
Фон
искоренение Helicobacter Pylori
является важной задачей в преодолении заболеваний желудка. Многие схемы лечения в настоящее время доступны, но ни один из них не смог достичь 100% успеха в деле искоренения. Эвгенол и коричный, которые обычно используются в различных пищевых продуктах, как известно, обладают антимикробной активностью в отношении широкого спектра бактерий.
Цель
Настоящее исследование было проведено с целью оценки экстракорпорального
эффекты в эвгенола и коричный против коренных и стандарт H. Pylori
штаммов, их минимальные ингибирующие концентрации (МИК) и временной ход летальных эффектов при различных рН.
Методы
в общей сложности 31 штаммов (29 коренных и один стандартный штамм H. Pylori
АТСС 26695, подвергали скринингу один штамм кишечной палочки
NCIM 2089). Агар метод разведения был использован для определения образцов лекарственной чувствительности изолятов к широко используемым антибиотикам и бульона методом разбавления для испытуемых соединений.
Результаты
эвгенол и коричный ингибирует рост всего 30 хеликобактерной <бр> штаммов, при концентрации 2 мкг /мл, в 9-м и 12-часовой инкубации соответственно. При кислотном рН, наблюдалось повышение активности для обоих соединений. Кроме того, организм не складывалось никакого сопротивления по отношению к этим соединениям, даже после того, как 10 путепроводов выращивали при суб-ингибирующие концентрации.
Заключение
Эти результаты указывают на то, что оба биологически активных соединений протестированные может предотвратить антихеликобактерную
рост
пробирке, без приобретения какого-либо сопротивления.
Введение
хеликобактерной
был впервые обнаружен в 1982 году и впоследствии было установлено, что является важным этиологическим агентом гастрита [1], язвенной болезни [2] и желудка злокачественности [3]. Предполагается, что одна половина населения земного шара инфицирована H. Pylori
[4]. Многочисленные клинические свидетельства показывают, что искоренение H. Pylori
приводит к улучшению гастрита и резко снижает скорость рецидива язвы желудка и двенадцатиперстной кишки [5, 6]. H. Pylori
ставки перевозки находятся в развивающихся странах [7] около 80-90%, с высоким риском развития рака желудка и режимов антибиотикотерапии против H. Pylori
часто неэффективны в таких популяциях [8]. Кроме этого, нежелательные побочные эффекты [9], несоблюдением среди пациентов [10] и стоимости схем антибиотикотерапии [11], есть несколько других факторов для их неэффективности. Следовательно, существует необходимость в разработке альтернативных подходов к подавлению /лечения инфекции.
С древних времен, специи и приправы были рассмотрены незаменимым в кулинарном искусстве, так как они используются для придания вкуса пищи. Кроме того, эти специи были признаны за их физиологических и лечебных свойств. Предполагается, что эффективность широкого спектра действия этих специй [12-14] может обеспечить подходящую основу для новых H. Pylori
терапии анти. Некоторые из эпидемиологических исследований предполагают обратную зависимость между раком встречаемости желудка (для которых H. Pylori
инфекции является известным фактором риска) и потребление из Allium овощей [15, 16]. Есть сообщения о в пробирке
противомикробной активности многих экстрактов пряностей (а не их активные принципы) на H. Pylori
[17, 18]. Но активные принципы чеснока и чеснока компонентов были опробованы [11, 19].
Эвгенол, фенольное соединение является основным компонентом гвоздика (Eugenia caryophillis
) масло. Коричный альдегид представляет собой ароматический альдегид и главным компонентом экстракта коры корицы (корица
). Оба эти соединения присутствуют в эфирных масел многих растений и оказались активны в отношении многих патогенных бактерий [20, 21], грибы [21, 22] и вирусы [14]. Существует нехватка информации о воздействии этих биологически активных соединений на хеликобактерной
. Таким образом, настоящее исследование было проведено с целью оценки эффективности эвгенола и коричный как H. Pylori
противораковых агентов.
Материалы и методы
H. Pylori
штаммы
Тридцать H. пилори <бр> штаммы и одна кишечная палочка
штамма (NCIM2089) были использованы в исследовании. Двадцать девять штаммов, которые были назначены в качестве МС-1 до MS-29 были выделены из образцов желудочной биопсии (15 из двенадцатиперстной кишки, 10 от неязвенной диспепсии и 4 из желудка субъектов язва), после информированного согласия от пациентов, перенесших верхних отделов желудочно эндоскопии в Декан колледжа медицинских наук, Хайдарабад, Индия. был также включен один штамм хеликобактерной
(ATCC26695)
Первичная изоляция была выполнена на Brucella агар (Becton, Dickinson &Amp; Co, Sparks, США)., с добавлением 7% (V /V) с овечьей кровью и антибиотики (ванкомицин, 6 мг /л; Amphoteracin В, 3 мг /л; полимиксина B, 2500 МЕ /л; Привет-Медиа, Мумбаи, Индия). Окончательное значение рН сред доводили до 7,2. Г. пилори
идентифицировали по ее типичной морфологии колоний, окрашивания по Граму, микроаэрофильный роста при 37 ° С и с помощью других биохимических тестов, таких как оксидазы, каталазы и уреазы. Эти штаммы были сохранены при -80 ° C в бруцелл бульоне (Becton, Dickinson &Amp; Co, Sparks, США), содержащей 10% (V /V) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), и 20% (об /об) глицерина <бр.> биоактивные соединения
Коммерческие препараты биологически активных соединений, таких как эвгенол и коричный были использованы в наших экспериментах. Все штаммы высевали на агар Brucella, дополненного 7% овечьей крови, и выращивали в течение 48 часов в условиях микроаэробных. Бактериальный рост был собран из пластинок и ресуспендировали в стерильном солевом растворе. Посевной материал готов содержать ~ 10 8 КОЕ /мл путем регулировки подвески, чтобы соответствовать Мутность стандарта Макфарлэнд диметиламино-4 [23].
Антибактериальную активность минимальных ингибирующих концентраций стандартным антибиотикам
(ССД) для антибиотики, такие как метронидазол, амоксициллин и кларитромицин определяли методом разведения в агаре, используя два раза увеличивает (от 0,016 до 256 мкг /мл) на Мюллера-Хинтона агар (MHA) пластины с добавлением 7% овечьей крови и инкубируют в течение 3-х дней при 37 ° C в микроаэрофильной кабинета. МИК определ ли как самую низкую концентрацию антибиотиков, ингибирующих видимого роста [24] с использованием ~ 10 6 КОЕ посевного материала.
Антибактериальную активность эвгенола и коричный
Первичный скрининг
Накопители на диффузии Кирби-Бауэра испытание восприимчивости используется для проверки активности биологически активных соединений на H. Pylori
. Посевной материал готовили, как описано ранее высевали на MHA, дополненной 7% крови овцы и биологически активного соединения дисков (получают путем загрузки соответствующих соединений в переменной концентрации на стерилизующего фильтра бумажных дисков) были помещены на пластинах со стерильным дозатором и инкубировали в микроаэробной атмосфере при температуре 37 ° с в течение 3-х дней.
минимальной ингибирующей концентрации (MIC) биологически активных соединений
Как не было установлено методом определения антибактериальной активности биологически активных соединений против H. Pylori
, два серийных кратном разбавлении эвгенола и коричного альдегида были сделаны в 5 мл Brucella приготовления бульона (рН-7) с 0,1% диметилсульфоксид (ДМСО, который повышает растворимость соединения) и дополненной 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Ватные подключен 25 мл конические колбы Brucella бульон, приготовленные, как описано выше, были привиты с H. Pylori
(~ 10 6 КОЕ /мл) [11]. Колбы инкубируют в течение 3-5 дней в микроаэрофильной шкафу при встряхивании при ~ 150 оборотов в минуту. После инкубации 100 мкл аликвоты среды наносились на чашках с агаром Brucella, дополненной 7% овечьей крови для определения жизнеспособных.
Время курс
Время жизнеспособности курс исследования биоактивных соединений были созданы таким же образом, поскольку указанные выше испытания MIC, но бульоны отбирали ежечасно в течение первых 4 ч, а затем снова на 6, 9, 12, 24, 48 и 72 ч, чтобы проверить количество жизнеспособных микроорганизмов. Г. пилори
ATCC26695 использовали в качестве посевного материала для исследования.
Для сравнения, известный антибиотик, такой как амоксициллин был использован и кишечной палочки
(NCIM2089) был использован в качестве стандартного бактериального контроля, за исключением H. Pylori
.
влияние биологически активных соединений на хеликобактерной
морфологии
Чтобы проверить действие биоактивных соединений по морфологии H. Pylori
, слайды были приготовлены из вышеуказанных образцов первого четыре часа, окрашивали Гимза и наблюдаемые при масляной иммерсии.
Измерение бактерицидной активности при кислом рН
эффекты рН на антибактериальных деятельности эвгенол и коричный были сделаны, как сообщалось ранее [25, 26]. Значение рН буфера доводили до 4,00 с использованием 100 мМ цитратного буфера (рН 5,2) с добавлением 10 мМ мочевины и рН доводили до 7,00 с помощью 10 мМ фосфатного буфера (рН 6,8). Г. пилори
ATCC26695 (~ 10 7 КОЕ /мл) засевали в к которым были добавлены различные концентрации соединений 5 мл среды с 0,1% ДМСО. Все колбы инкубировали при 37 ° С. Двадцать мкл образцов были взяты на 0, 15, 30 и 60 мин после инокуляции, чтобы перечислить количество жизнеспособных клеток.
Тест на развитие резистентности к биологически активных соединений
Исследовать развитие резистентности, пять штаммов, т.е. ATCC26695, МС-27 (чувствительный ко всем трем антибиотикам), МС-1 (устойчивые ко всем трем антибиотикам), МС-8 (устойчив к метронидазолу, кларитромицину и чувствительны к амоксициллину) и МС-15 (устойчив только к метронидазолу ), выращивали на агаре при подавляющей концентрации переводник (0,25 и 0,5 мкг /мл) эвгенола и коричного альдегида в течение 10 пассажей. Все эксперименты, указанные выше, повторяют три раза.
Результаты
антибактериальную активность против H. Pylori

МИК антибиотиков для H. Pylori
были определены. Штамм ATCC26695 был чувствителен (MIC &л; 0,016 мкг /мл) для всех трех препаратов тестируемых. Двадцать (66,7%) клинических изолятов (MS1-8, 10, 12, 14 - 17, 20, 23 - 26 и MS28) из нашей лаборатории были устойчивы к метронидазолу (MICS ≫ 8 мкг /мл), 2 (6,7%) клинических изолятов (MS1 &Amp; 8) были устойчивы к кларитромицину (МИК &GТ; 2 мкг /мл) и 1 (3,3%) клинический изолят (МС1) был устойчив к амоксициллину (MIC &GТ; 0,5 мкг /мл) [27] (табл 1) .table 1 Чувствительность H. Pylori
штаммов (п = 30) к различным антибиотикам
Антибиотик

Sensitive (% )

Сопротивление (%)

Диапазон (мкг /мл)

MIC27 (мкг /мл)

Метронидазол
10 (33,3)
20 (66,7)
&л; 0,5 - > 256
> 8
Кларитромицин
28 (93,3)
2 (6.7)
&л; 0,5 - > 256
> 2
Амоксициллин
29 (96,7)
1 (3.3)
&л; 0,5 - > 256
> 0,5
В предварительном скрининге, как соединения дали приблизительно 15 мм зоны ингибирования для всех клинических изолятов и стандартный штамм (H. Pylori
ATCC26695). Это в пробирке
Противомикробное действие биологически активных соединений, показали, что оба соединения были способны полностью ингибировать рост всех штаммов (как чувствительных &Amp; резистентный) при концентрации 2 мкг /мл. Для кишечной палочки
(NCIM-2089), MIC эвгенола и коричный составляла 1 мкг /мл.
Временной ход
Поскольку оба соединения были активны при концентрации 2 мкг /мл, мы исследовали убивая время кривой ход обоих соединений при различных концентрациях т.е. 1 мкг /мл, 2 мкг /мл и 4 мкг /мл. Эвгенол полностью ингибирует рост H. Pylori
ATCC 26695 на 2 мкг /мл концентрации в 9 часов инкубации. Рост был полностью ингибируется только в 6 часов, когда МИК раза больше (4 мкг /мл). Некоторое замедление роста наблюдалось в МИК 1 мкг /мл, где до 6 й час наблюдалось снижение ~ 1.6 Вход тогда после этого не было никакого эффекта соединения на бактерии (рисунок 1). Коричный альдегид тормозится ATCC26695 полностью на 2 мкг /мл в 12 часов и в 9 часов при двойном MIC (4 мкг /мл). Тем не менее, в половине MIC (1 мкг /мл), немного эффект наблюдался до 3 й час и наблюдалось снижение на 0,6 Вход с без последующего тормозящего действия (рисунок 1). Рисунок 1 Время исследования жизнеспособности курс эвгенола и коричный с хеликобактерной ATCC26695. ATCC26695 подвергалось эвгенола при концентрациях (◆) 4 мкг /мл, (■) 2 мкг /мл, (▴) 1 мкг /мл, (●) управления, и коричный альдегид (◊) 4 мкг /мл, (▫ ) 2 мкг /мл, (△) 1 мкг /мл. Предел обнаружения показан прямой линией. Элементы управления поддерживались с 0,1% ДМСО.
Временной ход летальное действие биологически активных соединений на кишечной палочки
(NCIM-2089) исследовали при трех различных концентрациях (1 мкг /мл, 2 мкг /мл и усилитель; 0,5 мкг /мл). На 1 мкг /мл, эвгенол ингибирует кишечной палочки
через 1 час инкубации, тогда как коричный альдегид ингибируется кишечной палочки
после 75 минут инкубации (Рисунок 2). Рисунок 2 Влияние эвгенол и коричный на рост кишечной палочки NCIM-2089.
культуре E.coli подвергается эвгенола при концентрациях (◆) 2 мкг /мл, (■) 1 мкг /мл, (▲) 0,5 мкг /мл, (●) контроль, и коричный альдегид в концентрации (◊ ) 2 мкг /мл, (□) в концентрации 1 мкг /мл, (△) 0,5 мкг /мл. Предел обнаружения показан прямой линией. Элементы управления поддерживались с 0,1% ДМСО.
Для сравнения эффективности наших биоактивных соединений против H.pylori,
, мы исследовали влияние общего антибиотика (амоксициллин) при различных концентрациях, таких как 1 мкг /мл, 0,1 мкг /мл и 0,01 мкг /мл с МИК ≪ 0,016 мкг /мл. Там не было никакого ингибирования H. Pylori
видно при концентрации 0,01 мкг /мл. Но ингибирование было отмечено при концентрации 0,1 мкг /мл до 4 й час инкубации. Тем не менее, эта бактерия была полностью ингибируется при концентрации 1 мкг /мл, на 12 й час инкубации (рис 3). Рисунок 3 Влияние амоксициллина на рост антихеликобактерной (ATCC26695). ATCC26695 подвергали воздействию при концентрациях (◊) 1 мкг /мл, (•) от 0,1 мкг /мл, (▴) контрольных 0,01 мкг /мл, (○). Предел обнаружения показан прямой линией.
антихеликобактерную
морфологию
Микроскопическое наблюдение показало, что слайдами при высоких концентрациях обоих биологически активных соединений (4 мкг /мл) и через 4 часа инкубации, ~ 70% клеток предполагается кокковидные формы с меньшим количеством формы спиральных организмов.
Эффект биоактивных соединений на рост антихеликобактерной
в буферах при кислом рН
жизнеспособность штамма ATCC 26695 при кислых рН исследовали с использованием эвгенола и коричный альдегид при различных концентрациях (2 мкг /мл, 4 мкг /мл и 1 мкг /мл). Как показано на фигуре 4, как соединения показали повышенную активность при кислом рН (рН-4,0), а также дозы наблюдалась также зависит бактерицидную активность. При концентрации двойного МИК (4 мкг /мл), было установлено, эвгенол, чтобы полностью ингибируют бактерии при температуре около 1 часа инкубации. Коричный альдегид также показал бактерицидную активность в аналогичным образом, но не ингибирует организм полностью (после одного часа инкубации была разница в 0,2 Log). Для обоих соединений, по сравнению в кислых и нейтральных рН, мы обнаружили разницу Log 1,5 после того, как один час инкубации при МИК 2 мкг /мл. Рисунок 4 Влияние эвгенол и коричный на рост антихеликобактерной (ATCC26695) при низком рН. ATCC26695 подвергалось эвгенола при pH 4 (сплошные линии) и рН 7 (пунктирные линии) при концентрациях (◆ или ◊) 4 мкг /мл, (■ или □) 2 мкг /мл, (Ss или △) 1 мкг /мл, ( ●) контроль. Предел обнаружения было показано, как прямая линия. Элементы управления поддерживались с 0,1% ДМСО.
Испытание на стойкость к воздействию эвгенол и коричный
Мы исследовали, может ли пилорусов H.
приобретет устойчивость к биологически активных соединений. Отобранные антихеликобактерную
штаммы (ATCC26695, MS-27, MS-1, MS-8 и MS-15), не приобретают устойчивость к обоим биоактивных соединений при подавляющей концентрации переводник (0,25 и 0,5 мкг /мл) даже после того, 10 пассажей.
Обсуждение
искоренение H. Pylori с услугой монотерапии трудно и часто приводит к плохому клиническим исходом [28]. В настоящее время используется ингибитор протонного насоса (ИПН) на основе тройной терапии. Хотя она имеет успех скорость от 80 до 90% [29], такие проблемы, как неудачи лечения и противопоказания для некоторых пациентов являются общими. Кроме того, основная проблема в лечении H. Pylori
инфекции быстро развивается лекарственная устойчивость во время лечения с различными антибиотиками [30]. Из-за распространенности H. Pylori
штаммов, устойчивых к антибиотикам, поиск безопасных и эффективных без антибиотиков имеет важное значение.
В традиционной индийской медицинской системы, ряд растений и растительных продуктов, как известно, обладают мощным целебные свойства, предполагая, что растения, растительные продукты и их экстракты могут быть полезны для определенных заболеваний. Поэтому в наших усилиях, чтобы идентифицировать новые соединения, которые могут ингибировать H. Pylori
рост, мы тестировали эвгенол и коричный. Эти соединения уже найдены для ингибирования 10 различных наркотиков нескольких устойчивых патогенных бактерий, таких как E.coli, Staphylococcus

, Proteus
, Klebsiella
, Enterobacter
и Pseudomonas
изолированные от человеческих субъектов [20, 21]. В наших исследованиях, эвгенол и коричный полностью подавлял всех штаммов (как чувствительных, и усилитель, устойчив) при концентрации 2 мкг /мл. Эта подавляющая концентрация очень меньше по сравнению с предыдущим отчетным ССД {allicins: 6-12 мкг /мл, чесночное масло: 8-32 мкг /мл [11] и ajoenes: 10-25 мкг /мл [31]}. Наши соединения также оказались более сильными, чем thiosulfinate {40 мкг /мл [19]}, {vinyldithiins ≪ 100 мкг /мл [31]}, эпигаллокатехин галлат {50-100 мкг /мл [32]} и {чесночный порошок 250 мкг /мл [11]}.
В время исследования жизнеспособности конечно, мы обнаружили, что эвгенол и коричный тормозится H. Pylori
ATCC26695 на 2 мкг /мл концентрации в течение 9 и 12 часов инкубации соответственно. Очень мощные эффекты некоторых эфирных масел лимонной травы на хеликобактерной
были описаны ранее [26]. Тем не менее, наши наблюдения могут быть более точным, с тем, что мы использовали активные принципы, а не экстракты или масла, которые используются Ohno и др., [26]. Эти эфирные масла могут содержать неизвестные вещества, которые могут обеспечить синергетический, тормозящее действие. Эвгенола в Нам удалось получить является сильнодействующим антимикробным, чем эфирные масла Охно и коллегами [26], тогда как эффект коричный альдегид приблизительно эквивалентно масел, используемых ими. Кроме того, наши соединения были более мощными, чем обычный амоксициллину антибиотик, который ингибируется антихеликобактерную
ATCC26695 при 12 й час (по аналогии с коричный альдегид), тогда как эвгенол ингибирует микробный рост в 9 й час самой инкубации , при его минимальной ингибирующей концентрации. был найден Амоксициллин полностью ингибировать бактерии при более высокой концентрации (1 мкг /мл), чем это минимальная ингибирующая концентрация (0,016 мкг /мл) (фигура 3). В антихеликобактерную
находится в желудке, где уровень рН которых меньше 3,0, то важно, чтобы проверить активность и стабильность соединения при кислом рН. В нашем исследовании H. Pylori
изоляты выживали при рН 4,0, несмотря на некоторые отчеты, показывающие выживание H. Pylori
при рН-3,0 [25], а также бактерицидные эффекты биоактивных соединений оказались сильнее, даже при низких рН. Некоторые агенты, которые имеют бактерицидное действие против H. Pylori
зависят от рН (например, экабет натрия активен при кислом рН [25] и чай cathechin активен при щелочном рН [33]).
Кроме того, мы обнаружили, что организм не складывалось никакого сопротивления тестируемых соединений даже после того, как 10 последовательных проходов выращены на суб-ингибирующие концентрации (0,25 и 0,5 мкг /мл) [21], в то время как H. Pylori
штаммы приобрели устойчивость к амоксициллину и кларитромицином после того, как 10 последовательных пассажей, как сообщалось ранее [26, 34]. Кроме того, эти биологически активные соединения имели эквивалентные бактерицидные активностью в отношении обоих штаммов пилори
восприимчивых и устойчивых H..
Эвгенол и коричный образуют часть регулярного рациона в тропических странах с времен. Многие доклады свидетельствуют эти соединения являются нетоксичными при дозах потребляется [34], и они известны своим антимикробным и антиоксидантным свойствами [21, 36]. Кроме того, чтобы излечить язвенную болезнь или предотвратить окислительный стресс, предписывая антиоксидантов является довольно обычной практикой в ​​эти дни с врачами. Поскольку оба эти соединения являются природный антиоксидант [37], их преимущества могут быть несколько. Два исследования на животных, проведенные в прошлом предполагают, что экстракт коры корицы принимают внутрь может помочь предотвратить язвы желудка [36] и одно исследование описано эвгенол, чтобы быть как противовоспалительное и antiulcerogenic [38]. Он был использован еще в 1950 для лечения язвенной болезни [39]. Учитывая все преимущества, которые мы наблюдали в течение двух биоактивных соединений, протестированных, наши данные не должны быть истолкованы в качестве сертификации соединений в клинической практике, пока их стабильность, специфичность и общая эффективность устанавливается в различных лабораториях и против различных бактериальных штаммов. Дальнейшие исследования, следовательно, очевидно, что необходимо в контексте воспроизводимости этих результатов при различных лабораторных условиях.
Заключение
Данные, полученные в этом исследовании, показывают, что эвгенол и коричный альдегид в концентрации 2 мкг /мл производят значительное снижение жизнеспособности организма антихеликобактерную
, независимо от штамма. Активность этих соединений при низких значениях рН, может помочь им в достижении их эффективность в среде, такой как человеческий желудок. Мы надеемся, что эти результаты являются обнадеживающими ввиду растущих неудач лечения и устойчивости к антибиотикам в области управления H. Pylori
. Дополнительные исследования естественных условиях
в и клинические испытания будут необходимы для обоснования и дальнейшей оценки потенциала этих соединений в качестве H. Pylori
противораковых агентов.
Объявления
Благодарности
SMA, HP, LVR и КМЗ хотел бы поблагодарить Комиссию университетских грантов, Нью-Дели для предоставления финансовой поддержки этого расследования выходной сигнал переноса. NA и LAS хотел бы поблагодарить ISOGEM HTTP:... //WWW isogem орг за поддержку "оригинальные файлы, представленные для изображений, изображения Ниже приведены ссылки на авторов
АВТОРЫ оригинальные файлы представлены для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12941_2005_65_MOESM2_ESM.ppt Авторского 12941_2005_65_MOESM1_ESM.ppt авторов исходного файла для Рисунок 2 12941_2005_65_MOESM3_ESM.ppt Авторского исходного файла для фигурного 3 12941_2005_65_MOESM4_ESM.ppt Авторского исходного файла для фигуры 4

• Желудочный травмы: редкое хирургическое событие из-за тупой брюшной trauma
• Визуализации в оценке печени и брюшины метастазов рака желудка: систематический review