attività antimicrobica di eugenolo e Cinnamaldeide contro l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori umana

attività antimicrobica di eugenolo e Cinnamaldeide contro l'agente patogeno umano gastrica da Helicobacter pylori
astratta
sfondo
Eradicazione dell'Helicobacter pylori
è un obiettivo importante per superare le malattie gastriche. Molti regimi sono attualmente disponibili, ma nessuno di loro potrebbe raggiungere il 100% di successo in eradicazione. Eugenolo e cinnamaldeide che vengono comunemente utilizzati in varie preparazioni alimentari sono noti per possedere attività antimicrobica contro un ampio spettro di batteri.
Scopo
Il presente studio è stato condotto per valutare gli effetti in vitro
di eugenolo e cinnamaldeide contro indigena e standard di H. pylori
ceppi, le loro concentrazioni minime inibenti (MIC) e gli effetti decorso letali a vari pH.
Metodi
un totale di 31 ceppi (29 indigena e un ceppo standard di H. pylori
ATCC 26695, un ceppo di E. coli
NCIM 2089) sono stati proiettati. metodo della diluizione Agar è stato utilizzato per la determinazione dello spettro di sensibilità ai farmaci degli isolati agli antibiotici comunemente utilizzati e metodo di diluizione brodo per i composti in esame
. Risultati
eugenolo e cinnamaldeide inibito la crescita di tutte le 30 H. pylori
ceppi testati, ad una concentrazione di 2 mg /ml, nel 9 e 12 ore di incubazione rispettivamente. A pH acido, maggiore attività è stata osservata per entrambi i composti. Inoltre, l'organismo non ha sviluppato alcuna resistenza nei confronti di questi composti anche dopo 10 passaggi coltivate a concentrazioni sub-inibitoria.
Conclusione
Questi risultati indicano che i due composti bioattivi che abbiamo testato possono impedire H. pylori
crescita vitro
, senza acquisire alcuna resistenza.
Introduzione
Helicobacter pylori
è stato scoperto nel 1982 ed è stata successivamente risultato essere un importante agente eziologico per la gastrite [1], ulcere peptiche [2] e gastrico malignità [3]. Si stima che la metà della popolazione mondiale è infettato da H. pylori
[4]. Numerose evidenze cliniche rivelano che l'eradicazione di H. pylori
risultati in miglioramento di gastrite e diminuisce drasticamente il tasso di recidiva di ulcere gastriche e duodenali [5, 6]. H. pylori
tassi di trasporto sono circa 80-90% nei paesi in via di sviluppo [7], con un alto rischio di cancro gastrico e regimi antibiotici contro H. pylori Quali sono spesso inefficaci in tali popolazioni [8]. Oltre a questo, gli effetti collaterali indesiderati [9], non conformità tra i pazienti [10] e il costo dei regimi antibiotici [11] sono pochi altri fattori per la loro inefficacia. Quindi vi è la necessità di sviluppare approcci alternativi per sopprimere /curare l'infezione.
Tempi degli antichi, spezie e condimenti sono stati considerati indispensabili nelle arti culinarie, in quanto sono utilizzati per insaporire i cibi. Anche queste spezie sono stati riconosciuti per le loro proprietà fisiologiche e medicinali. Si presume che l'efficacia ad ampio spettro di queste spezie [12-14] può fornire una base adeguata per le nuove H. pylori
terapie anti-. Alcuni degli studi epidemiologici suggeriscono una relazione inversa tra l'insorgenza del cancro dello stomaco (per il quale H. pylori
infezione è un noto fattore di rischio) e l'assunzione di verdure allium [15, 16]. Ci sono rapporti su in vitro
attività antimicrobica di molti estratti di spezie (e non i loro principi attivi) su H. pylori
[17, 18]. Ma principi attivi di componenti aglio e aglio sono stati provati [11, 19].
Eugenolo, un composto fenolico è il componente principale di garofano (Eugenia caryophillis
) dell'olio. Cinnamaldeide è un aldeide aromatica e componente principale di estratto di corteccia di cannella (Cinnamomum verum
). Entrambi questi composti sono presenti negli oli essenziali di molte piante e sono dimostrato di essere attivo contro molti batteri patogeni [20, 21], funghi [21, 22] e virus [14]. Vi è una scarsità di informazioni sugli effetti di questi composti bioattivi su H. pylori
. Pertanto, il presente studio è stato intrapreso per valutare l'efficacia di eugenolo e cinnamaldeide come H. pylori
agenti anti.
Materiali e metodi
H. pylori
ceppi di H. pylori
Trenta
ceppi e un ceppo di E. coli
(NCIM2089) sono stati utilizzati nello studio. Ventinove ceppi che sono stati designati come MS-1 di MS-29 sono stati isolati da campioni bioptici gastrici (15 da ulcera duodenale, 10 da dispepsia non ulcera e 4 da parte di soggetti con ulcera gastrica), dopo i consensi informati dei pazienti che hanno subito gastrointestinale superiore l'endoscopia a Deccan college of Medical Sciences, Hyderabad, India. è stato incluso un ceppo di H. pylori
(ATCC26695) anche
isolamento primario è stato eseguito su Brucella agar (Becton, Dickinson & Co, Sparks, Stati Uniti d'America)., integrato con il 7% (v /v) sangue di pecora e gli antibiotici (vancomicina, 6 mg /L; Amphoteracin B, 3 mg /L; Polimixina B, 2500 IU /L; Hi-media, Mumbai, India). pH finale dei media è stato regolato a 7,2. H. pylori
è stato identificato per la sua tipica morfologia delle colonie, colorazione di Gram, la crescita microaerofili a 37 ° C e da altri test biochimici come ossidasi, catalasi e ureasi. Questi ceppi sono stati conservati a -80 ° C in brodo brucella (Becton, Dickinson & Co, Sparks, Stati Uniti d'America) contenente il 10% (V /V) di vitello siero fetale (FCS) e il 20% (v /v) glicerolo composti bioattivi
preparazioni commerciali di composti bioattivi, come eugenolo e cinnamaldeide sono stati utilizzati nei nostri esperimenti. Tutti i ceppi sono stati seminati su Brucella agar arricchito con sangue di pecora del 7% ed è cresciuto per 48 ore in condizioni microaerofile. La crescita batterica è stato raccolto dalle piastre e risospesa in soluzione fisiologica sterile. L'inoculo era pronto a contenere ~ 10 8 CFU /ml regolando la sospensione per abbinare il McFarland No-4 torbidità di riferimento [23].
Attività antibatterica di antibiotici standard
concentrazioni minime inibenti (MIC) per antibiotici come metronidazolo, amoxicillina e claritromicina sono stati determinati con il metodo di diluizione agar, utilizzando due incrementi di piegatura (0.016 al 256 mcg /ml) su Mueller Hinton agar (MHA) piastre integrate con sangue di montone 7% e incubate per 3 giorni a 37 ° C in un armadio microaerofili. MIC sono state determinate la più bassa concentrazione degli antibiotici che inibiscono la crescita visibile [24] utilizzando ~ 10 6 CFU di inoculo.
Attività antibatterica di eugenolo e cinnamaldeide
screening primario
Il disco diffusione Kirby-Bauer test di sensibilità è stato utilizzato per verificare l'attività dei composti bioattivi di H. pylori
. L'inoculo preparato come descritto precedentemente è stato inoculato su MHA supplementato con 7% di sangue di pecora e dischi composti bioattivi (preparato caricando i rispettivi composti in concentrazione variabile ai dischi di carta filtro sterile) sono stati collocati a piastre con il dispenser sterile e incubata in microaerofilia a 37 ° C per 3 giorni.
concentrazione minima inibente (MIC) di composti bioattivi
Poiché non vi era alcuna metodo stabilito per determinare l'attività antibatterica dei composti bioattivi contro H. pylori
, seriale a due diluizioni di eugenolo e cinnamaldeide sono state fatte in un Brucella preparato 5 ml di brodo (pH 7) con 0,1% dimetilsolfossido (DMSO, che migliora la solubilità composto) e integrato con 2,5% di siero fetale bovino (FCS). Cotone-lana collegato palloni da 25 ml conici di Brucella brodo preparato come sopra, sono state inoculate con H. pylori
(~ 10 6 CFU /ml) [11]. I palloni sono state incubate per 3-5 giorni in un armadio microaerofili con agitazione a ~ 150 rpm. Dopo l'incubazione, aliquote di 100 microlitri del mezzo sono stati placcati su piastre di agar Brucella integrato con sangue di pecora 7% per determinare i conteggi vitali.
Andamento temporale
Tempo studi di fattibilità corso dei composti bioattivi sono stati istituiti allo stesso modo i test MIC superiori, ma i brodi sono stati campionati oraria rispetto al primo 4 ore e poi di nuovo a 6, 9, 12, 24, 48 e 72 h per verificare la conta vitale. H. pylori
ATCC26695 stata utilizzata come inoculo per lo studio.
Per confronto, antibiotico noto come amoxicillina è stato usato ed E. coli
(NCIM2089) è stato utilizzato come controllo batterico standard diverso da H. pylori
.
effetti dei composti bioattivi su H. pylori
morfologia
per controllare l'effetto di composti bioattivi sulla morfologia di H. pylori
, diapositive sono stati preparati dai campioni di cui sopra di prima quattro ore, colorati con Giemsa e osservati in olio da immersione.
misura di attività battericida a pH acido
gli effetti del pH sulla attività antibatterica di eugenolo e cinnamaldeide sono state fatte come riportato in precedenza [25, 26]. Il pH del tampone è stato regolato a 4,00 con 100 mM tampone citrato (pH 5,2) supplementato con 10 mM di urea ed il pH è stato regolato a 7,00 utilizzando 10 mM tampone fosfato (pH 6.8). H. pylori
ATCC26695 (~ 10 7 CFU /ml) è stata inoculata in 5 ml di mezzo con 0,1% DMSO a cui sono state aggiunte varie concentrazioni dei composti. Tutte le beute sono state incubate a 37 ° C. Venti ml dei campioni sono stati presi a 0, 15, 30 e 60 minuti dopo l'inoculazione di enumerare il numero di cellule vitali.
Di prova per lo sviluppo della resistenza ai composti bioattivi
Per studiare lo sviluppo della resistenza, cioè cinque ceppi ATCC26695, MS-27 (sensibile a tutti i tre antibiotici), MS-1 (resistente a tutti i tre antibiotici), MS-8 (resistenti al metronidazolo, claritromicina e sensibile alla amoxicillina), e MS-15 (resistente solo metronidazolo ), sono state coltivate su agar al sub concentrazioni inibenti (0,25 e 0,5 mg /ml) di eugenolo e cinnamaldeide per 10 passaggi. Tutti gli esperimenti di cui sopra sono stati ripetuti tre volte.
Risultati
attività antibatterica contro H. pylori
MIC di antibiotici per H. pylori
sono stati determinati. Strain ATCC26695 era sensibile (MIC < 0,016 mcg /ml) per tutti i tre farmaci testati. Venti (66,7%) isolati clinici (MS1-8, 10, 12, 14 - 17, 20, 23 - 26 e MS28) dal nostro laboratorio erano resistenti al metronidazolo (MIC > 8 mg /ml), 2 (6,7%) isolati clinici (MS1 & 8) erano resistenti alla claritromicina (MIC > 2 mg /ml) e 1 (3,3%) isolato clinico (MS1) era resistente alla amoxicillina (MIC > 0,5 mg /ml) [27] (Tabella 1) .table 1 Sensibilità di H. pylori
ceppi (n = 30) a diversi antibiotici

antibiotici
Sensitive (% )
Resistenza (%)
Range (mg /ml)
MIC27 (mg /ml)
metronidazolo
10 (33,3)
20 (66,7)
< 0.5 - > 256
> 8
Claritromicina
28 (93,3) Pagina 2 (6.7)
< 0.5 - > 256 Hotel > 2
Amoxycillin
29 (96,7)
1 (3.3)
< 0.5 - > 256
> 0.5
nello screening preliminare, sia il composti hanno dato circa 15 zone di inibizione mm a tutti gli isolati clinici e ceppo standard (H. pylori
ATCC26695). Questo in vitro
effetto antimicrobico dei composti bioattivi dimostrato che entrambi i composti sono in grado di inibire completamente la crescita di tutti i ceppi (sia sensibili & resistente) ad una concentrazione di 2 mg /ml. Per E. coli
(NCIM-2089), MIC di eugenolo e cinnamaldeide è stato di 1 mg /ml.
Tempo corso
quanto sia i composti erano attivi ad una concentrazione di 2 mg /ml, abbiamo esaminato la uccidendo andamento temporale della curva di entrambi i composti a diversa concentrazione pari a 1 ug /ml, 2 mg /ml e 4 mg /ml. Eugenolo completamente inibito la crescita di H. pylori
ATCC 26695 a 2 mg di concentrazione /ml a 9 ore di incubazione. La crescita è stata completamente inibita in sole 6 ore quando la MIC è stata raddoppiata (4 mg /ml). Alcuni inibizione della crescita è stato osservato alla MIC di 1 ug /ml, dove fino a 6 th ore è stata osservata una diminuzione del ~ 1.6 Log poi dopo c'è stato un effetto del composto sul batterio (Figura 1). Cinnamaldeide inibita ATCC26695 totalmente a 2 ug /ml in 12 ore e 9 ore al doppio della MIC (4 mg /ml). Tuttavia, a metà della MIC (1 mg /ml), un piccolo effetto è stato osservato fino al 3 rd ora e c'è stata una diminuzione di 0,6 log senza conseguente effetto inibitorio (Figura 1). Figura 1 Tempo studi di fattibilità corso di eugenolo e cinnamaldeide da H. pylori ATCC26695. ATCC26695 è stato esposto a eugenolo a concentrazioni (◆) 4 mg /ml, (■) 2 mg /ml, (▴) 1 mg /ml, (●) di controllo e di Cinnamaldeide (◊) 4 mg /ml, (▫ ) 2 ug /ml, (△) 1 mg /ml. Limite di sensibilità è stato mostrato con una linea retta. I controlli sono stati mantenuti con 0,1% DMSO.
Il corso tempo di azione letale dei composti bioattivi di E. coli
(NCIM-2089) è stato valutato in tre diverse concentrazioni (1 mg /ml, 2 mg /ml & 0,5 mg /ml). Al 1 mg /ml, eugenolo inibito E. coli
dopo 1 ora di incubazione, mentre Cinnamaldeide inibito E. coli
dopo 75 minuti di incubazione (Figura 2). Figura 2 Effetti di eugenolo e cinnamaldeide sulla crescita di E. coli NCIM-2089. E. coli
è stato esposto a eugenolo a concentrazioni (◆) 2 mg /ml, (■) 1 mg /ml, (▲) 0,5 mg /ml, (●) di controllo, e di cinnamaldeide a concentrazioni di (◊ ) 2 mg /ml, (□) 1 mg /ml, (△) 0,5 mg /ml. Limite di sensibilità è stato mostrato con una linea retta. I controlli sono stati mantenuti con 0,1% DMSO.
Per confronto l'efficacia dei nostri composti bioattivi contro H. pylori
, abbiamo studiato l'effetto di un comune antibiotico (amoxicillina) a concentrazioni differenti quali 1 ug /ml, 0,1 ug /ml e 0,01 mg /ml con una MIC di < 0,016 mg /ml. Non c'era alcuna inibizione di H. pylori
visto alla concentrazione di 0,01 mg /ml. Ma l'inibizione è stata notata ad una concentrazione di 0,1 mg /ml fino al 4 th ore di incubazione. Tuttavia, il batterio è stato completamente inibita ad una concentrazione di 1 ug /ml, dal 12 th ore di incubazione (Figura 3). Figura 3 Effetto di amoxicillina sulla crescita di H. pylori (ATCC26695). ATCC26695 è stato esposto a concentrazioni di (◊) 1 mg /ml, (■) 0,1 mg /ml, (▴) 0,01 mg /ml, (○) di controllo. Limite di rilevazione è stato mostrato con una linea retta.
H. pylori
morfologia
microscopica osservazione di diapositive ha rivelato che ad alte concentrazioni di entrambi i composti bioattivi (4 mg /ml) e dopo 4 ore di incubazione, ~ 70% delle cellule assunto forme coccoidi con un minor numero di organismi a forma di spirale.
effetto dei composti bioattivi sulla crescita di H. pylori
nei buffer a pH acido
la vitalità del ceppo ATCC 26695 a pH acido era studiata utilizzando eugenolo e cinnamaldeide a varie concentrazioni (2 ug /ml, 4 microgrammi /ml e 1 mg /ml). Come mostrato in figura 4, sia i composti rivelati aumento di attività a pH acido (pH 4,0) e una dose è stata osservata anche attività battericida dipendente. Ad una concentrazione di doppio MIC (4 mg /ml), eugenolo è stato trovato per inibire completamente i batteri a circa 1 ora di incubazione. Cinnamaldeide anche rivelato attività battericida in modo simile, ma non ha inibito l'organismo totalmente (dopo un'ora di incubazione c'era una differenza di 0,2 log). Per entrambi i composti, rispetto a pH acido e neutro, abbiamo trovato una differenza Log di 1,5 dopo un'ora di incubazione a MIC di 2 mg /ml. Figura 4 Effetto di eugenolo e cinnamaldeide sulla crescita di H. pylori (ATCC26695) a pH basso. ATCC26695 è stato esposto a eugenolo a pH4 (linee continue) e pH7 (linee tratteggiate) a concentrazioni (◆ o ◊) 4 mg /ml, (■ o □) 2 mg /ml, (ss o △) 1 mg /ml, ( ●) di controllo. Limite di sensibilità è stato mostrato come una linea retta. I controlli sono stati mantenuti con 0,1% di prova DMSO. Compra di resistenza a eugenolo e cinnamaldeide
Abbiamo studiato se H. pylori
avrebbe acquisito resistenza ai composti bioattivi. Selezionati H. pylori
ceppi (ATCC26695, MS-27, MS-1, MS-8 e MS-15) non acquisiscono la resistenza ad entrambi i composti bioattivi a livello sub concentrazioni inibitorie (0,25 e 0,5 mg /ml) anche dopo 10 passaggi.
Discussione
eradicazione di H. pylori
con monoterapia è difficile e spesso si traduce in scarso esito clinico [28]. Attualmente viene utilizzato un inibitore della pompa protonica (PPI) in base triplice terapia. Anche se sta avendo un tasso di successo del 80-90% [29], problemi come il fallimento del trattamento e controindicazioni per alcuni pazienti sono comuni. Inoltre, il problema principale nel trattamento di H. pylori
infezione sta rapidamente emergendo resistenza ai farmaci durante il trattamento con vari antibiotici [30]. A causa della prevalenza di H. pylori
ceppi resistenti agli antibiotici, la ricerca di agenti non antibiotici sicuri ed efficaci è essenziale.
In sistema medico tradizionale indiana, un certo numero di piante e prodotti vegetali sono noti per possedere potenti proprietà medicinali, il che suggerisce che le piante, prodotti vegetali e loro estratti possono essere utili per specifiche condizioni mediche. Quindi nel nostro sforzo di identificare i composti più recenti, che possono inibire H. pylori
crescita, abbiamo testato eugenolo e cinnamaldeide. Questi composti sono già stati trovati per inibire 10 diversi batteri patogeni resistenti a più farmaci come E. coli
, Staphylococcus
, Proteus
, Klebsiella
, Enterobacter
, e Pseudomonas
isolato da soggetti umani [20, 21]. Nel nostro studio, eugenolo e cinnamaldeide completamente inibiti tutti i ceppi (sia sensibile & resistente) ad una concentrazione di 2 mg /ml. Questa concentrazione inibitoria è molto meno quando confrontato con il MIC precedentemente riportati {allicins: 6-12 mg /ml, olio aglio: 8-32 mg /ml [11] e ajoenes: 10-25 mg /ml [31]}. Le nostre mescole anche dimostrato di essere più potente di thiosulfinate {40 mg /ml [19]}, {vinyldithiins < 100 mg /ml [31]}, {epigallocatechina gallato 50-100 mcg /ml [32]} e {aglio in polvere 250 ug /ml [11]}.
Negli studi di fattibilità corso del tempo, abbiamo scoperto che l'eugenolo e cinnamaldeide inibiti H. pylori
ATCC26695 a 2 mg di concentrazione /ml entro 9 e 12 ore di incubazione, rispettivamente. effetti molto potenti di alcuni oli essenziali di citronella su H. pylori
sono stati descritti in precedenza [26]. Tuttavia, le nostre osservazioni può essere più precisi con il fatto che abbiamo usato principi attivi e non gli estratti o oli usati per Ohno et al., [26]. Questi oli essenziali possono contenere sostanze sconosciute che potrebbero fornire, effetti inibitori sinergici. Eugenolo nei nostri studi è risultato essere un antimicrobico potente di oli essenziali di Ohno e colleghi [26] mentre l'effetto di cinnamaldeide era approssimativamente equivalente agli oli utilizzate. Inoltre, i nostri composti sono stati più potente del amoxicillina antibiotico comune, che ha inibito H. pylori
ATCC26695 a 12 th ora (simile a Cinnamaldeide), mentre eugenolo ha inibito la crescita microbica al 9 th ora di incubazione per sé , alla sua concentrazione inibitoria minima. Amoxycillin è stato trovato per inibire completamente batteri ad una concentrazione più elevata (1 mg /ml), che è minima concentrazione inibente (0,016 mcg /ml) (Figura 3). Come H. pylori
risiede nello stomaco, dove i livelli di pH sono inferiori a 3,0, è importante controllare l'attività e la stabilità di un composto a pH acido. Nel nostro studio, H. pylori
isolati sopravvissuti a pH 4.0, nonostante alcuni rapporti che mostrano H. pylori
sopravvivenza a pH 3.0 [25], e gli effetti battericidi dei composti bioattivi sono stati trovati per essere più forti anche a bassa pH. Diversi agenti che hanno effetti battericidi contro H. pylori
dipendono dal pH (ad esempio, ecabet sodio è attiva in ambiente acido [25] e tè cathechin è attiva a pH alcalino [33]).
Inoltre, ha scoperto che l'organismo non ha sviluppato alcuna resistenza ai composti di prova anche dopo 10 passaggi successivi coltivate a concentrazioni sub-inibitorio (0,25 e 0,5 mg /ml) [21], mentre H. pylori
ceppi acquisito resistenza alla amoxicillina e claritromicina dopo 10 passaggi sequenziali come riportato in precedenza [26, 34]. Eugenolo Inoltre, questi composti bioattivi avevano attività battericida equivalenti sia contro il H. pylori
ceppi sensibili e resistenti.
E cinnamaldeide formano una parte della dieta normale nei paesi tropicali in quanto le età. Molti rapporti suggeriscono che questi composti sono atossici a dosi di essere consumato [34], e sono noti per la loro antimicrobica e proprietà antiossidanti [21, 36]. Inoltre, per guarire ulcera peptica, o per prevenire lo stress ossidativo, la prescrizione di antiossidanti è piuttosto una pratica normale in questi giorni con i medici. Poiché entrambi questi composti sono antiossidanti naturali [37], i loro benefici potrebbero essere molteplici. Due studi sugli animali effettuati in passato suggeriscono che un estratto di corteccia di cannella assunto per via orale può aiutare a prevenire l'ulcera allo stomaco [36] e uno studio descritto eugenolo essere sia anti-infiammatori e antiulcerogenic [38]. E 'stato utilizzato fin dal 1950 per il trattamento di malattia ulcerosa [39]. Tenuto conto di tutti i vantaggi che abbiamo osservato per i due composti bioattivi testati, i nostri dati non devono essere intesi come la certificazione dei composti in applicazione clinica fino alla loro stabilità, la specificità e l'efficacia complessiva è stabilito in diversi laboratori e contro diversi ceppi batterici. Ulteriori studi sono quindi chiaramente necessari nel contesto della riproducibilità di questi risultati in diverse condizioni di laboratorio.
Conclusione
I dati ottenuti in questo studio mostrano che eugenolo e cinnamaldeide a 2 ug /ml producono significativa diminuzione della vitalità dell'organismo H. pylori
, indipendentemente dal ceppo. Attività di questi composti a bassi livelli di pH può realizzare il loro efficacia in un ambiente come stomaco umano. Confidiamo questi risultati sono incoraggianti in vista delle crescenti fallimenti del trattamento e la resistenza agli antibiotici nella zona di H. pylori
gestione. Ulteriori in vivo
studi e trial clinici sarebbero necessari per giustificare e ulteriormente valutare il potenziale di questi composti come H. pylori
agenti anti.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
SMA, HP, LVR e CMH ringrazia Università Grants Commissione, New Delhi per fornire sostegno finanziario a carryout questa indagine. NA e LAS desiderano ringraziare il http ISOGEM:... //Www isogem org per il sostegno dei file inviati originali per le immagini
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