atividades antimicrobianas de Eugenol e cinamaldeído contra o patógeno gástrico humano Helicobacter pylori

atividades antimicrobianas de Eugenol e cinamaldeído contra o patógeno gástrico humano Helicobacter pylori
Abstract
Fundo
Erradicação do Helicobacter pylori
é um importante objectivo a superar doenças gástricas. Muitos esquemas estão disponíveis no momento, mas nenhum deles poderia alcançar 100% de sucesso na erradicação. Eugenol e cinamaldeído que são comumente usados ​​em várias preparações alimentícias são conhecidos por possuir atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de bactérias.
AIM
O presente estudo foi realizado para avaliar os efeitos in vitro
de eugenol e cinamaldeído contra H. pylori indígena e padrão
estirpes, as suas concentrações mínimas inibidoras (MICs) e efeitos letais curso de tempo em vários pH.
Métodos
Um total de 31 estirpes (29 indígena e uma estirpe padrão de H. pylori
ATCC 26695, uma estirpe de E. coli
NCIM 2089) foram selecionados. método de diluição de agar foi utilizada para a determinação dos padrões de sensibilidade aos fármacos de isolados aos antibióticos vulgarmente usados ​​e método de diluição em caldo para os compostos de teste. Os resultados

eugenol e cinamaldeído inibiu o crescimento de todas as 30 H. pylori
cepas testadas, a uma concentração de 2 mg /ml, nos dias 9 e 12 horas de incubação, respectivamente. No pH ácido, observou-se um aumento da actividade para ambos os compostos. Além disso, o organismo não desenvolveram nenhuma resistência a estes compostos, mesmo depois de 10 passagens crescidas em concentrações sub-inibidor.

Conclusão Estes resultados indicam que os dois compostos bioactivos testadas pode impedir o crescimento de H. pylori em
vitro
, sem adquirir qualquer resistência.
Introdução
Helicobacter pylori
foi descoberto pela primeira vez em 1982 e posteriormente foi encontrado para ser um importante agente etiológico de gastrite [1], úlceras pépticas [2] e gástrica malignidade [3]. Estima-se que uma metade da população mundial está infectada com o H. pylori
[4]. Numerosas evidências clínicas revelam que a erradicação da H. pylori
resulta em melhoria da gastrite e diminui drasticamente a taxa de recidiva de úlceras gástricas e duodenais [5, 6]. H. pylori
taxas de transporte são cerca de 80-90% nos países em desenvolvimento [7], com um alto risco de câncer gástrico e regimes de antibióticos contra o H. pylori Quais são frequentemente ineficazes em tais populações [8]. Além disso, efeitos colaterais indesejáveis ​​[9], a não adesão entre os pacientes [10] e o custo dos regimes de antibióticos [11] são alguns outros fatores para sua ineficácia. Portanto, há uma necessidade de desenvolver abordagens alternativas para suprimir /curar a infecção.
Desde os tempos antigos, especiarias e condimentos foram considerados indispensáveis ​​nas artes culinárias, como eles são usados ​​para alimentos de sabor. Também estas especiarias foram reconhecidos por suas propriedades fisiológicas e medicinais. Presume-se que a eficácia de largo espectro desses especiarias [12-14] pode fornecer uma base adequada para novos H. pylori
terapias anti. Alguns dos estudos epidemiológicos sugerem uma relação inversa entre a ocorrência de câncer de estômago (para os quais a infecção por H. pylori
é um conhecido fator de risco) e a ingestão de vegetais allium [15, 16]. Há relatos sobre in vitro
atividade antimicrobiana de muitos extractos de especiarias (e não seus princípios ativos) em H. pylori
[17, 18]. Mas princípios ativos de alho e alho componentes foram julgados [11, 19].
Eugenol, um composto fenólico é o principal componente do cravo (Eugenia caryophillis
) de óleo. Cinamaldeído é um aldeído aromático e principal componente do extrato de casca de canela (Cinnamomum verum
). Ambos os compostos estão presentes em óleos essenciais de muitas plantas e são provou ser activa contra muitas bactérias patogénicas [20, 21], [21 fungos, vírus 22] e [14]. Há uma escassez de informação sobre os efeitos destes compostos bioativos no H. pylori
. Portanto, o presente estudo foi realizado para avaliar a eficácia de eugenol e cinamaldeído como H. pylori
agentes anti.
Materiais e métodos
H. pylori
estirpes
Trinta H. pylori
estirpes de E. coli e uma estirpe
(NCIM2089) foram usados ​​no estudo. Vinte e nove cepas que foram designados como MS-1 a MS-29 foram isolados de amostras de biópsia gástrica (15 de úlcera duodenal, 10 de dispepsia não ulcerosa e 4 de indivíduos úlcera gástrica), após consentimento informado dos pacientes que se submeteram gastrointestinal superior endoscopia na Deccan faculdade de Ciências Médicas, Hyderabad, na Índia. Uma estirpe de H. pylori
(ATCC26695) também foi incluído
isolamento primário foi realizada em agar de Brucella (Becton, Dickinson & Co., Sparks, EUA)., Suplementado com 7% (v /v) de sangue de ovelha e antibióticos (vancomicina, 6 mg /L; anfoteracina B, 3 mg /L; polimixina B, 2500 UI /L; Hi-Media, Mumbai, Índia). O pH final do meio foi ajustado para 7,2. H. pylori
foi identificado pela sua morfologia de colónia típica, coloração de Gram, crescimento microaerofilia a 37 ° C e por outros testes bioquímicos tais como oxidase, catalase e urease. Estas estirpes foram conservadas a -80 ° C em caldo Brucella (Becton, Dickinson & Co., Sparks, EUA) contendo 10% (v /v) de soro fetal de vitelo (FCS) e 20% (V /V) de glicerol compostos bioativos
preparações comerciais de compostos bioativos, como eugenol e cinamaldeído foram utilizadas em nossos experimentos. Todas as amostras foram semeadas em agar Brucella suplementado com 7% de sangue de carneiro e cultivadas durante 48 horas em condições microaer�icas. O crescimento bacteriano foi colhido a partir das placas e ressuspenso em solução salina estéril. O inoculo foi preparado para conter 10 ~ 8 UFC /ml, ajustando a suspensão para coincidir com o padrão de turbidez McFarland n-4 [23].
Actividade antibacteriana de antibióticos padrão
concentrações inibitórias mínimas (MICs) para antibióticos tais como metronidazol, amoxicilina e claritromicina foram determinados pelo método de diluição em agar, utilizando dois incrementos de dobragem (0,016-256 ug /ml) sobre ágar de Mueller Hinton (MHA) placas suplementado com 7% de sangue de ovelha e incubada durante 3 dias a 37 ° C em um armário microaerophilic. MICs foram determinadas como a menor concentração dos antibióticos que inibem o crescimento visível [24] usando ~ 10 6 CFU do inóculo.
Atividade antibacteriana de eugenol e cinamaldeído
triagem primária
A difusão de disco de Kirby-Bauer teste de sensibilidade foi utilizada para verificar a atividade dos compostos bioativos no H. pylori
. O inoculo preparada como descrito anteriormente foi inoculada em MHA suplementado com 7% de sangue de carneiro e discos de composto bioactivo (preparado por carregamento dos respectivos compostos em concentração variável em que os discos de papel de filtro estéril) foram colocados sobre as placas com o distribuidor estéril e incubadas em atmosfera microaeróbia a 37 ° C durante 3 dias.
concentração inibitória mínima (MIC) de compostos bioactivos
Como não havia nenhum método estabelecido para determinar a actividade antibacteriana de compostos bioactivos de H. pylori contra
, em série dois diluições de eugenol e cinamaldeído foram feitas numa preparação de 5 ml de caldo de Brucella (pH 7) com 0,1% de dimetil sulfóxido (DMSO; que aumenta a solubilidade do composto) e suplementado com soro fetal de vitelo a 2,5% (FCS). Algodão hidrófilo ligado 25 ml frascos cónicos de Brucella caldo preparado como acima, foram inoculadas com H. pylori
(~ 10 6 UFC /ml) [11]. Os frascos foram incubados durante 3-5 dias num gabinete microaerofílica com agitação a ~ 150 rpm. Após a incubação, aliquotas de 100 ul de meio foram plaqueadas em placas de agar de brucela suplementado com 7% de sangue de carneiro para determinar as contagens viáveis.
Tempo Tempo
curso estudos de viabilidade curso dos compostos bioactivos foram configurado da mesma maneira que os testes de MIC acima, mas os caldos foram amostrados a cada hora ao longo do primeiro 4 h e, em seguida, novamente com 6, 9, 12, 24, 48 e 72 h, para se verificar a contagem viável. H. pylori
ATCC26695 foi utilizado como inoculo para o estudo.
Para efeitos de comparação, o antibiótico conhecido tal como a amoxicilina e foi utilizada E. coli
(NCIM2089) foi utilizado como um controlo bacteriano padrão diferente de H. pylori
.
efeitos de compostos bioativos no H. pylori morfologia
para verificar o efeito de compostos bioativos sobre a morfologia do H. pylori
, as lâminas foram preparadas a partir de amostras acima do primeiro quatro horas, coradas com Giemsa e observados sob imersão em óleo.
Medição da actividade bactericida a pH ácido
os efeitos do pH sobre as actividades antibacterianas de eugenol e cinamaldeído foram efectuadas como anteriormente relatado [25, 26]. O pH do tampão foi ajustado a 4,00 utilizando 100 mM de tampão de citrato (pH 5,2) suplementado com ureia 10 mM e o pH foi ajustado a 7,00 utilizando tampão fosfato 10 mM (pH 6,8). H. pylori
ATCC26695 (~ 10 7 CFU /ml) foi inoculada em 5 ml de meio com 0,1% de DMSO ao qual várias concentrações dos compostos foram adicionados. Todos os frascos foram incubados a 37 ° C. Vinte uL das amostras foram tomadas a 0, 15, 30 e 60 minutos após a inoculação para enumerar o número de células viáveis.
Teste para o desenvolvimento de resistência a compostos bioactivos
Para investigar o desenvolvimento de resistência, isto é, cinco estirpes ATCC26695, MS-27 (sensível a todos os três antibióticos), MS-1 (resistente a todos os três antibióticos), eM-8 (resistente ao metronidazol, claritromicina e sensíveis a amoxicilina), e MS-15 (apenas resistente ao metronidazol ), foram cultivadas em agar em concentrações inibitórias sub- (0,25 e 0,5 ug /ml) de eugenol e cinamaldeído durante 10 passagens. Todos os experimentos acima descritas foram repetidas três vezes.

Resultados da actividade antibacteriana contra H. pylori
MICs de antibióticos por H. pylori
foram determinados. A estirpe ATCC26695 era sensível (MIC < 0,016 ng /ml) para todas as três drogas testadas. Vinte (66,7%) de isolados clínicos (MS1-8, 10, 12, 14 - 17, 20, 23 - 26 e MS28) do nosso laboratório foram resistentes ao metronidazol (MIC > 8 ug /ml), 2 (6,7%) isolados clínicos (MS1 & 8) eram resistentes a claritromicina (MIC > 2 ug /ml) e 1 (3,3%) isolado clínico (MS1) era resistente a amoxicilina (MIC > 0,5 ng /ml) [27] (Tabela 1) .table 1 Sensibilidade de H. pylori
cepas (n = 30) a diferentes antibióticos
antibióticos
Sensitive (% )
Resistência (%)
Range (ug /ml)
MIC27 (ug /ml)
Metronidazol
10 (33,3)
20 (66,7) Art < 0,5 - > 256 Art > 8
Claritromicina
28 (93,3) Página 2 (6.7) Art < 0,5 - > 256 Art > 2
Amoxicilina
29 (96,7)
1 (3.3) Art < 0,5 - > 256 Art > 0,5
na preliminar, tanto o compostos deu cerca de 15 zonas de inibição mm para todos os isolados clínicos e cepa padrão (H. pylori
ATCC26695). Esta in vitro
efeito antimicrobiano dos compostos bioactivos demonstraram que ambos os compostos foram capazes de inibir completamente o crescimento de todas as estirpes sensíveis (ambos & resistentes) a uma concentração de 2 ug /ml. Para E. coli
(NCIM-2089), MIC de eugenol e cinamaldeído foi de 1 ug /ml.
Tempo curso
Como ambos os compostos eram activos a uma concentração de 2 ug /mL, foi examinada a matando decurso no tempo da curva de ambos os compostos a concentrações diferentes, isto é, 1 ug /mL, 2 ug /ml e 4 ng /ml. Eugenol inibiu completamente o crescimento de H. pylori ATCC 26695
a 2 ug /ml de concentração de 9 horas de incubação. O crescimento foi completamente inibida em apenas 6 horas, quando a CIM foi duplicada (4 ug /ml). Alguns inibição de crescimento foi observada na MIC de 1 jig /ml, onde até 6 th horas observou-se uma diminuição de ~ 1,6 log, em seguida, posteriormente, não houve efeito do composto sobre a bactéria (Figura 1). Cinamaldeído ATCC26695 inibiu totalmente a 2 ug /ml em 12 horas e em 9 horas com o dobro da MIC (4 ug /ml). No entanto, na metade da MIC (1 ug /ml), foi observado um pequeno efeito até ao 3 rd horas e houve uma redução de 0,6 log sem efeito inibitório posterior (Figura 1). Figura 1 vez estudos de viabilidade curso de eugenol e cinamaldeído com H. pylori ATCC26695. ATCC26695 foi exposto a eugenol em concentrações de (◆) 4 ug /ml, (■) 2 ug /mL, (▴) 1 ug /ml, (●) de controlo, e para cinamaldeído (◊) 4 ug /ml, (▫ ) 2 ug /mL, (△) 1 ug /ml. limite de detecção foi mostrado com uma linha reta. Os controlos foram mantidos com 0,1% de DMSO.
O curso de tempo de acção letal dos compostos bioactivos sobre a E. coli
(NCIM-2089) foi estudado em três concentrações diferentes (1 mg /ml, 2 ng /mL & 0,5 ug /ml). A 1 ug /ml, o eugenol inibiu E. coli
após 1 hora de incubação Considerando cinamaldeído inibiu E. coli
após 75 minutos de incubação (Figura 2). Figura 2 Efeitos de eugenol e cinamaldeído sobre o crescimento de E. coli NCIM-2089. E. coli
foi exposto a eugenol em concentrações de (◆) 2 ug /ml, (■) 1 ug /ml, (▲) 0,5 ug /ml, (●) de controlo, e para cinamaldeído em concentrações de (◊ ) 2 ug /ml, (D) 1 ug /ml, (△) 0,5 ug /ml. limite de detecção foi mostrado com uma linha reta. Os controlos foram mantidos com 0,1% de DMSO.
Para comparar a eficácia dos nossos compostos bioactivos contra H. pylori
, estudou-se o efeito de um antibiótico comum (amoxicilina) em diferentes concentrações, tais como 1 ug /ml, 0,1 ug /ml e 0,01 ug /ml, com uma MIC de < 0,016 ug /ml. Não houve inibição de H. pylori
visto na concentração de 0,01 ug /ml. Mas a inibição foi observada a uma concentração de 0,1 ug /ml até ao 4 th horas de incubação. No entanto, a bactéria foi completamente inibida com uma concentração de 1 ug /ml, pelo 12 th horas de incubação (Figura 3). Figura 3 Efeito de amoxicilina sobre o crescimento de H. pylori (ATCC26695). ATCC26695 foi exposta a concentrações de pelo ◊ () 1 ug /ml, (■) de 0,1 ug /ml, (▴) 0,01 ug /ml, (○) de controlo. O limite de detecção foi mostrado com uma linha recta.
H. pylori
morfologia
observação microscópica de lâminas revelou que a concentrações elevadas de ambos os compostos bioactivos (4 ug /ml) e, após 4 horas de incubação, ~ 70% das células assumiram formas cocóide com menos organismos em forma de espiral.
Efeito dos compostos bioactivos sobre o crescimento de H. pylori
em tampões a pH ácido
a viabilidade da estirpe ATCC 26695 era a pH ácido investigada usando o eugenol e cinamaldeído a várias concentrações (2 ug /ml, 4 ng /ml e 1 ug /ml). Como mostrado na Figura 4, ambos os compostos revelaram actividade aumentada em pH ácido (pH 4,0) e uma dose também foi observada actividade bactericida dependente. A uma concentração de duas vezes o MIC (4 ug /ml), o eugenol foi encontrado para inibir completamente as bactérias em cerca de 1 hora de incubação. Cinamaldeído também revelaram actividade bactericida de uma maneira semelhante, mas não inibiu o organismo totalmente (depois de uma hora de incubação, houve uma diferença de 0,2 log). Para ambos os compostos, quando comparado a um pH ácido e neutro, encontramos uma diferença logarítmica de 1,5 após uma hora de incubação a MIC de 2 ug /ml. Figura 4 Efeito do eugenol e cinamaldeído sobre o crescimento de H. pylori (ATCC26695) a um pH baixo. ATCC26695 foi exposto a eugenol a pH 4 (linhas a cheio) e pH 7 (linhas a tracejado) em concentrações (◆ ou ◊) 4 ug /ml, (■ ou □) 2 ug /ml, (SS ou △) 1 ug /ml, ( ●) controle. O limite de detecção foi mostrado como uma linha recta. Os controles foram mantidos com Teste de DMSO.
0,1% para resistência a eugenol e cinamaldeído
Nós investigamos se H. pylori
iria adquirir resistência aos compostos bioativos. H. pylori seleccionados
estirpes (ATCC26695, MS-27, o MS-1, MS-8 e MS-15) não adquiriram resistência a ambos os compostos bioactivos em concentrações inibitórias sub- (0,25 e 0,5 ug /ml), mesmo após 10 passagens.
Discussão
Erradicação do H. pylori
com a monoterapia é difícil e muitas vezes resulta em mau resultado clínico [28]. Atualmente, está sendo usado um inibidor da bomba de protões (IBP) com base terapia tripla. Embora ele está tendo uma taxa de sucesso de 80 a 90% [29], problemas como falha no tratamento e contra-indicações para alguns pacientes são comuns. Além disso, o grande problema no tratamento de infecção por H. pylori é
resistência a drogas a emergir rapidamente durante o tratamento com antibióticos diferentes [30]. Por causa da prevalência do H. pylori
cepas resistentes a antibióticos, a busca por agentes não antibióticos seguros e eficazes é essencial.
No sistema médico tradicional indiana, um número de plantas e produtos vegetais são conhecidos por possuir potente propriedades medicinais, sugerindo que as plantas, produtos de plantas e seus extractos podem ser úteis para condições médicas específicas. Daí em nosso esforço para identificar os compostos mais recentes, que podem inibir a H. pylori
crescimento, testamos eugenol e cinamaldeído. Estes compostos já foram encontrados para inibir 10 bactérias patogênicas diferentes múltiplas drogas resistentes, como E. coli
, Staphylococcus
, Proteus
, Klebsiella
, Enterobacter
e Pseudomonas
isolado a partir de seres humanos [20, 21]. Nos nossos estudos, o eugenol e cinamaldeído completamente inibida todas as estirpes (tanto sensível & resistentes) a uma concentração de 2 ug /ml. Esta concentração de inibidor é muito menor quando comparada com as CIMs previamente relatados {allicins: 6-12 ug /mL, óleo de alho: 8-32 ug /ml de [11] e ajoenes: 10-25 ug /ml de [31]}. Os nossos compostos também provou ser mais potente do que thiosulfinate {40 ug /ml de [19]}, {vinyldithiins < 100 ug /mL [31]}, galato de epigalocatequina {50-100 ug /ml de [32]} e {alho em pó 250 ug /mL [11]}. Online em estudos de viabilidade curso de tempo, verificou-se que o eugenol e cinamaldeído inibida H. pylori
ATCC26695 a 2 ug /ml de concentração dentro de 9 e 12 horas de incubação, respectivamente. efeitos altamente potentes de alguns óleos essenciais de capim-limão em H. pylori
foram previamente descritos [26]. No entanto, as nossas observações podem ser mais precisos com o facto de que foi utilizado princípios activos e não os extractos ou óleos como o usado por Ohno et al., [26]. Estes óleos essenciais podem conter substâncias desconhecidas que podem fornecer efeitos sinérgicos, inibitórios. Eugenol nos nossos estudos foi encontrado para ser um antimicrobiana potente do que os óleos essenciais de Ohno e colaboradores [26], enquanto o efeito de cinamaldeído foi aproximadamente equivalente à dos óleos usados ​​por eles. Além do mais, os nossos compostos foram mais potentes do que a amoxicilina antibiótico comum, que inibiu a H. pylori
ATCC26695 em 12 th horas (semelhante ao cinamaldeído), eugenol inibiu o crescimento microbiano no 9 th horas de incubação próprio , a sua concentração inibitória mínima. A amoxicilina foi encontrado para inibir completamente as bactérias numa concentração mais elevada (1 mg /ml), que é a concentração inibitória mínima (0,016 ug /mL) (Figura 3). Como H. pylori
reside no estômago, onde os níveis de pH são inferiores a 3,0, é importante para avaliar a actividade e a estabilidade de um composto a um pH acídico. Em nosso estudo, H. pylori
isolados sobreviveu a um pH de 4,0, apesar de alguns relatórios mostrando H. pylori
sobrevivência em pH-3.0 [25], e os efeitos bactericidas dos compostos bioativos foram encontrados para ser mais forte, mesmo em baixa pH. Vários agentes que têm efeitos bactericidas contra H. pylori
são dependentes do pH (por exemplo, sódio Ecabet é activa a pH ácido [25] e cathechin chá é activa a um pH alcalino [33]). Além disso
, nós descobriram que o organismo não se desenvolveu qualquer resistência para os compostos de teste, mesmo após 10 passagens sucessivas crescidas em concentrações sub-inibidoras (0,25 e 0,5 ug /ml) [21], enquanto H. pylori
estirpes adquirido resistência a amoxicilina e claritromicina após 10 passagens sequenciais como relatado anteriormente [26, 34]. Além disso, estes compostos bioativos teve atividades bactericidas equivalentes contra ambos os H. pylori
cepas sensíveis e resistentes.
Eugenol e cinnamaldehyde formam uma parte da dieta regular em países tropicais desde idades. Muitos relatórios sugerem que estes compostos não são tóxicos nas doses a ser consumido [34], e que são conhecidos por sua propriedades antimicrobianas e antioxidantes [21, 36]. Além disso, para curar úlcera péptica, ou para evitar o stress oxidativo, antioxidantes prescrição é uma prática bastante comum hoje em dia com os praticantes médicos. Como ambos estes compostos são antioxidantes naturais [37], seus benefícios podem ser múltiplas. Dois estudos em animais realizados no passado sugerem que um extracto de casca de canela tomado por via oral pode ajudar a prevenir a úlcera de estômago [36] e um estudo descrito eugenol ser tanto anti-inflamatória e antiulcerogênico [38]. Utilizou-se tão cedo como 1950 para o tratamento da doença da úlcera [39]. Dado que todas as vantagens observadas para os dois compostos bioactivos testados, os nossos dados não deve ser interpretado como a certificação dos compostos em aplicação clínica até à sua estabilidade, especificidade e eficácia geral é estabelecido em diferentes laboratórios e contra diferentes estirpes bacterianas. Estudos adicionais são, por conseguinte, claramente necessária no contexto de reprodutibilidade destes resultados sob diferentes condições de laboratório.

Conclusão Os dados obtidos neste estudo mostram que o eugenol e cinamaldeído a 2 ug /ml produzir diminuição significativa da viabilidade do organismo H. pylori
, independentemente da estirpe. A actividade destes compostos em níveis baixos de pH podem ajudá-los a alcançar a sua eficácia em um ambiente como o estômago humano. Nós confio estes resultados são encorajadores, tendo em vista crescentes falhas no tratamento e resistência a antibióticos na área da H. pylori
gestão. Adicional in vivo
estudos e ensaios clínicos seriam necessários para justificar e ainda avaliar o potencial destes compostos como H. pylori
agentes anti.
Declarações
Agradecimentos
SMA, HP, LVR e CMH gostaria de agradecer a Universidade Grants Comissão, Nova Deli para fornecer apoio financeiro para carryout esta investigação. NA e LAS gostaria de agradecer ao http ISOGEM:... //Www isogem org para o apoio dos arquivos enviados originais para imagens
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