Las actividades antimicrobianas de eugenol y Cinnamaldehyde contra el patógeno gástrico Helicobacter pylori humana

Las actividades antimicrobianas de eugenol y Cinnamaldehyde contra el patógeno humano gástrica por Helicobacter pylori
Resumen Antecedentes

erradicación de Helicobacter pylori
es un objetivo importante en la superación de las enfermedades gástricas. Muchos regímenes están disponibles en la actualidad, pero ninguno de ellos pudo alcanzar el éxito en la erradicación de 100%. Eugenol y cinamaldehído que se utilizan comúnmente en diversas preparaciones alimenticias que se sabe que poseen actividad antimicrobiana contra un amplio espectro de bacterias.
Apunta Francia El presente estudio se realizó para evaluar los efectos in vitro
en eugenol y de cinamaldehído en contra H. pylori indígena y estándar
cepas, sus concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) y los efectos letales en el curso del tiempo varios pH.
Métodos
Un total de 31 cepas (29 indígena y una cepa estándar de H. pylori
ATCC 26695, una cepa de E. coli
NCIM 2089) fueron seleccionados. método de dilución en agar se utilizó para la determinación de los patrones de sensibilidad a los fármacos de aislados a los antibióticos de uso común y método de dilución en caldo para los compuestos de ensayo.
Resultados
Eugenol y cinamaldehído inhibió el crecimiento de todos los 30 H. pylori
cepas probadas, a una concentración de 2 mg /ml, en las 9 y 12 horas de incubación, respectivamente. A pH ácido, se observó aumento de la actividad tanto para los compuestos. Además, el organismo no se desarrolló ninguna resistencia hacia estos compuestos incluso después de 10 pasajes cultivadas a concentraciones sub-inhibidor.
Conclusión
Estos resultados indican que los dos compuestos bioactivos que probamos pueden impedir H. pylori
crecimiento de
vitro, sin necesidad de adquirir ningún tipo de resistencia.
Introducción
Helicobacter pylori
fue descubierto por primera vez en 1982 y posteriormente fue encontrado para ser un agente etiológico importante para la gastritis [1], las úlceras pépticas [2] y gástrica malignidad [3]. Se estima que la mitad de la población mundial está infectada con H. pylori
[4]. Numerosas evidencias clínicas revelan que la erradicación de H. pylori
como resultado una mejora de la gastritis y disminuye drásticamente la tasa de recidiva de las úlceras gástricas y duodenales [5, 6]. H. pylori
las tasas de transporte son cerca de 80-90% en los países en desarrollo [7], con un alto riesgo de cáncer gástrico y los regímenes de antibióticos contra H. pylori ¿Cuáles son a menudo ineficaces en esas poblaciones [8]. Además de esto, los efectos secundarios no deseables [9], el incumplimiento entre los pacientes [10] y el costo de los regímenes de antibióticos [11] son ​​algunos otros factores para su ineficacia. Por lo tanto hay una necesidad de desarrollar enfoques alternativos para suprimir /curar la infección.
Desde la antigüedad, especias y condimentos se han considerado indispensable en el arte culinario, ya que se usan para sazonar los alimentos. También estas especias fueron reconocidos por sus propiedades fisiológicas y medicinales. Se presume que la eficacia de amplio espectro de estas especias [12-14] puede proporcionar una base adecuada para nuevas terapias de H. pylori
contra. Algunos de los estudios epidemiológicos sugieren una relación inversa entre la aparición de cáncer de estómago (para los que la infección por H. pylori
es un factor de riesgo conocido) y el consumo de los vegetales allium [15, 16]. Hay informes de la actividad antimicrobiana in vitro Red de muchos extractos de especias (y no sus principios activos) sobre H. pylori
[17, 18]. Pero los principios activos de los componentes de ajo y ajo se han intentado [11, 19]
. Eugenol, un compuesto fenólico es el principal componente de clavo de olor (Eugenia caryophillis
) de aceite. Cinamaldehído es un aldehído aromático y el componente principal del extracto de corteza de canela (Cinnamomum verum
). Estos dos compuestos están presentes en los aceites esenciales de muchas plantas y se han demostrado ser activo contra muchas bacterias patógenas [20, 21], hongos [21, 22] y virus [14]. Hay una escasez de información sobre los efectos de estos compuestos bioactivos en H. pylori
. Por ello se realizó el presente estudio para evaluar la eficacia de eugenol y cinamaldehído como H. pylori
agentes anti.
Materiales y métodos
H. pylori
cepas de H. pylori
Treinta
cepas y una E. coli cepa
(NCIM2089) se utilizaron en el estudio. Veintinueve cepas que fueron designados como MS-1 a MS-29 se aislaron a partir de muestras de biopsia gástrica (15 de úlcera duodenal, 10 de dispepsia no ulcerosa y 4 de los sujetos con úlcera gástrica), después de consentimiento informado de los pacientes que se han sometido gastrointestinal superior endoscopia en Deccan Colegio de Ciencias médicas, Hyderabad, India. También se incluyó una cepa de H. pylori gratis (ATCC26695)
El aislamiento primario se realizó en agar Brucella (Becton, Dickinson & Co, Sparks, USA)., complementado con un 7% (V /V) de sangre de oveja y antibióticos (vancomicina, 6 mg /L; anfotericina B, 3 mg /L; Polimixina B, 2500 UI /L; Hi-Media, Mumbai, India). El pH final de los medios de comunicación se ajustó a 7,2. H. pylori
se identificó por su típica morfología de las colonias, tinción de Gram, el crecimiento microaerophilic a 37 ° C y por otras pruebas bioquímicas tales como oxidasa, catalasa y ureasa. Estas cepas se conservaron a -80 ° C en caldo Brucella (Becton, Dickinson & Co, Sparks, EE.UU.) que contiene 10% (V /V) de suero de ternera fetal (FCS) y 20% (V /V) de glicerol compuestos bioactivos
preparaciones comerciales de compuestos bioactivos tales como eugenol y cinamaldehído se usaron en nuestros experimentos. Todas las cepas se sembraron en agar Brucella suplementado con sangre de oveja 7% y se cultivaron durante 48 horas en condiciones microaeróbicas. El crecimiento bacteriano se recogió de las placas y se resuspendió en solución salina estéril. El inóculo fue preparado para contener ~ 10 8 CFU /ml mediante el ajuste de la suspensión para que coincida con el patrón de turbidez McFarland No-4 [23].
La actividad antibacteriana de los antibióticos estándar
concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) para antibióticos, tales como metronidazol, amoxicilina y claritromicina se determinaron por el método de dilución en agar, usando dos incrementos de plegado (0,016 a 256 g /ml) en agar Mueller Hinton (MHA) placas suplementadas con sangre de oveja 7% y se incubaron durante 3 días a 37 ° C en un armario microaerophilic. CIMs se determinaron como la concentración más baja de los antibióticos que inhiben el crecimiento visible [24] utilizando ~ 10 6 UFC de inóculo.
La actividad antibacteriana de eugenol y cinamaldehído
La selección primaria sobre The difusión en disco de Kirby-Bauer se utilizó la prueba de susceptibilidad para comprobar la actividad de los compuestos bioactivos en H. pylori
. El inóculo preparado como se describe anteriormente se inoculó en MHA suplementado con sangre de oveja 7% y discos compuestos bioactivos (preparado mediante la carga de los respectivos compuestos en concentración variable sobre los discos de papel de filtro estéril) se colocaron en las placas con el dispensador estéril y se incubó en la atmósfera microaerobia a 37 ° C durante 3 días.
concentración inhibitoria mínima (CIM) de compuestos bioactivos
Como no había ningún método establecido para determinar la actividad antibacteriana de los compuestos bioactivos contra H. pylori
, en serie dos diluciones de eugenol y cinamaldehído se hicieron en una preparación de 5 ml de caldo de Brucella (pH-7) con 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO; que mejora la solubilidad del compuesto) y suplementado con suero de ternera fetal al 2,5% (FCS). De algodón enchufado matraces de 25 ml cónicos de caldo Brucella preparado como anteriormente, se inocularon con H. pylori
(~ 10 6 CFU /ml) [11]. Los matraces se incubaron durante 3-5 días en un armario microaerophilic con agitación a ~ 150 rpm. Después de la incubación, 100 ml de alícuotas del medio se sembraron en placas de agar brucella suplementado con sangre de cordero al 7% para determinar los recuentos viables.
Curso
estudios de viabilidad curso de los compuestos bioactivos se han creado de la misma manera como las pruebas de CMI por encima, pero los caldos se tomaron muestras cada hora durante las primeras 4 h y luego de nuevo a las 6, 9, 12, 24, 48 y 72 h para comprobar el recuento viable. H. pylori
ATCC26695 se utilizó como inóculo para el estudio.
Para la comparación, antibiótico conocido como amoxicilina y se utilizó E. coli
(NCIM2089) se utilizó como un control bacteriano estándar distinto de H. pylori
.
Efectos de compuestos bioactivos en H. pylori morfología
para comprobar el efecto de los compuestos bioactivos en la morfología de H. pylori
, las diapositivas se prepararon a partir de las muestras por encima de la primera cuatro horas, teñidas con Giemsa y se observan con aceite de inmersión.
Medición de la actividad bactericida a pH ácido
los efectos del pH sobre la actividad antibacteriana de eugenol y cinamaldehído se realizaron como se informó anteriormente [25, 26]. El pH del tampón se ajustó a 4,00 usando 100 mM de tampón de citrato (pH 5,2) suplementado con urea 10 mM y el pH se ajustó a 7,00 usando tampón fosfato 10 mM (pH 6,8). H. pylori
ATCC26695 (~ 10 7 CFU /ml) se inoculó en al que se añadieron diversas concentraciones de los compuestos 5 ml del medio con 0,1% de DMSO. Todos los matraces se incubaron a 37 ° C. Twenty l de las muestras se tomaron a 0, 15, 30 y 60 minutos después de la inoculación para enumerar el número de células viables.
De prueba para el desarrollo de la resistencia a compuestos bioactivos
a investigar el desarrollo de la resistencia, es decir, cinco cepas ATCC26695, MS-27 (sensible a todos los tres antibióticos), MS-1 (resistente a todos los tres antibióticos), MS-8 (resistente a metronidazol, claritromicina y sensible a la amoxicilina), y MS-15 (resistente solamente a metronidazol ), se cultivaron en agar en concentraciones inhibitorias sub (0,25 y 0,5 mg /ml) de eugenol y cinamaldehído durante 10 pasajes. Todos los experimentos mencionados anteriormente se repitieron tres veces.
: Resultados de la actividad antibacteriana contra H. pylori
MIC de antibióticos para H. pylori
fueron determinados. ATCC26695 cepa era sensible (MIC < 0,016 g /ml) a todos los tres fármacos probados. Veinte (66,7%) aislados clínicos (MS1-8, 10, 12, 14 - 17, 20, 23 - 26 y MS28) de nuestro laboratorio fueron resistentes a metronidazol (CIM > 8 mg /ml), 2 (6,7%) aislados clínicos (MS1 & 8) fueron resistentes a la claritromicina (CIM > 2 mg /ml) y 1 (3,3%) aislado clínico (MS1) fue resistente a la amoxicilina (MIC > 0,5 mg /ml) [27] (Tabla 1) .Tabla 1 sensibilidad de H. pylori
cepas (n = 30) a diferentes antibióticos
antibiótica
La sensible (% ) guía empresas Resistencia (%) guía empresas Rango (g /ml) guía empresas Mic27 (g /ml) guía empresas metronidazol
10 (33,3)
20 (66,7) Hotel < 0,5 - > 256 Hotel > 8
claritromicina
28 (93,3) página 2 (6.7) Hotel < 0,5 - > 256 Hotel > 2
amoxicilina
29 (96,7)
1 (3.3) Hotel < 0,5 - > 256 Hotel > 0,5
En la selección preliminar, tanto el compuestos dieron aproximadamente 15 mm zonas de inhibición a todos los aislados clínicos y cepa estándar (H. pylori
ATCC26695). Esta in vitro
efecto antimicrobiano de los compuestos bioactivos demostró que tanto los compuestos eran capaces de inhibir completamente el crecimiento de todas las cepas (tanto sensibles y & resistente) a una concentración de 2 mg /ml. Para E. coli
(NCIM-2089), MIC de eugenol y cinamaldehído fue de 1 mg /ml.
Supuesto
Como tanto los compuestos fueron activos a una concentración de 2 mg /ml, se analizó la matando curso temporal curva de tanto los compuestos a diferentes concentraciones, es decir, 1 mg /ml, 2 mg /ml y 4 mg /ml. Eugenol inhibió completamente el crecimiento de H. pylori ATCC 26695
a 2 mg de concentración /ml en 9 horas de incubación. El crecimiento se inhibió completamente en sólo 6 horas cuando el MIC se duplicó (4 mg /ml). Algunos inhibición del crecimiento se observó en el MIC de 1 g /ml, donde hasta 6 TH horas se observó una disminución de ~ 1,6 Log a continuación, después no hubo ningún efecto del compuesto sobre la bacteria (Figura 1). Cinnamaldehyde inhibida ATCC26695 totalmente a 2 g /ml en 12 horas y en 9 horas en el doble de la MIC (4 mg /ml). Sin embargo, en medio de la MIC (1 mg /ml), un poco efecto se observó hasta el 3 horas rd y hubo una disminución de 0,6 Log sin efecto inhibidor posterior (Figura 1). Figura 1 vez los estudios de viabilidad curso de eugenol y cinamaldehído con H. pylori ATCC26695. ATCC26695 fue expuesto a eugenol a concentraciones de (◆) 4 mg /ml, (■) 2 g /ml, (▴) 1 g /ml, el control (●), y a cinamaldehído (◊) 4 mg /ml, (▫ ) 2 mg /ml, (△) 1 mg /ml. El límite de detección se muestra con una línea recta. Los controles se mantuvieron con un 0,1% de DMSO. México La evolución en el tiempo de acción letal de los compuestos bioactivos en E. coli gratis (NCIM-2089), fue estudiada en tres concentraciones diferentes (1 g /ml, 2 mg /ml & 0,5 g /ml). A 1 mg /ml, eugenol inhibe E. coli
después de 1 hora de incubación, mientras que cinamaldehído inhibida E. coli
después de 75 minutos de incubación (Figura 2). Figura 2 Efectos de eugenol y cinamaldehído sobre el crecimiento de E. coli NCIM-2089. E. coli
se expuso a eugenol a concentraciones de (◆) 2 g /ml, (■) 1 g /ml, (▲) 0,5 g /ml, (●) control, y para cinamaldehído en concentraciones de (◊ ) 2 g /ml, (Box) 1 g /ml, (△) 0,5 g /ml. El límite de detección se muestra con una línea recta. Los controles se mantuvieron con 0,1% de DMSO.
Para comparar la eficacia de nuestros compuestos bioactivos contra H. pylori
, se estudió el efecto de un antibiótico común (amoxicilina) a diferentes concentraciones, tales como 1 g /ml, 0,1 g /ml y 0,01 g /ml con una MIC de < 0,016 g /ml. No hubo inhibición de H. pylori
visto a la concentración de 0,01 g /ml. Pero la inhibición se observó a una concentración de 0,1 g /ml hasta la 4 TH horas de incubación. Sin embargo, la bacteria se inhibió completamente a una concentración de 1 g /ml, por el 12 TH horas de incubación (Figura 3). Figura 3 Efecto de la amoxicilina en el crecimiento de H. pylori (ATCC26695). ATCC26695 fue expuesto a a concentraciones de (◊) 1 g /ml, (■) 0,1 g /ml, de control (▴) 0,01 g /ml, (○). límite de detección se muestra con una línea recta.
H. pylori
morfología
La observación microscópica de diapositivas reveló que a altas concentraciones de tanto los compuestos bioactivos (4 mg /ml) y después de 4 horas de incubación, ~ 70% de las células asume formas cocoides con menos microorganismos en forma de espiral.
efecto de los compuestos bioactivos en el crecimiento de H. pylori
en tampones a pH ácido
la viabilidad de la cepa ATCC 26695 en un pH ácido fue investigado utilizando eugenol y cinamaldehído a diversas concentraciones (2 mg /ml, 4 mg /ml y 1 mg /ml). Como se muestra en la Figura 4, tanto los compuestos revelados aumento de la actividad a pH ácido (pH-4,0) y una dosis también se observó actividad bactericida dependiente. A una concentración de el doble de la MIC (4 mg /ml), se encontró eugenol para inhibir completamente las bacterias en alrededor de 1 hora de incubación. Cinnamaldehyde también reveló la actividad bactericida de la manera similar pero no inhibió el organismo totalmente (después de una hora de incubación había una diferencia de 0,2 Log). Por tanto los compuestos, cuando se compara a pH ácido y neutro, se encontró una diferencia Log de 1,5 después de una hora de incubación a MIC de 2 mg /ml. Figura 4 Efecto de eugenol y cinamaldehído sobre el crecimiento de H. pylori (ATCC26695) a pH bajo. ATCC26695 fue expuesto a eugenol a pH 4 (líneas continuas) y pH 7 (líneas de puntos) a concentraciones (◆ o ◊) 4 g /ml, (■ o □) 2 g /ml, (ß o △) 1 mg /ml, ( ●) control. El límite de detección se muestra como una línea recta. Los controles se mantuvieron con la prueba de 0,1% de DMSO. Opiniones de resistencia a eugenol y cinamaldehído
Investigamos si H. pylori
sería adquirir resistencia a los compuestos bioactivos. H. pylori seleccionados
cepas (ATCC26695, MS-27, MS-1, MS-8 y MS-15) no adquirieron resistencia a ambos los compuestos bioactivos en concentraciones sub inhibidoras (0,25 y 0,5 g /ml), incluso después de 10 pasajes.
Discusión
la erradicación de H. pylori
con la monoterapia es difícil y con frecuencia da lugar a los pobres resultados clínicos [28]. En la actualidad se está usando un inhibidor de la bomba de protones (IBP) en base triple terapia. A pesar de que está teniendo una tasa de éxito del 80 al 90% [29], problemas como el fracaso del tratamiento y contraindicaciones para algunos pacientes son comunes. Además, el principal problema en el tratamiento de H. pylori
infección es la resistencia a fármacos rápidamente emergiendo durante el tratamiento con diversos antibióticos [30]. Debido a la prevalencia de H. pylori
cepas resistentes a los antibióticos, la búsqueda de agentes no antibióticos seguros y eficaces es esencial.
Sistema médico tradicional de la India, se conocen una serie de plantas y productos vegetales que poseen potente propiedades medicinales, lo que sugiere que las plantas, productos vegetales y sus extractos pueden ser útiles para condiciones médicas específicas. De ahí que en nuestro esfuerzo para identificar compuestos nuevos, que pueden inhibir el crecimiento de H. pylori
, hemos probado eugenol y cinamaldehído. Estos compuestos ya se han encontrado para inhibir 10 diferentes patógenos resistentes a múltiples drogas bacterias tales como E. coli
, Staphylococcus
, Proteus
, Klebsiella
, Enterobacter
, y Pseudomonas
aislado a partir de sujetos humanos [20, 21]. En nuestros estudios, eugenol y cinamaldehído inhibió completamente todas las cepas (tanto sensible & resistente) a una concentración de 2 mg /ml. Esta concentración inhibitoria es muy inferior cuando se compara con los PRM ya se ha informado {allicins: 6-12 g /ml, aceite de ajo: 8-32 g /ml [11] y ajoenes: 10-25 g /ml [31]}. Nuestros compuestos también ha demostrado ser más potente que el tiosulfinato {40 g /ml [19]}, vinyldithiins {< 100 g /ml [31]}, galato de epigalocatequina {50-100 g /ml [32]} y ajo en polvo { 250 mg /ml [11]}.
en los estudios de viabilidad curso de tiempo, se encontró que el eugenol y cinamaldehído inhibidas H. pylori
ATCC26695 en 2 mg de concentración /ml dentro de los 9 y 12 horas de incubación, respectivamente. efectos muy potentes de algunos aceites esenciales de hierba de limón sobre H. pylori
se han descrito anteriormente [26]. Sin embargo, nuestras observaciones pueden ser más exactos con el hecho de que hemos utilizado principios activos y no los extractos o aceites y usadas por Ohno et al., [26]. Estos aceites esenciales pueden contener sustancias desconocidas que podrían proporcionar efectos sinérgicos, inhibitorios. Eugenol en nuestros estudios se encontró que era un antimicrobiano potente que los aceites esenciales de Ohno y colegas [26] mientras que el efecto de cinamaldehído era aproximadamente equivalente a los aceites usados ​​por ellos. Además, nuestros compuestos eran más potentes que la amoxicilina antibiótico común, que inhibe H. pylori
ATCC26695 en 12 TH horas (similar a cinamaldehído), mientras que eugenol inhibe el crecimiento microbiano en el 9 TH horas de incubación en sí , a su concentración inhibitoria mínima. La amoxicilina se encontró para inhibir completamente las bacterias a una concentración más alta (1 mg /ml), que es la concentración mínima inhibitoria (0,016 g /ml) (Figura 3). Como H. pylori
reside en el estómago, donde los niveles de pH son más bajos que 3,0, es importante comprobar la actividad y la estabilidad de un compuesto a pH ácido. En nuestro estudio, el H. pylori aislamientos
sobrevivió a un pH de 4,0, a pesar de algunos informes que muestran H. pylori
supervivencia a pH 3,0 [25], y los efectos bactericidas de los compuestos bioactivos resultaron ser más fuerte, incluso a baja pH. Varios agentes que tienen efectos bactericidas contra H. pylori
dependen de pH (por ejemplo, ecabet de sodio es activa a pH ácido [25] y cathechin té es activa a pH alcalino [33]).
Además, encontraron que el organismo no se desarrolló ninguna resistencia a los compuestos de ensayo incluso después de 10 pases sucesivos cultivadas a concentraciones sub-inhibidor (0,25 y 0,5 g /ml) [21], mientras que las cepas de H. pylori
adquirido resistencia a amoxicilina y claritromicina después de 10 pasajes secuenciales como se informó anteriormente [26, 34]. Además, estos compuestos bioactivos tenían actividades bactericidas equivalentes tanto contra las cepas de H. pylori
susceptibles y resistentes. Opiniones y cinamaldehído eugenol forman parte de la dieta habitual en los países tropicales desde las edades. Muchos informes sugieren que estos compuestos no son tóxicos a las dosis que se consumen [34], y que son conocidos por su propiedades antimicrobianas y antioxidantes [21, 36]. Por otra parte, para curar la úlcera péptica, o para evitar que el estrés oxidativo, la prescripción de antioxidantes es una práctica normal en estos días con los profesionales de la medicina. A medida que estos dos compuestos son antioxidantes naturales [37], sus beneficios podrían ser múltiples. Dos estudios con animales realizados en el pasado sugieren que un extracto de corteza de canela tomados oralmente podría ayudar a prevenir la úlcera de estómago [36] y un estudio describió eugenol ser tanto anti-inflamatorio y antiulcerogenic [38]. Fue utilizado ya en 1950 para el tratamiento de la enfermedad de úlcera [39]. Dadas todas las ventajas que la observada para los dos compuestos bioactivos probados, nuestros datos no se deben interpretar como la certificación de los compuestos en la aplicación clínica hasta su estabilidad, especificidad y eficacia global se establece en diferentes laboratorios y en contra de diferentes cepas bacterianas. Estudios adicionales son, por tanto, evidente que se necesitan en el contexto de la reproducibilidad de estos resultados bajo diferentes condiciones de laboratorio.
Conclusión
Los datos obtenidos en este estudio muestran que el eugenol y el cinnamaldehyde a 2 mg /ml producen disminución significativa de la viabilidad del organismo H. pylori
, independientemente de la cepa. La actividad de estos compuestos a niveles bajos de pH puede ayudarles a alcanzar su eficacia en un entorno como el estómago humano. Confiamos estos resultados son alentadores, en vista de los crecientes fracasos de tratamiento y resistencia a los antibióticos en la zona de H. pylori
gestión. Adicional in vivo
estudios y ensayos clínicos que se necesitaría para justificar y además evaluar el potencial de estos compuestos como H. pylori
agentes anti.
Declaraciones
Agradecimientos
SMA, HP, y LVR CMH desea agradecer a la Universidad Comisión de Subvenciones, Nueva Delhi para proporcionar apoyo financiero para llevar acabo esta investigación. NA y LAS desean agradecer a la ISOGEM http:... //Www ISOGEM org para el apoyo de los archivos originales presentados para las imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los autores de los autores
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