A proteína endotelial lipase é promissor biomarcador urinário para o diagnóstico de câncer gástrico

A proteína lipase endotelial é biomarcador urinário promissora para o diagnóstico de câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns no mundo. Encontrar biomarcadores de diagnóstico eficazes na urina ou soro representaria a solução mais ideal para a detecção de câncer gástrico durante o exame físico anual. Este estudo foi avaliar o potencial de lipase endotelial (EL) como um biomarcador urinário para o diagnóstico do cancro gástrico.
Métodos
Os níveis de expressão EL foi medida utilizando transferência de Western e imuno-histoquímica em experiências de coloração (tecido, soro, e de urina) amostras de pacientes com câncer gástrico contra
pessoas saudáveis. Nós também verificamos os níveis de EL nas amostras de urina de outros tipos de câncer (pulmão, cólon e reto cancros) e lesões benignas (gastrite e leiomioma gastric) para verificar se EL era específico para câncer gástrico.
Resultado
Observamos uma separação clara entre os níveis de expressão de EL nas amostras de urina de 90 pacientes com câncer gástrico e de 57 voluntários saudáveis. Ele foi de aproximadamente 9,9 diminuição média vezes nos níveis de expressão de EL nas amostras de urina de câncer gástrico em comparação com os controles saudáveis ​​(P Art < 0,0001), alcançando um valor AUC 0,967 para o ROC (receiver operating characteristic) curva, demonstrando é altamente precisos como um marcador diagnóstico para câncer gástrico. Interessantemente, os níveis de expressão de EL em amostras de tecido e no soro não eram quase tão discriminativa como em amostras de urina (P
= 0,90 e P = 0,79
). Em experiências de imuno-histoquímica, expressão positiva da proteína EL foi encontrado em 67% (8/12) dos gástrica adjacente não canceroso e em 58% (7/12) das amostras de câncer gástrico. Não houve estatística significativa nos níveis de expressão desta proteína entre o câncer gástrico e os tecidos não cancerosos correspondentes (P
= 0,67).
Conclusões of the EL urinário como biomarcador de câncer gástrico de alta precisão que é potencialmente . aplicáveis ​​ao rastreio geral, com alta sensibilidade e especificidade
slides virtuais
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Palavras-chave
endotelial lipase Biomarcador gástrica diagnóstico de câncer de fundo
o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns no mundo, representando a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em homens e a quinta maior causa em mulheres [1]. Cerca de dois terços dos casos de câncer gástrico ocorrer em países menos desenvolvidos, que são quase três vezes maior per capita do que nos países desenvolvidos, como os países da Europa e América do Norte [2]. O câncer gástrico tem altas taxas de mortalidade, uma vez que não tem sintomas clínicos evidentes na fase inicial. Os estudos sugerem que, se o tumor foi detectado e ressecado na fase inicial, a taxa média de sobrevivência de 5 anos é relativamente elevada [3, 4]. Portanto, o diagnóstico e tratamento precoces representam a chave para melhorar o prognóstico de pacientes com câncer gástrico.
Embora grande quantidade de esforço foi colocado no desenvolvimento de tecnologia para facilitar o diagnóstico usando gastroscopia e análise imuno-histoquímica, a natureza invasiva desses procedimentos torna impraticável para triagem em larga escala para o câncer gástrico. biomarcadores de diagnóstico eficazes na urina ou soro representaria a solução ideal para o problema, que permite testes para câncer gástrico através de testes de sangue ou urina durante os exames físicos anuais. Vários marcadores séricos de diagnóstico têm sido propostos para o cancro gástrico, tais como [5] MG7-Ag, antigénio carcinoembrionário (CEA), MUC1 e MUC5AC [6]. O estado da técnica é que virtualmente todos eles sofrem de, em vez de baixa sensibilidade e especificidade no diagnóstico do cancro, e, portanto, não têm sido largamente utilizados clinicamente [7]. Em comparação com o tecido e no soro, de recolha de urina é relativamente mais fácil e menos invasiva. Pode ser mais adequado para rastreio em grande escala para a detecção do cancro [8]. Usando análises proteômicas comparativos, uma série de potenciais biomarcadores urinários foram propostos e bem testado para outros tipos de cânceres, como cistatina B e clusterina para câncer de bexiga [9, 10], anidrase carbônica IX e catepsina D para o câncer renal [11, 12], e ADAM12 para câncer de mama [13]. Para o cancro gástrico, diversos biomarcadores foram relatadas, tais como pepsinogénios I, prostaglandina E2, e solúvel em c-erbB-2 [14-16]. A capacidade de diagnóstico real para câncer gástrico ainda está para ser cuidadosamente avaliada, pois eles não têm sido amplamente utilizados no diagnóstico clínico. Portanto, existe claramente uma necessidade urgente para a identificação e validação de marcadores de diagnóstico novos e confiáveis ​​para o rastreio de câncer gástrico.
Nós já realizou um estudo da biologia do sistema para identificar biomarcadores candidatos potenciais para o diagnóstico de câncer gástrico. Nesse estudo, foram analisados ​​os dados de 80 pares de tecidos de câncer gástrico e tecidos não cancerosos adjacentes coletadas de pacientes com câncer gástrico uso de chips de microarray de expressão genética, e identificaram centenas de genes diferencialmente expressos em câncer contra
tecidos de controle [17 ]. Em seguida, treinou uma máquina de vetor de suporte (SVM) classificador base para prever quais desses genes diferencialmente expressos podem ter suas proteínas excretado na urina. Entre a proteína excretor previsto, encontramos EL mostra alta poder de discriminação em termos de sua expressão em amostras de urina de pacientes com câncer gástrico contra
pessoas saudáveis ​​[18].
Aqui nós estendemos o nosso estudo anterior com o objetivo de (a) mais confirmar que EL tem alto poder de discriminação entre amostras de urina de pacientes com câncer gástrico e pessoas saudáveis ​​com mais de um conjunto maior de amostras, e (b) demonstrar que EL é altamente específico para câncer gástrico, comparando suas abundâncias em amostras de urina de câncer gástrico com outro câncer tipos e lesões benignas.
Métodos
coleta de Amostra
Todas as amostras foram coletadas em três hospitais da Universidade de Jilin Norman Bethune Medical College, Changchun, na China e no Hospital do Câncer afiliada à Universidade médica de Xinjiang, Urumqi, China. Os tecidos com câncer gástrico e os tecidos não cancerosos correspondentes foram cirurgicamente ressecado de pacientes com câncer gástrico. As amostras de urina aleatória-captura de soro e de manhã foram obtidos dos pacientes com câncer antes da cirurgia. Estas amostras foram coletadas amostras, durante o período de março de 2011 a setembro de 2012. Um total de 90 casos de câncer gástrico (67males e 23 do sexo feminino; faixa etária: 31-85 anos) e 57 voluntários saudáveis ​​(30 homens e 27 mulheres; faixa etária : 29-76 anos) foram estudados. Os casos de câncer gástrico foram diagnosticados por análises histológicas como tipo intestinal e difuso de acordo com a classificação de Lauren. Além disso, as amostras de urina foram obtidas a partir de 9 pacientes pulmonares cancerosas, 10 a partir de pacientes com cancro do cólon, doentes com cancro do recto, 10 2 pacientes com gastrite, e 2 pacientes leiomioma gástricos, que são utilizados para verificar se EL é específico para o cancro gástrico. Os seguintes critérios foram utilizados na coleta de amostra: pacientes (i) de câncer não deveria ter iniciado qualquer tratamento de seu câncer; e (ii) os voluntários do grupo de controlo saudável não deve ter qualquer doença sistémica grave no passado. Um formulário de consentimento informado foi assinado por cada participante depois que eles foram informados sobre o objetivo do estudo, que foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa em Jilin University College of Medicine e Xinjiang Medical University, respectivamente. A tabela 1 resume as informações dos voluntários saudáveis ​​e doentes envolvidos neste study.Table 1 A informação de voluntários saudáveis ​​e doentes envolvidos neste estudo
Características
Tissue
Serum

urina
12
12
90
média de idade de câncer gástrico
(intervalo)
60 (42-76)
63 (84-39)
60 (31-85)
Sexo Masculino

6
7
67
Feminino
localização 6
5
23
Tumor
Cardia
3
2
39
Body
5
6
26
Antrum
3
4
16
Diffuse
1
0
9
Operation
Gastrectomia total 4
5
29
Subtotal Gastrectomia
8
7
61
classificação Lauren
Intestinal
5 página 4
39
difusa
7
8
51
tipo Histologia
alta ou moderada
5
5
43
Pobre ou indiferenciado
7
7
47
estágios tumorais
Ι e ΙΙ Página 2 4
31
ΙΙΙ e ΙV
10
8
59
profundidade de invasão
T1 e T2
5
9
30
T3 e T4
7 Sims 3
60
Nó de status
N0 Sims 3 Sims 3
29
N1 e N2 estatuto
9
9
61
Metástase
M0
5
10
71
M1
7 Página 2
19
O cancro do pulmão viajantes -
- 9
A média de idade (intervalo)
46 (42- 57)
O cancro do cólon viajantes -
- 10
A média de idade (intervalo)
53 (46-65)
câncer de reto
- -
9
A média de idade (intervalo)
62 (47-78)
12
12
57
A média de idade saudável
(intervalo)
60 (42 -76)
54 (41-72)
47 (29-76)
Gastrite /A inflamação crônica
- - Página 2
A média de idade (intervalo)
56 (43-69)
gástricas leiomioma Página 2
A média de idade (intervalo) Restaurant -
- 56 (51-62)
Western blot análise
os tecidos foram moídos a pó em azoto líquido e depois lisadas em tampão de extracção de proteína [0,5 mol /L de Tris · Cl (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 0,1 mmol /L de etileno-diamina-tetra aceticacid (EDTA) (pH 7,0) , 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 2,5 mg /mL de aprotinina, 1 mmol /l de ditiotreitol (DTT), 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio (SDS)]. Todos os reagentes foram adquiridos de Beyotime (Beyotime, Xangai, China). As amostras de soro e urina foram armazenados na presença de inibidor da protease (Roche, Basileia, Suíça) e centrifugou-se recipientes esterilizados (1000 × g durante 10 minutos a 4 ° C) para remover os componentes celulares. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 ° C (o armazenamento mais longo durante 6 meses). 2 ml de amostras de urina foram dialisadas contra água destilada através de uma membrana de filtração (Dinguo, Pequim, China) de 8 kDa de corte a 4 ° C e, em seguida, liofilizado a -20 ° C. amostras de urina liof ilizadas foram ressuspensas em 10 mM de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,5). As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o kit BCA Protein Assay (Beyotime, Xangai, China). níveis de creatinina urinária foram quantificados pelo método do picrato alcalino (reação de Jaffe) com creatinina um teste de rotina semi-Autoanalyser (Vital Micro 300, Países Baixos).
Western blot foi usado para medir os níveis de EL expressão. 20 ug de proteínas totais foram usados ​​na experiência. Todas as amostras foram separadas utilizando 4-15% de SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories Inc., EUA) e transferidas para uma membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories Inc., EUA). A membrana foi incubada em solução de bloqueio de leite 5% durante 2 horas à temperatura ambiente. A membrana foi incubada com um anticorpo primário EL policlonal de cabra anti-humana (1: 400; Santa Cruz Biotechnologies, EUA) à temperatura ambiente durante 1 hora, o qual foi lavado três vezes durante 5 minutos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida feito reagir com um anticorpo de coelho anti-cabra secundário (1: 5000; Beyotime, Xangai, China). Para tecidos, anticorpos β-actina (1: 1000; Santa Cruz Biotechnologies, EUA) foi recubated para assegurar a igualdade de carga. No final, a membrana foi completamente coberto com uma quantidade igual de solução de peróxido e potenciador de um ECL plus kit (Beyotime, Xangai, China) durante 1 minuto, e, em seguida, todas as membranas foram expostas à película. A densidade da banda foi quantificada utilizando Gel sistema Imagem (Tanon, Xangai, China). A quantidade fixa de 1 ng purificado padrão EL (R & D systems, Inc., EUA) foi utilizado como um controlo positivo para a calibração. Com consideração as variações na formação de urina e excreção, a densitometria de SR a partir de urina foi expressa em relação à concentração de creatinina urinária.

Imunohistoquímica Para medir os níveis de expressão em cancro EL contra
adjacentes tecidos de controlo não cancerosos, ambos os tipos de tecidos foram fixados durante 12-16 horas em 4% de para-formaldeído (pH 7,0), embebidos em parafina e cortada em 4 mm de espessura. Além disso, as lâminas foram cozidos a 60 ° C durante 30 minutos. A parafina foi removida utilizando xileno durante 30 minutos, e as secções foram re-hidratadas através de uma série de soluções de álcool antes do tratamento com ácido cítrico a 1 mM, pH 6,0, a 100 ° C durante 5 minutos, e com 1% H 2O 2 durante 30 minutos. Após ser lavada com água destilada, as secções foram incubadas à temperatura ambiente com 5% de soro de suíno em PBS durante 30 minutos e anticorpo EL (1: 400; Santa Cruz Biotechnologies, EUA) diluídos em PBS durante a noite a 4 ° C, lavou-se três vezes para 5 minutos em PBS. Os anticorpos ligados foram visualizados com o Diaminobenzidina reagente de cor (Bios, Beijing, China). As secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer. Dois patologistas sem conhecimento do estado clínico dos pacientes avaliados todos os cortes corados de forma independente. As células foram contadas em alta ampliação em cada caso (× 400), e a percentagem de células coradas positivamente foi calculada. A proporção de células que exibem expressão EL foi classificada como se segue: 0 = menos de 10%; 1 = 11% -50%; 2 = 51% -75%; 3 = mais de 75%. A intensidade da coloração foi classificada pela intensidade relativa como se segue: 0 = negativo; 1 = fraco; 2 = intermédia; 3 = coloração forte. As pontuações proporção e intensidade foi então multiplicado a ter um índice de pontuação total. Por análise estatística, as pontuações mais baixas do que 2 foram considerados negativos, e dezenas de 2 ou superior foram considerados positivos.
Análise estatística
O teste do qui-quadrado eo teste dos postos sinalizados de Wilcoxon foram utilizados para analisar os níveis de EL expressão em o câncer emparelhados e amostras de tecidos não cancerosos. Para analisar a diferença dos níveis de expressão EL nas amostras de soro e urina entre pacientes com câncer gástrico e os controles saudáveis, respectivamente, foi utilizado o teste de Mann-Whitney. O teste do qui-quadrado foi utilizado para avaliar a relação entre os níveis de expressão EL urinário e as variáveis ​​clínico-patológicas. O poder de distinção dos níveis de expressão de EL na urina entre amostras do grupo e controle do câncer foi examinada usando a curva ROC (ROC) e a área sob a curva ROC (AUC). Todos os testes foram bicaudais e um P
-valor < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico GraphPad Prism 5.
Resultados
níveis de expressão EL na urina
Para a análise semi-quantitativa de proteínas na urina, foram utilizados níveis relativos de expressão EL em relação ao do creatinina urinária em cada amostra para normalizar a expressão EL através de amostras de urina diferentes. Observou-se uma clara separação entre os níveis de expressão de EL nas amostras de urina de 90 pacientes com câncer gástrico (1,39 ± 0,68) e de 57 voluntários saudáveis ​​(0,14 ± 0,32). Observou-se uma redução média de aproximadamente 9,9 vezes dos níveis de proteína EL nas amostras de urina de pacientes com câncer gástrico em comparação com controles saudáveis ​​(P Art < 0,0001). Os resultados podem ser vistos na Figura 1A e na Figura 2A. Temos plotado a curva ROC para a precisão da classificação utilizando os níveis de expressão EL em todas estas amostras de urina, para fornecer uma visão geral do poder de discernimento da proteína. Note-se que a AUC fornece um índice largamente aceite para medir a qualidade do classificador subjacente com AUC = 1,0 representando classificação de perfeita e AUC = 0,5 representando nenhuma separação. EL alcançou um valor de AUC de 0,967, com o intervalo de 95% de confiança (IC) sendo [0,942-,993], indicando que a EL urinária pode servir como um biomarcador cancro gástrico altamente promissor para o propósito de diagnóstico (Figura 2B). Figura 1 A análise por Western blot representativo da abundância de proteína EL. pista de controlo positivo (+) continha o produto padrão comercial EL, o qual foi utilizado para normalizar a resposta do sinal em todos os géis. (A), A abundância de proteína El em amostras de urina; (B), SR abundância nas amostras de tecido de câncer e combinando amostras não cancerosas de pacientes com câncer gástrico com nenhum tratamento. A β-actina serve como um controle de carga interna para estimar os níveis de abundância relativa de proteína; (C), a abundância de proteína EL em amostras de soro.
Figura 2 abundâncias de proteína urinária EL em pacientes com câncer gástrico em comparação com controles saudáveis. Cada ponto de dados é um indivíduo. (A), SR abundância em amostras de doentes com cancro gástrico significativamente mais baixos do que em amostras de controlos saudáveis; (B), curvas ROC de proteína EL urinário. O valor AUC foi de 0,967.
Notamos que a banda EL no Western blot estava ausente em amostras de urina de 71 dos 90 pacientes com câncer gástrico e de todos os 57 voluntários saudáveis ​​têm a banda EL em suas amostras de urina. Usando ausência /presença da banda EL como o corte em chamar uma pessoa que tem câncer de estômago ou não, os dados acima dá origem a uma sensibilidade chamando a 79% [IC 95%, 0,690-0,867] e especificidade de 100% [95% CI, 0,937-1,000].
em seguida, examinou os níveis de expressão de EL em amostras de urina dos pacientes com câncer gástrico e sua relação com os vários fatores clínico-patológicos, ou seja, o sexo, a diferenciação histologia, estágio do tumor, invasão, e estado de metástase. Não há relações estatísticas significativas entre os níveis de expressão de EL e qualquer um desses fatores pode ser detectado. A correlação entre os níveis de expressão EL urinário e os fatores clínico-patológicos são apresentados na Tabela 2 2.Table correlação entre a expressão e clínico-patológicas características EL urinário
clínico-patológica (n)
EL ausente (%)

EL presente (%)
P
n = 71
n = 19
Sexo
Masculino (67),
51 (72)
16 (84)
0,27
Feminino, (23)
20 (28) Sims 3 (16)
tipo histológico
alta ou moderada (43),
31 (44)
12 (63)
0,13
Pobre ou indiferenciado, (47)
40 (56)
7 ( 37)
classificação Lauren
intestinal (39),
29 (41)
10 (53)
0,36
difusa, (51)
42 (59)
9 (47)
estágios tumorais
Ι e ΙΙ (31),
22 (31)
9 (47)
0,18
ΙΙΙ e ΙV (59),
49 (69)
10 (53)
profundidade de invasão
T1 e T2, (30)
21 (30)
9 (47)
0,14
T3 e T4, (60)
50 (70)
10 (53)
Nó de status
Ausente, (29)
23 (32)
6 (32)
0,95
Presente, (61)
48 (68)
13 (68)
estatuto Metástase
M0 (71)
55 (77)
16 (84)
0,52
M1 (19)
16 (23) Sims 3 (16)
Temos também verificado se EL é específico para câncer gástrico. Como um esforço inicial, examinamos os níveis de expressão EL em amostras de urina de outros três tipos de câncer (pulmão, cólon e reto cancros) e lesões benignas (gastrite e leiomioma gástrica). O teste foi realizado em amostras de urina de 9 cancro do pulmão, cancro do cólon 10, 10 cancro do recto, 2 gastrite, e 2 pacientes leiomioma gástricas. Claramente, podemos ver que 9 de 9, 9 em cada 10, 10 de 10, 2 de 2, e 2 a 2 amostras têm a banda EL nas amostras de urina de cânceres de pulmão, câncer de cólon, câncer de reto, gastrite e pacientes leiomioma gástricas, respectivamente (Figura 3). Embora este resultado não garante que a falta de EL na urina é um indicador de apenas câncer gástrico, ela sugere fortemente que EL é altamente específico. testes maiores será feito em nosso estudo follow-up, que vai envolver substancialmente mais pacientes de outras doenças, possivelmente relacionados ao câncer gástrico, como o câncer de pâncreas e câncer de esôfago. Figura 3 abundâncias EL em amostras de urina de outros tipos de câncer e lesões benignas. (A), Nove amostras de câncer de pulmão; (B), dez amostras de câncer de cólon; (C), Dez amostras de cancros rectais; (D), em dois gastrite e duas amostras de leiomioma gástricas. (+) A pista de controlo positivo.
Níveis de expressão EL em tecidos e soros
O estudo indica que a proteína EL está ausente em amostras de câncer de urina gástricas. Considerando-se que a urina contém ambas as proteínas segregadas a partir de urotélio, bem como as proteínas do plasma ou a lise de células, que também examinaram os níveis de expressão EL em tecidos ou no soro de doentes com cancro gástrico, com o objectivo de deduzir as razões para esta ausência observada. Western blot foi realizada para medir os níveis de expressão de EL em amostras de tecido de câncer e correspondentes amostras não cancerosas de 12 pacientes com câncer gástrico não tratados (Figura 1B). Não foi observada diferença significativa nos níveis de EL expressão entre as amostras de tecido de câncer gástrico e as amostras não cancerosos correspondentes (teste dos postos sinalizados de Wilcoxon, P
= 0,90).
Em experimentos de coloração imuno-histoquímica, descobrimos que os grânulos marrom apareceu predominantemente no citoplasma (Figura 4). A expressão positiva da proteína EL foi encontrado em 58% (7/12) de cancro gástrico e em 67% (12/08) das amostras não cancerosas adjacentes gástricas (Tabela 3). Não houve diferença nos níveis de expressão desta proteína entre o câncer gástrico e os tecidos não cancerosos correspondentes (teste do qui-quadrado, P
= 0,67). Também examinamos qualquer possível relação entre os níveis de expressão EL e fatores clínico-patológicos potencialmente relevantes mencionados anteriormente. Nenhuma relação foi detectada. Os resultados são apresentados na Tabela 4. A Figura 4 A análise imuno-histoquímica de EL em tecidos de cancro gástrico e correspondentes amostras não cancerosas. Os grânulos castanhos de EL predominantemente apareceu no citoplasma. tecidos adjacentes não cancerosas coradas com (A) (× 400). tecidos de câncer manchada com (B) (× 400).
expressão Tabela 3 EL no câncer gástrico e noncance adjacente amostras Rous
n
A expressão da proteína EL

P
negativo
positiva
controle adjacente
12 página 4 (33%)
8 (67%)
0,67
O câncer gástrico
12
5 (42%)
7 (58%)
Tabela 4 EL expressão e correlação clínica fatores em tecidos de câncer gástrico
clinico-patológica

n
EL
P
negativo
positiva
Sexo Masculino

6 Página 2 4
0,56
Feminino
6 Sims 3 Sims 3
Idade (anos)
≤50 Sims 3
1

• características clínicas e análise de prognóstico da classificação Lauren no adenocarcinoma gástrico em China
• MicroRNA-206 suprime o crescimento celular e câncer gástrico metastasis